董 萌，解振興，施龍清，連 玲，張居念，姜照偉，吳春珠

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，福建福州350018）

內(nèi)生固氮菌是指定殖在植物體內(nèi)且具有聯(lián)合固氮能力的固氮菌。20世紀(jì)60年代，從巴西甘蔗莖內(nèi)首次分離到內(nèi)生固氮菌，并證明其可為甘蔗生長提供所需的氮素。在玉米、小麥、高粱、水稻等禾本科植物體內(nèi)也分離到多種內(nèi)生固氮菌。從云南水稻品種楚粳27的根、莖和葉中分離到125株內(nèi)生固氮菌，15株可以擴(kuò)增出固氮酶基因nifH片段，11株對5種病原菌具有抑制作用，其中3株兼具固氮功能和抑菌作用［1］。在野生稻內(nèi)發(fā)現(xiàn)的固氮菌至少有31個屬74個種，具有豐富的遺傳多樣性［2］，在高稈野生稻中分離到43株內(nèi)生固氮菌，并利用IS-PCR指紋圖譜監(jiān)測分析，這些內(nèi)生固氮菌屬于6個不同的類群［3］。從栽培稻品種的根、莖和葉內(nèi)分離到376個菌株，其中234個具有固氮酶活性，通過菌液蘸根和噴霧接種，2個固氮酶活性較強(qiáng)的菌株均能促進(jìn)水稻幼苗生長［4］。

水稻是中國重要的糧食作物。近幾年再生稻種植面積不斷擴(kuò)大，已成為一季有余而雙季不足稻區(qū)的重要種植方式。再生稻種植1次，收獲2次，生命周期延長，再生季根系活力強(qiáng)是保證再生季穩(wěn)產(chǎn)的基礎(chǔ)［5］。根系微生物可以提高植物耐脅迫能力，促進(jìn)水稻氮吸收利用率［6,7］。甬優(yōu)2640與佳輻占是適于作再生稻種植的品種，甬優(yōu)2640屬于秈粳交，佳輻占屬于早秈稻，兩者在形態(tài)特征、再生季出芽方式上存在顯著差異。本研究對2個品種不同生育期根系內(nèi)生固氮菌群多樣性進(jìn)行分析，對2種基因型水稻根系內(nèi)生固氮菌群進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1.1 植物材料與種植

供試水稻品種為佳輻占與甬優(yōu)2640，種植于福州福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所農(nóng)場（119.366 E，26.013 N），播種時間為2019年3月中旬，采用人工插秧方式，育秧30 d后插秧，分別在佳輻占與甬優(yōu)2640頭季的幼苗期、分蘗盛期、拔節(jié)期、抽穗期和成熟期，再生季收割后13 d（再生季抽穗期）、25 d（再生季齊穂期）、60 d（再生季成熟期）取樣。每個品種設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)12 m2，并設(shè)置保護(hù)行，每個重復(fù)取3株混樣，共計48個樣品。再生季采用高留樁處理，留樁高度30 cm。頭季齊穗后18 d每667m2施促芽肥尿素7.5 kg，收獲后3 d施壯苗肥尿素5 kg，再生季齊穗期施穗肥尿素7.5 kg。 收獲后如遇土壤過干，則當(dāng)天灌水，保持淺水層。

1.2 樣品采集

在移栽后7 d取根，作為幼苗期樣品，其他按再生稻生長發(fā)育時期取樣（地下10 cm深度根系）。先用流水沖洗表面泥土，加入裝有75%酒精的50 mL離心管中并在搖床180 r/min震蕩清洗3次，然后用無菌水洗滌3～5次，接著放入20 g/L的次氯酸鈉溶液中消毒10 min，無菌水沖洗3～5次。并用無菌紙吸干水分，放入-80℃保存。

1.3 nifH基因文庫構(gòu)建和測序

提取樣品DNA，并用Nanodrop對DNA進(jìn)行定量并統(tǒng)一稀釋，使用引物nifH-F（ACCCGCCTGATCCTGCACGCCAAGG） 和nifH-R（ACGATGTAGATTTCCTGGGCCTTGTT）對內(nèi)生固氮菌固氮酶鐵蛋白nifH基因進(jìn)行聚合美鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增采用全式金公司的Pfu高保真DNA聚合酶，并設(shè)置陰性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠（Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads）純化回收，并對回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量儀器為Microplate reader（BioTek，F(xiàn)Lx800）。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)上對文庫進(jìn)行定量，并使用Illumina Miseq/NovaSeq測序平臺進(jìn)行雙端測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

