王金梅，張 凱，劉凡凡，丁孝良

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院藥學(xué)部,河南 鄭州 450000)

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年升高，且患者呈年輕化趨勢[1-2]。傳統(tǒng)的化學(xué)治療藥物常用于乳腺癌的術(shù)前及術(shù)后輔助治療，具有特異性差、靶向性低、不良反應(yīng)大等問題，因此，尋找安全有效的化學(xué)治療藥物對(duì)乳腺癌的治療具有重要意義[3]。雷帕霉素(rapamycin，RAPA)是一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，同時(shí)也是雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的特異性抑制劑，對(duì)肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[4-6]。RAPA在發(fā)揮抗腫瘤作用時(shí)具有選擇性高、毒副作用小的特點(diǎn)[7]，適合用于抗腫瘤藥物的開發(fā)。脂質(zhì)納米粒作為一種可程控式釋放藥物的給藥系統(tǒng)，在藥物、基因和抗原傳遞領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注[8-9]。本課題組前期制備了載雷帕霉素介孔二氧化硅核-脂質(zhì)納米粒(rapamycin loaded mesoporous silica nanoparticles core-lipid nanoparticles，RAPA-MSN-LN)，并對(duì)其抑制乳腺癌細(xì)胞生長及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用進(jìn)行了研究，但并未深入探究該給藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗乳腺癌作用。因此，本研究建立人乳腺癌細(xì)胞MCF-7荷瘤裸鼠模型，評(píng)價(jià)RAPA-MSN-LN對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，并觀察其對(duì)荷瘤裸鼠主要器官組織的損傷情況，以及其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，以期為RAPA-MSN-LN的臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10只無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)雌性Sprague Dawley(SD)大鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(豫)2015-0004。20只4～6 周齡SPF級(jí)雌性BALB/c裸鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。

1.2 細(xì)胞、試劑與儀器人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購自中國科學(xué)院；雷帕霉素購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，十六烷基三甲基氯化銨(cexadecyl trimethyl ammonium chloride，CATC)購自成都貝斯特試劑有限公司，三乙醇胺(triethanolamine，TEA)、硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate，TEOS)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司，3-氨丙基三甲基氧基硅烷[(3-aminopropyl)trimethoxysilane，APTMS]購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoyl phosphoethanolamine，DOPE)購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，膽固醇購自北京索萊寶生物科技有限公司，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(distearoyl phosphoethanolamine-PEG2000，DSPE-PEG2000)購自美國Corden Pharma公司，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)凋亡檢測試劑盒購自福州飛凈生命科技有限公司，其他試劑均為分析純，緩沖溶液和樣品溶液配制用水均為超純水；AB135-S型分析天平購自瑞士Mettler Toledo公司，WSJB-03恒溫磁力攪拌器購自河南中良科學(xué)儀器有限公司，TDL80-2B型離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠，DZF-6021型真空干燥箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海亞榮生化儀器廠，JEM-1400透射電子顯微鏡購自日本電子株式會(huì)社，Malvern Zetasizer Nano-2000動(dòng)態(tài)光散射粒徑儀購自英國馬爾文儀器有限公司，Waters e2695高效液相色譜儀購自美國Waters公司，Mili-Q超純水系統(tǒng)購自美國Millipore公司，BH-2型熒光顯微鏡購自德國萊卡公司，JY 92-II 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 RAPA-MSN-LN的制備取2 g CATC、20 mg TEA和20 mL超純水置于圓底燒瓶中，超聲溶解后，在80 ℃油浴條件下攪拌20 min，逐滴滴加1.5 mL TEOS，回流反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，12 000 r·min-1離心30 min收集沉淀，使用無水乙醇和去離子水洗滌沉淀，然后將沉淀置于含氯化鈉的甲醇溶液(8 g·L-1)中萃取3次，將最終沉淀真空干燥后得到MSN粉末。參考文獻(xiàn)[10]中的方法，使用APTMS在MSN表面修飾上氨基。將7 mg MSN超聲分散于10 mL無水乙醇中，磁力攪拌下加入冰乙酸(50 μL)，反應(yīng)0.5 h后，逐滴加入APTMS(25 μL)，反應(yīng)1 h，然后12 000 r·min-1離心 5 min 獲得沉淀，將所得沉淀用無水乙醇和去離子水洗滌，真空干燥后得MSN-NH2。

分別稱取一定量的RAPA和MSN-NH2粉末，使藥物載體比例為21，各加入4 mL甲醇超聲分散后混勻，磁力攪拌12 h，12 000 r·min-1離心5 min，分離上清液(用以測定包封率)，所得沉淀為RAPA/MSN納米粒。

