肖 嘯 賀麗鵬 趙桂香 耿東士 劉衛(wèi)東 程 芳 田愛(ài)民

(1.中國(guó)石油集團(tuán)安全環(huán)保技術(shù)研究院有限公司；2.中國(guó)石油天然氣股份有限公司勘探開(kāi)發(fā)研究院；3.中國(guó)石油天然氣股份有限公司油田化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.中國(guó)石油長(zhǎng)慶油田分公司西安長(zhǎng)慶化工集團(tuán)有限公司；5.中國(guó)石油華北油田分公司質(zhì)量健康安全環(huán)保部)

0 引 言

油田化學(xué)劑作為貫穿石油生產(chǎn)全過(guò)程的重要產(chǎn)品，其應(yīng)用遍及石油勘探、鉆采、集輸和儲(chǔ)運(yùn)等工藝過(guò)程[1]。隨著環(huán)境保護(hù)法律法規(guī)的日益嚴(yán)格及公眾環(huán)境意識(shí)的增強(qiáng)，油田化學(xué)劑的生物毒性問(wèn)題受到了普遍關(guān)注和重視[2-4]。在油田化學(xué)劑生物毒性測(cè)試方法中，最有影響的是美國(guó)環(huán)保局批準(zhǔn)的糠蝦生物試驗(yàn)法，但在具體的檢測(cè)過(guò)程中存在試驗(yàn)物種糠蝦來(lái)源不便、檢測(cè)準(zhǔn)確性不高、重復(fù)性差、操作過(guò)程復(fù)雜耗時(shí)等問(wèn)題[5-6]。我國(guó)的油田化學(xué)劑生物毒性測(cè)試方法的研究起步較晚，目前主要采用的是發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)法[7-10]。

發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)法基于發(fā)光細(xì)菌相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與化學(xué)品濃度相關(guān)性，利用靈敏的光電測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定化學(xué)品對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響，根據(jù)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度評(píng)價(jià)化學(xué)品毒性大小的方法[11]。發(fā)光細(xì)菌是一類(lèi)非致病的革蘭氏陰性兼性厭氧細(xì)菌，最適生存條件為溫度20～30℃，pH值6～9，礦化度(NaCl濃度)3%～4%。發(fā)光細(xì)菌含有熒光素、熒光酶等發(fā)光要素，當(dāng)細(xì)胞活性升高，處于積極分裂狀態(tài)時(shí)，其發(fā)光要素含量高，發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)。發(fā)光細(xì)菌在毒物作用下，細(xì)胞活性下降，其發(fā)光要素含量水平下降，導(dǎo)致發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的降低，因而可以根據(jù)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度判斷毒物毒性大小，該方法具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、對(duì)有毒物質(zhì)反應(yīng)靈敏、檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn)。本文對(duì)發(fā)光細(xì)菌劑生物毒性評(píng)價(jià)法進(jìn)行了研究，考察了pH值和礦化度對(duì)生物毒性評(píng)價(jià)結(jié)果的影響，并對(duì)常用表面活性劑的生物毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)結(jié)合蛋白質(zhì)含量細(xì)菌生物活性法對(duì)表面活性劑的生物毒性進(jìn)行了分析，以期為油田化學(xué)表面活性劑生物毒性評(píng)價(jià)提供可靠的理論基礎(chǔ)與依據(jù)，同時(shí)也為其他油田化學(xué)劑的生物毒性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

主要儀器：DXY-3型智能化生物毒性測(cè)試儀(中科院南京土壤研究所)；ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)、LDZM型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、BCM-1000型生物凈化工作臺(tái)(浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司)、TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)。

主要試劑：明亮的發(fā)光細(xì)菌T3小種凍干粉(中科院南京土壤研究所)；革蘭氏陰性E.coli菌(中國(guó)石油大學(xué)(華東)生物中心提供)；牛肉浸膏、胰蛋白胨等生化試劑(國(guó)藥)；脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、甜菜堿、十二烷基苯磺酸鈉(國(guó)藥)，分析純；重烷基苯磺酸鹽、石油磺酸鹽(工業(yè)品)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 凍干粉菌劑復(fù)蘇