所有測序獲得的nifH基因擴(kuò)增子數(shù)據(jù)首先通過質(zhì)量初篩去除barcode序列。通過qiime dada2 denoise-paired調(diào)用DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體。運用R3.5.1對所得的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并利用USEARCH進(jìn)行α多樣性和β多樣性的參數(shù)統(tǒng)計分析。在α多樣性分析中，利用Anova法進(jìn)行整體差異分析、利用t檢驗方法進(jìn)行組間差異分析；在β多樣性研究中，基于Binary Jaccard算法進(jìn)行NMDS分析；利用維恩（Venn）圖展示不同生長環(huán)境間共有、特有的內(nèi)生固氮菌OTU數(shù)目，直觀地表現(xiàn)出樣品間OTU的重合情況；用LEfSe ［Line DiscriminantAnalysis（LDA）Effect Size］分析尋找不同生長環(huán)境中的差異內(nèi)生固氮菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種對再生稻根系內(nèi)生固氮菌多樣性影響

從48個樣品中通過高通量測序獲得了12 604 306條高質(zhì)量序列，平均每個樣品262 590條，最少的只有168 298條，最多的有683 003條。用DADA2對高質(zhì)量序列進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，如圖1A所示，佳輻占與甬優(yōu)2640總共獲得15 942個OTUs，其中甬優(yōu)2640鑒定到12 534個OTUs，佳輻占鑒定到10 388個OTUs，佳輻占與甬優(yōu)2640共有6 980個OTUs，占總數(shù)的43.78%。從圖1B中可以發(fā)現(xiàn)，在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）是甬優(yōu)2640、佳輻占和甬優(yōu)2640-佳輻占共有OTUs中最多的門。從圖1C可以發(fā)現(xiàn)，在甬優(yōu)2640與佳輻占根系內(nèi)慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、固氮螺菌屬（Azospirillum）、脫磷弧菌屬（Desulfovibrio）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）和固氮細(xì)菌（Azotobacter）是富集最多的內(nèi)生固氮菌屬，其中慢生根瘤菌屬是優(yōu)勢菌屬。

圖1 甬優(yōu)2640與佳輻占根系內(nèi)生固氮菌OTUs數(shù)

為了比較佳輻占與甬優(yōu)2640根系內(nèi)生固氮菌的豐富度、多樣性和覆蓋度，利用α多樣性指數(shù)中的Chao1、Simpson和Shannon指數(shù)進(jìn)行比較分析。由圖2可以看出，佳輻占與甬優(yōu)2640的Chao1、Simpson和Shannon指數(shù)均達(dá)到顯著差異水平（p<0.5）。

圖2 甬優(yōu)2640與佳輻占根系內(nèi)生固氮菌α多樣性指數(shù)

2.2 不同生育期對再生稻根系內(nèi)生固氮菌多樣性影響

對甬優(yōu)2640和佳輻占不同生育期根系內(nèi)生固氮菌群進(jìn)行分析，由圖3A可見，慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、固氮螺菌屬（Azospirillum）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、甲基孢囊菌屬（Methylocystis）和弗蘭克氏菌屬（Frankia），其慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和固氮螺菌屬（Azospirillum）在再生稻的不同生育期都是優(yōu)勢菌屬。在再生稻頭季的齊穗期和成熟期內(nèi)生固氮菌相對豐度最高，在再生季收割后25 d內(nèi)生固氮菌群相對豐度達(dá)到最高，然后再生季成熟期相對豐度降低。

我們利用Jaccard距離來計算不同生育期內(nèi)生固氮菌群的β-多樣性，非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling, NMDS）通過對樣本距離進(jìn)行等級排序。由圖3B可以看出，甬優(yōu)2640與佳輻占在不同生育期內(nèi)生固氮菌群沿MDS1排列，從圖中可以看出隨著水稻生育期的變化，內(nèi)生固氮菌群多樣性發(fā)生變化，進(jìn)一步表明隨著水稻生長發(fā)育，根系內(nèi)的內(nèi)生固氮菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著差異（Stress=0.147）。

圖3 不同生育期根系內(nèi)生固氮菌多樣性

為了進(jìn)一步比較水稻不同生育期內(nèi)生固氮菌群的物種組成差異，使用屬水平單元作為分析對象，對平均豐度前50位的屬進(jìn)行熱土繪制（圖4）。如圖4所示，隨著水稻生育期變化，根系內(nèi)生固氮菌群豐度發(fā)生變化，在苗期以Methylomonas、Pseudomonas、Enterobacter、Azovibrio、Pelomonas、Xanthobacter、Pseudacidovorax、Dechloromonas、Rhizobium、Zoogloea、Azonexus、Ralstonia、Rhodopseudomonas屬富集最多，分蘗期以Desulfobulbus、Azohydromonas、Arthrobacter、Aquaspirillum、Anaeromyxobacter、Azotobacter、Magnetospirillum、Pseudodesulfovibrio、Syntrophobacter、Vitreoscilla、Sideroxydans屬富集最多，而內(nèi)生固氮菌多樣性對豐富的齊穗期以Methylomusa、Methylosinus、Azospira、Halomonas、Klebsiella屬富集最多，成熟期以Pleomorphomonas、Methylocystis屬富集最多，頭季收割后富集的內(nèi)生固氮菌群也發(fā)生了變化，與再生稻頭季齊穗期與成熟期富集的內(nèi)生固氮菌群不同。