分別稱取一定量的DOPE、膽固醇、DSPE-PEG2000(質(zhì)量比為717)至茄型瓶中，加入15 mL氯仿充分溶解后，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式除去氯仿(45 ℃，30 min)。取制備好的RAPA/MSN納米粒，超純水分散后加入茄型瓶中，45 ℃下旋轉(zhuǎn)水合1 h。收集反應(yīng)液并置于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中超聲處理5 min，功率200 W，工作3 s，間隔5 s；所得混懸液即為RAPA-MSN-LN。

1.4 RAPA-MSN-LN的質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.4.1 形態(tài)觀察取適量RAPA-MSN-LN溶液滴在銅網(wǎng)上，使用JEM-1400型透射電子顯微鏡觀察RAPA-MSN-LN的形貌。

1.4.2 粒徑和電位表征取1 mL的RAPA-MSN-LN溶液，加入超純水稀釋3倍后，利用激光粒度分析儀測定納米粒的粒徑及Zeta電位。平行制備3份樣品，測定后取均值。

1.5 RAPA含量和包封率的測定精密稱取5 mg RAPA，以5 mL甲醇為溶劑配制RAPA的儲(chǔ)備液(1 g·L-1)，然后將儲(chǔ)備液稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度：0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、75.0、100.0 mg·L-1。采用高效液相色譜法對(duì)所有樣品進(jìn)行檢測，色譜條件：色譜柱為Symmetry C18 (4.6 mm×250.0 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇水乙腈 = 671815，流速：1.0 mL·min-1，柱溫40 ℃，檢測器為紫外檢測器(L-2489)，檢測波長277 nm，每個(gè)樣品進(jìn)樣20 μL。根據(jù)測定結(jié)果以樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

取“1.3”中所得上清液，測量上清液體積，然后按照上述色譜條件，采用高效液相色譜法對(duì)上清液進(jìn)行檢測，將所得峰面積代入回歸方程計(jì)算上清液中RAPA濃度，再根據(jù)上清液體積，計(jì)算上清液中RAPA含量。上清液中RAPA含量=上清液中RAPA濃度×上清液體積。 最后計(jì)算RAPA的包封率，包封率(%)=(RAPA投入量-上清液中RAPA含量)/RAPA投入量×100%。

1.6 RAPA-MSN-LN在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)檢測

1.6.1 血漿樣品的處理分別取150 mL乙腈和50 mL甲醇，按照體積比31的比例進(jìn)行混合，所得溶液為破乳液。取100 μL大鼠血漿樣品，加入 2 mL 破乳液，充分混勻后，12 000 r·min-1離心20 min，取上清液，室溫條件下通氮?dú)鈸]干，向所得沉淀中加入1 mL甲醇，超聲溶解后，12 000 r·min-1離心20 min，取上清液，采用高效液相色譜法檢測峰面積并計(jì)算血漿中RAPA濃度。

1.6.2 血漿中藥物RAPA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立參考“1.5”項(xiàng)中標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法，配制一系列濃度(0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、75.0、100.0 mg·L-1)RAPA溶液。取各濃度溶液50 μL，分別加入100 μL血漿樣品，充分混勻后，按照“1.6.1”項(xiàng)中方法對(duì)所有樣品進(jìn)行處理，獲得上清液，然后采用高效液相色譜法對(duì)上清液進(jìn)行檢測，以RAPA濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立血漿中藥物RAPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

1.6.3 大鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)檢測將10只SD大鼠隨機(jī)分為RAPA溶液組和RAPA-MSN-LN 溶液組，每組5只。禁食12 h后(飲水充足)，RAPA溶液組大鼠經(jīng)尾靜脈注射2.50 mg·kg-1RAPA溶液，RAPA-MSN-LN 溶液組大鼠經(jīng)尾靜脈注射RAPA-MSN-LN 溶液。RAPA溶液配制方法為：將 50 g·L-1葡萄糖溶液、乙醇、氫化蓖麻油按照體積比為911的比例混合，超聲至完全溶解，然后將5 mg RAPA加入到該混合溶劑中，超聲溶解后即可使用。完成給藥后，分別于10 min和0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h時(shí)取大鼠眼眶后靜脈叢血，取出的血樣置于肝素化EP管中，5 000 r·min-1離心10 min，收集上清即為血漿樣品。取100 μL大鼠血漿樣品，加入2 mL破乳液，充分混勻后，12 000 r·min-1離心 20 min，取上清液，室溫條件下通氮?dú)鈸]干，向所得沉淀中加入1 mL甲醇，超聲溶解后，12 000 r·min-1離心 20 min，取上清液，再按照“1.5”項(xiàng)中色譜條件，采用高效液相色譜法對(duì)上清液進(jìn)行檢測，計(jì)算血漿中RAPA濃度。然后以時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，以血漿中RAPA濃度為縱坐標(biāo)，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線。采用非房室模型、PK Solver 2.0軟件計(jì)算2組大鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(area under the curve，AUC)、半衰期(half-life,t1/2)。