按照標(biāo)準(zhǔn)[7]所述方法進(jìn)行發(fā)光菌劑復(fù)蘇，菌種復(fù)蘇發(fā)光暗室中肉眼應(yīng)見(jiàn)微光(圖1)，生物毒性測(cè)試儀檢測(cè)發(fā)光量應(yīng)在600 mV以上，否則應(yīng)更換凍干粉。

圖1 發(fā)光菌活化

1.2.2 不同pH值對(duì)發(fā)光細(xì)菌生物毒性測(cè)試的影響

配制不同pH值(pH=2，4，7，10，12)的3%氯化鈉溶液，分別取2 mL加入10 μL復(fù)蘇菌液15 min后測(cè)定各組發(fā)光強(qiáng)度，每個(gè)樣品點(diǎn)設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.2.3 不同礦化度對(duì)發(fā)光細(xì)菌生物毒性測(cè)試的影響

配制不同礦化度氯化鈉溶液(0，3%，4%，8%，15%)，分別取2 mL加入10 μL復(fù)蘇菌液15 min后測(cè)定各組發(fā)光強(qiáng)度，每個(gè)樣品點(diǎn)設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.2.4 利用發(fā)光細(xì)菌評(píng)價(jià)不同表面活性劑的生物毒性實(shí)驗(yàn)

按體積比取1份表面活性劑加入9份3%氯化鈉溶液，混合后靜置60 min后，將此樣品液的濃度定為106mg/L，依次稀釋成不同濃度樣品液(106，105，104，103，102，10，1 mg/L)，未加入表面活性劑的3%氯化鈉溶液為空白對(duì)照組。分別取不同濃度樣品液與對(duì)照組液各2 mL加入10 μL復(fù)蘇菌液15 min后測(cè)定各組發(fā)光強(qiáng)度，每個(gè)樣品點(diǎn)設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.2.5 利用細(xì)菌蛋白質(zhì)含量變化評(píng)價(jià)不同表面活性劑的生物毒性實(shí)驗(yàn)

取1 mL細(xì)菌種子液加入到250 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，向其中加入表面活性劑，配制含不同濃度(0.3，0.6，0.9，1.2 g/L)表面活性劑的溶液。置于37℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)48 h，同時(shí)，以未添加表面活性劑、僅有純種菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照組。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 發(fā)光細(xì)菌生物毒性測(cè)試

以半最大效應(yīng)濃度(EC50)確定樣品的生物毒性等級(jí)[7]。各樣品點(diǎn)加入復(fù)蘇菌液后15 min時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度與對(duì)照組發(fā)光強(qiáng)度相比，計(jì)算得到樣品各濃度水平的相對(duì)發(fā)光度，通過(guò)回歸方程法求出相對(duì)發(fā)光度達(dá)50%時(shí)的樣品濃度(即EC50，mg/L)。

T=E樣品/Eck×100%

(1)

式中：T為相對(duì)發(fā)光度，用百分?jǐn)?shù)表示；E樣品為樣品管的發(fā)光量，mV；Eck為對(duì)照管的發(fā)光量，mV。

1.3.2 細(xì)菌生物活性測(cè)試

采用考馬斯亮藍(lán)法[12]對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。取培養(yǎng)48 h后的菌懸液4 mL于離心管中，離心10 min，倒掉上清液，洗滌兩次后重懸于4 mL的無(wú)菌水中。向洗滌重懸后的菌液中加入0.4 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，將其置于預(yù)先準(zhǔn)備好的(98±2)℃的水浴鍋中，高溫煮沸裂解細(xì)胞。反應(yīng)結(jié)束后取出冷卻至室溫，用移液槍吸取1 mL混合液于試管中，向其中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，振蕩混勻。顯色穩(wěn)定后于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出不同表面活性劑濃度作用下細(xì)菌的蛋白質(zhì)濃度。