圖4 不同生育期內(nèi)生固氮菌群熱圖

2.3 根系內(nèi)生固氮菌群微生物標(biāo)志物

根據(jù)線性判別分析效應(yīng)量（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）計算再生稻不同生育期根系內(nèi)生固氮菌群為生物標(biāo)志物，并將其在分類學(xué)分支圖上的位置進(jìn)行標(biāo)記（圖5A）。由圖5可見，再生稻頭季苗期有8個類群，分別為變形菌門、紅環(huán)菌目（Rhodocyclales）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）、γ- 變形菌綱（Gammaproteobacteria）、脫氯單胞菌屬（Dechloromonas）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）、假單胞菌目（Pseudomonadales）和假單胞菌科（Pseudomonadaceae），頭季分蘗期有2個根瘤菌科（Rhizobiaceae）和假脫硫弧菌屬（Pseudodesulfovibrio），頭季拔節(jié)期2個分別為固氮螺菌屬（Azospirillum）和紅螺菌目（Rhodospirillales），頭季齊穗期2個分別為中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）和甲基彎曲菌屬（Methylosinus），頭季成熟期2個分別為慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和多形單胞菌屬（Pleomorphomonas），頭季收割后13 d只有一個，是伯克氏菌科（Burkholderiaceae），頭季收割后25 d有3個分別為放線菌門（Actinobacteria）、地桿菌屬（Geobacter）和帕拉伯克霍爾德屬（Paraburkholderia），頭季收割后60 d有4個，分別為α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、根瘤菌目（Rhizobiales）、Pseudolabrys屬和Zoogloeaceae屬。

圖5 再生稻不同生育期根系微生物組線性判別分析效應(yīng)量

3 討論

植物內(nèi)生固氮菌自首次從甘蔗中發(fā)現(xiàn)以來，研究人員對于水稻的內(nèi)生固氮菌也進(jìn)行了研究，在水稻栽培品種中分離并鑒定了內(nèi)生固氮菌，并研究了黃酮類化合物和生長素對內(nèi)生固氮菌在水稻中定殖的影響，并通過DNA指紋圖譜分析劃分為多個類群［8，9］。在普通野生稻中，分離到37株內(nèi)生固氮菌，并通過16S rRNA將這些內(nèi)生固氮菌分為多個類群，表明普通野生稻內(nèi)生固氮菌具有較大多樣性，且具有高固氮酶活性，能明顯促進(jìn)水稻生長［10］。本研究對甬優(yōu)2640與佳輻占2個再生稻品種不同生育期根系內(nèi)生固氮菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)甬優(yōu)2640與佳輻占內(nèi)生固氮菌以慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）與固氮螺菌屬（Azospirillum）為優(yōu)勢菌群，都屬于α-變形菌綱，與野生稻的內(nèi)生固氮菌群存在差異。佳輻占與甬優(yōu)2640兩個水稻品種的基因型差異較大，內(nèi)生固氮菌多樣性也存在較大差異，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致［11,12］。

在甬優(yōu)2640與佳輻占不同生育期根系的內(nèi)生固氮菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生固氮菌群多樣性隨著水稻生長發(fā)育發(fā)生變化，與前人研究結(jié)果一致，在水稻生長發(fā)育過程中根系微生物菌群多樣性會發(fā)生動態(tài)變化［11-13］。本研究以再生稻為研究材料，發(fā)現(xiàn)慢生根瘤菌在再生稻的不同生育期相對豐度最高，前人研究也從水稻中分離到慢生根瘤菌株，且泰國慢生根瘤菌群比日本慢生根瘤菌群更能促進(jìn)泰國水稻品種的生長［14，15］。通過對不同生育期內(nèi)生固氮菌群進(jìn)行線性判別分析效應(yīng)量分析，鑒定出不同生育期的標(biāo)志微生物，這些微生物的變化可能與水稻生長發(fā)育等生命活動相關(guān)。因此，深入挖掘不同生育期內(nèi)生固氮菌群的潛在功能，進(jìn)而探究再生稻根系不同生育期的內(nèi)生固氮菌群如何作用于水稻生長發(fā)育進(jìn)而產(chǎn)生調(diào)控作用。本研究結(jié)果反映了再生稻不同品種及不同生育期根系內(nèi)生固氮菌群多樣性差異，為減少水稻化肥施用和水稻菌肥發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。