1.7 RAPA-MSN-LN的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

1.7.1 荷瘤裸鼠模型的建立取MCF-7細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液為含有體積分?jǐn)?shù)10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)。取生長狀態(tài)良好的MCF-7細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，磷酸鹽緩沖液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×1010L-1，皮下接種于30只BALB/c裸鼠右前腋窩，每只200 μL。每日觀察注射部位腫瘤生長情況，使用電子游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積，腫瘤體積=0.5×a×b2。

1.7.2 荷瘤裸鼠分組及給藥取腫瘤體積為100～150 mm3荷瘤小鼠20只，隨機(jī)分為生理鹽水組、MSN-LN組、RAPA組和RAPA-MSN-LN組，每組5只。生理鹽水組、MSN-LN組、RAPA組和RAPA-MSN-LN組小鼠分別經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水、MSN-LN、RAPA和RAPA-MSN-LN溶液，隔日給藥1次，共給藥6次，各組小鼠給藥劑量均為2.50 mg·kg-1。每次給藥前，測定各組小鼠的體質(zhì)量，并使用電子游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，計(jì)算小鼠腫瘤體積，繪制動(dòng)物體質(zhì)量隨時(shí)間變化曲線圖以及腫瘤體積變化曲線圖。

1.7.3 病理學(xué)觀察給藥結(jié)束后，采用頸椎脫臼的方式處死荷瘤小鼠，取心、肝、脾、肺、腎、腫瘤等組織，體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定后，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色制成組織切片，在顯微鏡下觀察各組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。使用TUNEL凋亡檢測試劑盒對(duì)腫瘤組織進(jìn)行染色，將制好的組織切片置于顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)及染色情況，并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 RAPA-MSN-LN的質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果見圖1。制備的RAPA-MSN-LN形狀規(guī)則，呈圓形，MSN表面包裹了一層脂質(zhì)薄膜，分散狀態(tài)良好。RAPA-MSN-LN的平均粒徑為(91.27±2.26) nm，多分散性指數(shù)(polymey disperse index，PDI)為0.165 ± 0.024，電位為(-21.60±2.21)mV，包封率為(42.1±2.1)%。

圖1 RAPA-MSN-LN的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron micrograph of RAPA-MSN-LN

2.2 RAPA-MSN-LN在大鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)

2.2.1 血漿中RAPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍結(jié)果見圖2。所得回歸方程為：y=8 477.7x+71 791，R2=0.997 6，表明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線在RAPA濃度為0.167～33.333 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 血漿中RAPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of RAPA in plasma

2.2.2 2組大鼠RAPA血藥濃度比較結(jié)果見圖3。0～5 h內(nèi)，RAPA溶液組大鼠血藥濃度下降較快，6 h時(shí)血藥濃度接近于零；RAPA-MSN-LN溶液組大鼠血藥濃度緩慢降低，血漿中RAPA濃度維持時(shí)間較長。

圖3 2組大鼠RAPA血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.3 Plasma concentration-time curve of RAPA of rats in the two groups

2.2.3 2組大鼠藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)比較結(jié)果見表1。RAPA溶液組大鼠血漿中RAPA的t1/2為(2.31±0.02) h ，AUC為(13.48±0.56) μg·mL-1·h-1；RAPA-MSN-LN溶液組大鼠血漿中RAPA的t1/2為(4.94 ± 0.13) h ，AUC為(73.53±1.24) μg·mL-1·h-1。RAPA-MSN-LN溶液組大鼠血漿中RAPA的t1/2和AUC均高于RAPA溶液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 2組大鼠藥物代謝動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)比較Tab.1 Comparison of pharmacokinetic parameters of rats between the two groups

2.3 RAPA-MSN-LN的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 4組荷瘤小鼠的體質(zhì)量變化結(jié)果見圖4。4組小鼠體質(zhì)量均緩慢增長，無下降現(xiàn)象。

圖4 4組荷瘤小鼠體質(zhì)量變化 Fig.4 Changes of body weight of tumor bearing mice in the four groups

2.3.2 4組荷瘤小鼠腫瘤體積變化結(jié)果見圖5。隨著時(shí)間的延長，生理鹽水組和MSN-LN組小鼠腫瘤生長迅速，腫瘤體積增長較快；RAPA組和RAPA-MSN-LN組小鼠腫瘤生長速度明顯延緩，RAPA-MSN-LN對(duì)小鼠腫瘤的抑制作用最好，從第8天開始，腫瘤增長趨于平緩，最終的腫瘤體積明顯小于其他組。