蛋白質(zhì)含量相對(duì)值=表面活性劑作用下E.coli菌中蛋白質(zhì)濃度/空白E.coli菌中蛋白質(zhì)濃度

2 結(jié)果與討論

2.1 利用發(fā)光細(xì)菌法評(píng)價(jià)表面活性劑的生物毒性

2.1.1 發(fā)光細(xì)菌法評(píng)價(jià)生物毒性條件優(yōu)化

測(cè)試間隔確定：發(fā)光菌被激活之后，其發(fā)光強(qiáng)度會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而改變，實(shí)際分析時(shí)必須選擇發(fā)光變化率較小的時(shí)刻測(cè)試。從空白樣加菌后發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況來(lái)看(圖2)，發(fā)光菌被激活15 min左右，發(fā)光強(qiáng)度變化趨與平緩，因此應(yīng)選15 min為試樣加菌到測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度的時(shí)間間隔。

圖2 發(fā)光菌發(fā)光強(qiáng)度時(shí)間變化曲線

pH值對(duì)生物毒性的影響：考察了pH值對(duì)生物毒性的影響(表1)，結(jié)果表明，強(qiáng)酸性(pH≤4)或強(qiáng)堿性(pH≥10)條件下，在未加油田化學(xué)劑的情況下，發(fā)光菌的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度發(fā)生大幅度降低，表明強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性對(duì)發(fā)光菌表現(xiàn)出極大毒性。分析其原因，可能是由于強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性可以抑制細(xì)胞活性，細(xì)胞發(fā)光要素含量下降，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的降低?，F(xiàn)有發(fā)光細(xì)菌法評(píng)價(jià)油田化學(xué)劑生物毒性標(biāo)準(zhǔn)[7]中的pH值范圍為6.5～8.5，處于發(fā)光菌的最適生存條件pH值范圍。

表1 pH值對(duì)生物毒性的影響(3%NaCl)

礦化度對(duì)生物毒性的影響：進(jìn)一步考察了礦化度對(duì)生物毒性的影響(表2)，結(jié)果表明，較高的礦化度(NaCl濃度≥8%)條件下發(fā)光菌的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度降低顯著，同樣低礦化度(蒸餾水)也可以明顯降低發(fā)光菌的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度。分析其原因，可能是由于過(guò)高或者過(guò)低的礦化度影響細(xì)胞生長(zhǎng)的滲透壓，影響細(xì)菌的生長(zhǎng)環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)光要素含量下降，進(jìn)而降低發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度?，F(xiàn)有發(fā)光細(xì)菌法評(píng)價(jià)油田化學(xué)劑生物毒性標(biāo)準(zhǔn)[7]中的礦化度值為3%，符合發(fā)光菌的最適生存條件礦化度范圍。

表2 礦化度度對(duì)生物毒性的影響(pH=7)

2.1.2 發(fā)光細(xì)菌法評(píng)價(jià)表面活性劑生物毒性結(jié)果與分析

采用發(fā)光細(xì)菌評(píng)價(jià)法對(duì)油田化學(xué)常用表面活性劑生物毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其中脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚為常用的非離子表面活性劑，甜菜堿為常用的兩性離子表面活性劑，十二烷基苯磺酸鈉、重烷基苯磺酸鹽、石油磺酸鹽為常用的陰離子表面活性劑。上述表面活性劑pH值在6.98～8.42，處于發(fā)光細(xì)菌的最適生存條件范圍(pH值6.5～8.5)。從評(píng)價(jià)結(jié)果來(lái)看(表3)，脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、甜菜堿、十二烷基苯磺酸鈉、重烷基苯磺酸鹽體系的EC50值大于20 000 mg/L，屬于無(wú)毒范圍，而石油磺酸鹽體系的EC50值介于1 000 mg/L與20 000 mg/L之間，屬于微毒范圍。進(jìn)一步分析不同表面活性劑pH值與EC50值之間的關(guān)系，總的來(lái)看，隨著表面活性劑pH值的升高，EC50值有降低趨勢(shì)。

