李振興, 趙金龍

(中國海洋大學 食品科學與工程學院, 山東 青島 266003)

甲殼類水產(chǎn)品,主要包括蝦、龍蝦和螃蟹,在人類營養(yǎng)中起著至關重要的作用,含有多種優(yōu)質(zhì)蛋白和營養(yǎng)物質(zhì),也是多不飽和脂肪酸和維生素的豐富來源[1-2]。 據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)于2020年發(fā)布的《世界漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖報告》數(shù)據(jù),2018年全球每年直接消費甲殼類水產(chǎn)品超過93.87萬t,其中南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)消費量占比高達52.9%。 甲殼類水產(chǎn)品除直接烹食外,還可用做加工原料,制成如調(diào)味品、休閑食品等甲殼類加工食品。 甲殼類水產(chǎn)品、甲殼類加工食品等甲殼類食品是FAO 認定的8 大類主要致敏食品之一。微量的甲殼類食品成分就可以誘發(fā)嚴重的過敏反應,不僅阻礙了甲殼類食品過敏患者對味道鮮美、營養(yǎng)豐富的甲殼類食品的攝入,而且對潛在過敏人群存在嚴重的安全隱患,已經(jīng)成為一個嚴重的全球公共衛(wèi)生問題[2-3]。

甲殼類食品過敏問題一直備受關注。 隨著甲殼類食品消費的增加,其致敏率也越來越高,目前全世界高達2.5% 的人群遭受甲殼類食品過敏的痛苦[2]。 甲殼類食品過敏主要為IgE 介導的I 型超敏反應,是在外源甲殼類食品過敏物質(zhì)的激發(fā)下,產(chǎn)生足夠量的IgE 抗體,并與肥大細胞或嗜堿粒細胞上的高親和力受體結合,進一步誘導肥大細胞或嗜堿性粒細胞脫釋放致敏介質(zhì),而引發(fā)機體產(chǎn)生一系列生理功能紊亂[4-5]。 與牛奶和雞蛋等其他食物過敏不同,甲殼類食品過敏主要流行于成年人群中,并可能伴隨一生。 甲殼類食品過敏可誘發(fā)過敏患者出現(xiàn)皮膚紅腫、瘙癢、皮疹、蕁麻疹和血管性水腫等皮膚癥狀,以及惡心、嘔吐、 腹痛和痙攣等胃腸道反應[3]。

由于食物致敏機理的復雜性,目前在臨床上尚沒有安全有效根治食物過敏的手段,嚴格規(guī)避含有甲殼類食品致敏成分是當前最有效的防治措施。 為了全面保障甲殼類食品的食用安全,除了必要的標簽標示管理之外,國內(nèi)外研究者針對甲殼類食品的過敏原及其消減技術展開了一系列的研究,致力于開發(fā)低致敏性或脫敏甲殼類食品,保障甲殼類食品過敏人群的安全。 本文闡述了目前國內(nèi)外有關甲殼類食品主要過敏原及其致敏性消減技術的研究現(xiàn)狀,以期為甲殼類食品過敏的預防與控制提供理論指導。

1 甲殼類水產(chǎn)品過敏原

大部分甲殼類水產(chǎn)品過敏原主要存在于可食用肌肉部分,它們的生理功能是參與肌肉運動和能量代謝。 隨著蛋白質(zhì)鑒定和過敏原定性技術的發(fā)展,一些甲殼類水產(chǎn)品的過敏原已經(jīng)被陸續(xù)鑒定。 目前,國內(nèi)外學者已從甲殼類水產(chǎn)品中鑒定出10 余種過敏原組分,其中主要過敏原蛋白為原肌球蛋白(tropomyosin,TM),其次是精氨酸激酶(arginine,AK)、肌質(zhì)鈣結合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)、肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)、磷酸丙糖異構酶蛋白(triosephosphate isomerase,TPI)、肌鈣蛋白C(troponin C,TnC)和血藍蛋白(hemocyanin,HC)等[5],見圖1。

1.1 原肌球蛋白

TM 是人和動物肌肉收縮過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白,在脊椎動物和無脊椎動物中均廣泛存在；它在細肌絲中與肌動蛋白雙螺旋并行存在,參與完成體內(nèi)多種生命活動。 然而,甲殼類水產(chǎn)品肌肉組織中的TM 被認為是所有可食用甲殼類水產(chǎn)品中的主要無脊椎動物泛過敏原,可與72% ～98%的甲殼類食品過敏患者血清產(chǎn)生特異性IgE 結合[5]。 自1981年,TM 首次被鑒定為褐蝦(Penaeus aztecus)的一種過敏原[6],隨后TM 在斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)[7]、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)[8]、雪蟹(Chinopecetes opilio)[9]等水產(chǎn)品中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。 TM 結構和理化性質(zhì)也相繼被鑒定,研究發(fā)現(xiàn)TM 是一類非常保守的高度穩(wěn)定的同源二聚體蛋白,由284 個氨基酸組成,分子質(zhì)量分布在32 ～38 kDa,等電點約為4.2[3,10]。 TM 是由兩個相同的α-螺旋構型的多肽鏈相互纏繞而形成的超螺旋結構[圖1(a)],這種形式的二級和三級結構賦予了TM 結構的穩(wěn)定性,因此它能夠耐受高溫和高壓加工條件,并保持其致敏性[11-12]。

圖1 甲殼類水產(chǎn)品主要過敏原的三維結構Fig.1 Three-dimensional structure of mainly crustacean allergens