圖5 4組荷瘤小鼠腫瘤體積變化Fig.5 Changes of tumor volume of tumor bearing mice in the four groups

2.3.3 4組荷瘤小鼠主要器官及腫瘤的組織形態(tài)學(xué)變化結(jié)果見圖6和圖7。HE染色結(jié)果顯示，4組小鼠的主要器官組織結(jié)構(gòu)清晰且無壞死現(xiàn)象。生理鹽水組和MSN-LN組小鼠腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞排列緊密，形態(tài)完整；RAPA組小鼠腫瘤組織出現(xiàn)部分壞死，腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少；RAPA-MSN-LN組小鼠腫瘤組織中壞死區(qū)域最多，核固縮、核溶解現(xiàn)象較明顯。 TUNEL染色結(jié)果顯示，小鼠腫瘤組織中正常細(xì)胞的細(xì)胞核被染為藍(lán)色，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被染成棕褐色。生理鹽水組和MSN-LN組小鼠腫瘤組織中幾乎無凋亡細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)完整；RAPA組小鼠腫瘤組織中出現(xiàn)小范圍的細(xì)胞凋亡；RAPA-MSN-LN組小鼠腫瘤組織中凋亡細(xì)胞數(shù)較多，細(xì)胞核出現(xiàn)消融和萎縮。

A：生理鹽水組；B：MSN-LN組；C：RAPA組；D：RAPA-MSN-LN組。圖6 4組荷瘤小鼠主要器官組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，×200) Fig.6 Histomorphological changes of main organs of tumor bearing mice in the four groups (HE staining，×200)

A：HE染色；B：TUNEL染色。圖7 4組小鼠腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化(×200) Fig.7 Histomorphological changes of tumor tissue of mice in the four groups (×200)

3 討論

本研究采用薄膜分散法制備pH敏感脂質(zhì)薄膜，在薄膜水合過程中加入RAPA/MSN納米粒溶液，通過自組裝制備RAPA-MSN-LN。質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，制備的RAPA-MSN-LN形狀規(guī)則，大小均一，粒徑為(91.27±2.26) nm(PDI= 0.165±0.024)，電位為(-21.6±2.21) mV，包封率為(42.1±2.1)%；這樣的納米粒有利于實(shí)現(xiàn)體內(nèi)藥物遞送[11]。體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，RAPA-MSN-LN的半衰期較RAPA長，表明在一定程度上該納米粒能夠延緩RAPA的釋放。同時(shí)，RAPA-MSN-LN的AUC是RAPA的5.4倍，證明RAPA-MSN-LN的生物利用度較高，能夠使藥物發(fā)揮最大的治療作用。

眾所周知，治療藥物的全身毒性可能導(dǎo)致患者體質(zhì)量減輕[12]。本研究通過觀察治療過程中小鼠體質(zhì)量變化初步評(píng)估不同納米粒的生物安全性，結(jié)果顯示，MSN-LN組、RAPA組和RAPA-MSN-LN組小鼠體質(zhì)量均無下降現(xiàn)象，表明制備的給藥系統(tǒng)對(duì)小鼠無明顯的毒副作用。在12 d的給藥過程中，RAPA-MSN-LN對(duì)小鼠腫瘤的抑制作用最好，這是因?yàn)閷APA載入MSN-LN后，通過實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)，納米粒增加了藥物在腫瘤部位的聚集，從而使納米粒的抗乳腺癌作用增強(qiáng)。MSN-LN組、RAPA組和RAPA-MSN-LN組小鼠的主要器官組織HE染色結(jié)果進(jìn)一步證明了制備的給藥系統(tǒng)生物相容性好[13]，對(duì)小鼠的器官組織未產(chǎn)生任何損傷。腫瘤組織的HE染色及TUNEL凋亡結(jié)果顯示RAPA-MSN-LN能夠引起腫瘤組織壞死并通過誘導(dǎo)凋亡達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。

乳腺癌是我國女性發(fā)病率最高的腫瘤，乳腺癌的防治仍是腫瘤學(xué)的一大難題[14-15]。本研究選擇RAPA作為抗腫瘤藥物，以脂質(zhì)納米粒作為載體，制備了RAPA-MSN-LN，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)、體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究和體內(nèi)抗乳腺癌作用探究，結(jié)果表明制備的RAPA-MSN-LN符合體內(nèi)藥物遞送系統(tǒng)的要求，能夠延緩抗腫瘤藥物的釋放，無明顯毒副作用，對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞的生長具有抑制作用。本研究為RAPA的臨床應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)，為擴(kuò)大化學(xué)治療藥物在乳腺癌治療中的應(yīng)用提供了一個(gè)良好的策略。