表3 不同表面活性劑生物毒性評(píng)價(jià)結(jié)果

上述結(jié)果表明，發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)是一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的化學(xué)品生物毒性評(píng)價(jià)方法，但在具體的評(píng)價(jià)中，存在以下幾點(diǎn)問(wèn)題：①發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度不僅與化學(xué)品成分及其濃度直接相關(guān)，而且受待測(cè)體系pH值、礦化度等其他因素的影響，特別是用一些酸性、堿性的化學(xué)品直接測(cè)量會(huì)得出高毒性的結(jié)論。當(dāng)油田化學(xué)劑產(chǎn)品體系pH值、礦化度等條件不一致時(shí)，不能簡(jiǎn)單地通過(guò)EC50值來(lái)比較產(chǎn)品的生物毒性大小。如果按照標(biāo)準(zhǔn)方法[7]將體系pH值調(diào)節(jié)到中性，雖然可以避免pH值對(duì)發(fā)光度的影響，但同時(shí)也改變了油田化學(xué)劑產(chǎn)品的成分性質(zhì)，不能真實(shí)的反映產(chǎn)品的生物毒性水平。②發(fā)光菌法得出的無(wú)毒結(jié)論不能推演到其他高等生物，以烷基酚聚氧乙烯醚為例，發(fā)光細(xì)菌法評(píng)價(jià)下表現(xiàn)為無(wú)毒，但根據(jù)歐盟第2003/53/EC號(hào)令，烷基酚聚氧乙烯醚具有急性毒性和對(duì)水生物毒性，對(duì)魚(yú)類(lèi)等毒性很大，對(duì)眼睛和皮膚具有刺激性，同時(shí)表現(xiàn)出明顯的致痛性、致畸性和致變異性。因此要結(jié)合其他毒性檢測(cè)方法甄別化學(xué)品毒性，將真正具有毒性的化學(xué)品排除在使用范圍之外。③發(fā)光細(xì)菌法可以定性的評(píng)價(jià)化學(xué)品毒性，但不能具體反映不同濃度下化學(xué)品毒性大小。理論上來(lái)講同一種化學(xué)品在不同濃度的毒性作用不同，因此建議對(duì)一些表現(xiàn)出微毒或者中毒的的油田化學(xué)劑使用濃度進(jìn)行限制，在沒(méi)有明顯生物毒性的濃度范圍內(nèi)可以正常使用。

2.2 利用細(xì)菌蛋白質(zhì)含量變化評(píng)價(jià)表面活性劑的生物毒性

蛋白質(zhì)是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)各代謝反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)含量的高低影響著細(xì)菌活性程度，蛋白質(zhì)的變化可以間接反映生物的生理狀態(tài)，因此細(xì)菌中的蛋白質(zhì)含量高低可以作為生物毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)[12-13]。采用與發(fā)光細(xì)菌同屬的革蘭氏陰性兼性厭氧細(xì)菌E.coli菌，考察不同表面活性劑作用下E.coli菌中蛋白質(zhì)含量及其變化情況。圖3為不同類(lèi)型表面活性劑對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)含量的影響曲線。在較低濃度條件下(0.3 g/L)，脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、甜菜堿、十二烷基苯磺酸鈉、重烷基苯磺酸鹽作用下的細(xì)菌中蛋白質(zhì)濃度與空白組細(xì)菌中蛋白質(zhì)濃度沒(méi)有明顯變化，其中脂肪醇聚氧乙烯醚、重烷基苯磺酸鹽、十二烷基苯磺酸鈉體系在低濃度條件下總蛋白質(zhì)濃度不但沒(méi)有降低，反而有上升趨勢(shì)，體現(xiàn)出一種超補(bǔ)償機(jī)制[14]，該現(xiàn)象與利用發(fā)光細(xì)菌法檢測(cè)得到無(wú)毒結(jié)果吻合。石油磺酸鹽采用發(fā)光細(xì)菌法檢測(cè)得到微毒結(jié)果，但在相同作用濃度條件下(0.3 g/L)，石油磺酸鹽作用下的細(xì)菌中蛋白質(zhì)濃度與其他表面活性劑沒(méi)有明顯差別，表明石油磺酸鹽本身對(duì)細(xì)菌沒(méi)有生物毒性，石油磺酸鹽利用發(fā)光細(xì)菌法評(píng)價(jià)得到的微毒結(jié)果很可能由其較高的pH值導(dǎo)致。

進(jìn)一步考察了表面活性劑在不同濃度條件下對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4?？偟膩?lái)看，不同表面活性劑在不同濃度下對(duì)細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量的影響趨勢(shì)相同。隨著表面活性劑濃度的升高，蛋白質(zhì)含量總體呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，表明表面活性劑對(duì)細(xì)菌生物毒性具有濃度依賴(lài)性，低濃度表面活性劑對(duì)細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量影響不大，高濃度表面活性劑會(huì)造成細(xì)菌中蛋白質(zhì)活性或結(jié)構(gòu)損傷，從而干擾細(xì)菌的正常生理功能，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)具有抑制作用。因此簡(jiǎn)單的將一種表面活性劑評(píng)價(jià)為有毒或者無(wú)毒并不科學(xué)，需要結(jié)合作用濃度等因素具體考慮。

圖4 表面活性劑濃度對(duì)細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量的影響曲線

通過(guò)考察表面活性劑作用下的細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量的變化情況來(lái)評(píng)價(jià)表面活性劑生物毒性大小，為表面活性劑毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)提供了一種新的方法，特別是對(duì)一些pH值偏大或者偏小的表面活性劑產(chǎn)品，同時(shí)也為其他類(lèi)型的油田化學(xué)劑產(chǎn)品生物毒性評(píng)價(jià)提供了基礎(chǔ)。不同的毒性測(cè)試方法都有適用范圍，加上油田化學(xué)劑成分復(fù)雜，使用環(huán)境多樣，更應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的測(cè)試方法[15]?？偟膩?lái)看，不存在對(duì)所有油田化學(xué)劑都敏感的生物毒性測(cè)試，僅利用單一的毒性測(cè)試方法無(wú)法準(zhǔn)確而全面地反映油田化學(xué)劑的生態(tài)毒性效應(yīng)，應(yīng)綜合多種評(píng)價(jià)方法(如魚(yú)類(lèi)毒性測(cè)試、蚤類(lèi)毒性測(cè)試等)對(duì)油田化學(xué)劑的生物毒性效應(yīng)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為油田化學(xué)劑的綠色可持續(xù)方法提供支持[16-17]。

3 結(jié) 論

1)發(fā)光細(xì)菌法可以快速、簡(jiǎn)便地對(duì)油田化學(xué)表面活性劑的生物毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，但對(duì)體系條件要求嚴(yán)格，pH值與礦化度等對(duì)評(píng)價(jià)結(jié)果影響明顯。

2)細(xì)菌的生物活性(蛋白質(zhì)含量)受油田化學(xué)表面活性劑濃度的影響明顯，可以通過(guò)細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量的變化情況評(píng)價(jià)生物毒性大小。

3)單一的細(xì)菌評(píng)價(jià)試驗(yàn)無(wú)法全面準(zhǔn)確判斷油田化學(xué)劑的生物毒性效應(yīng)，應(yīng)結(jié)合多種評(píng)價(jià)方法對(duì)油田化學(xué)劑的毒性效應(yīng)進(jìn)行綜合分析判斷。