除此之外,已有研究報道TM 同時也是蟑螂、塵螨和軟體貝類的主要過敏原,因此TM 具有一定的交叉反應性。 TM 高度保守的氨基酸序列是交叉反應的主要原因[5]。 甲殼類水產(chǎn)品的TM 在其物種之間表現(xiàn)出高度的保守性和氨基酸序列的一致性,序列相似性為88% ～100%。 由于近的起源關系,甲殼類水產(chǎn)品的TM 與蟑螂和塵螨有很高的序列一致性,分別為80% ～97%和78% ～98%。 在對塵螨或蟑螂過敏的人群中,證明了對蝦過敏的IgE 反應性。值得注意的是,甲殼動物的TM 與軟體動物的TM(55% ～65%)以及脊椎動物的TM(54% ～60%)有較低的序列一致性[5,10]。

1.2 精氨酸激酶

AK 是一種廣泛存在于無脊椎動物體內(nèi)的磷酸原激酶,是無脊椎動物能量代謝中的一種重要酶,參與調(diào)節(jié)細胞ATP 水平。 AK 被鑒定為甲殼類水產(chǎn)品中僅次于TM 的一種重要過敏原。 對AK 血清特應性結合研究發(fā)現(xiàn),10% ～51%的蝦過敏患者血清會出現(xiàn)特異性IgE 反應。 自Yu 等[13]首次從黑虎蝦(Penaeus monodon)鑒定AK 為一種甲殼類過敏原,相繼發(fā)現(xiàn)AK 也是北海褐蝦(Crangon crangon)[14]、南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)[15]、勇士棕蟹(Callinectes bellicosus)[16-17]、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)[18]和羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)[19]等多個甲殼類物種中的特異性致敏成分。 其中,南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)[20]、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)[21]等甲殼類水產(chǎn)品中AK 的晶體結構也已經(jīng)通過X-射線衍射及核磁的手段被解析。 研究發(fā)現(xiàn),AK 由359 個氨基酸殘基組成,分子質(zhì)量為38 ～45 kDa,等電點為6.0,其蛋白三維結構包含一個N 端的α 螺旋結構域和一個C 端的αβ 結構域[圖1(b)][13]。 AK 廣泛存在于各種甲殼類水產(chǎn)品中,具有較強的交叉反應性。 與TM 一樣,AK 也被認定為一種無脊椎動物的泛過敏原。 對軟體動物章魚、蝦和蟹等甲殼類水產(chǎn)品中AK 一級序列的同源性比對發(fā)現(xiàn),他們之間的序列同源性高達54%。 此外,結構預測發(fā)現(xiàn)他們的三級結構也高度相似。

1.3 肌質(zhì)鈣結合蛋白

SCP 屬于EF hand 鈣結合蛋白家族,含有特征的helix-loop-helix 的Ca2+結合域,其主要位無脊椎動物肌肉和神經(jīng)組織中,在無脊椎動物體內(nèi)調(diào)節(jié)肌肉收縮中發(fā)揮著重要的作用[圖1(c)]。 同時,SCP也被鑒定為甲殼類水產(chǎn)品的另一種過敏原,其分子質(zhì)量約為20 kDa,等電點約為4.6。 2008年,Shiomi等[22]首次通過陰離子交換色譜結合反相高效液相色譜法從斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)中純化出SCP蛋白,并通過蝦過敏患者血清與斑節(jié)對蝦SCP 免疫反應發(fā)現(xiàn),8/16(50%)的蝦過敏血清與SCP 有特異性IgE 反應。 隨后,國內(nèi)外研究者分別在北海褐蝦(Crangon crangon)[14]、南美白對蝦(Litopenaeus van-namei)[4]、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)[23]中也分別檢測到SCP。 值得注意的是,Ayuso 等[4]發(fā)現(xiàn)南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)SCP 對17/20 例(85%)蝦過敏兒童血清具有特異性IgE 結合活性,證明SCP 可能是導致兒童出現(xiàn)蝦過敏疾病的主要過敏原。

此外,研究發(fā)現(xiàn)SCP 在同一物種或相似的物種中具有顯著的氨基酸序列同源性,且具有較強的交叉反應性,然而不同物種之間氨基酸序列差異性較為顯著。 如在甲殼類水產(chǎn)品中的SCP 序列相似性為80% ～98%,然而甲殼類水產(chǎn)品和軟體類水產(chǎn)品之間的氨基酸序列同源性則僅有15% ～21%[2]。 SCP 是熱穩(wěn)定的鈣結合蛋白,且具有較強的酸堿穩(wěn)定性(在pH 值1 ～11 穩(wěn)定),包含4 個EF hand 結構域,其中2 個或3 個保留了只結合Ca2+或混合Ca2+和Mg2+的能力[2,5],其中Ca2+對SCP 構象和IgE 活性的維持扮演著重要作用。 SCP是一類有3 個亞基(SCP-Ⅰ、SCP-Ⅱ和SCP-Ⅲ)的過敏原,且所有這些異構體都顯示出IgE 結合能力[2]。

1.4 肌球蛋白輕鏈

MLC 是肌球蛋白大分子復合物的一部分,構成功能型肌肉蛋白結構,MLC 在肌肉收縮中起著重要的作用,因為它的磷酸化會在收縮過程中影響肌動蛋白-肌球蛋白復合物[2,5]。 MLC 屬于結合蛋白樣蛋白家族,通過EF hand 結構域結合Ca2+,且具有較強的熱和極端pH 值下的穩(wěn)定性[圖1(d)]。MLC 首先被Ayuso 等[24]確定為南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)的過敏原,并將其命名為Lit v 3,后來又在斑節(jié)蝦(Penaeus monodon)[25]、美國螯龍蝦(Homarus americanus)[26]、 北 海 褐 蝦(Crangon crangon)[14]和擬穴青蟹(Scylla paramamosain)[27]中被再次確認。 到目前為止,一些MLC 已被確定為各種甲殼類水產(chǎn)品的過敏原,對MLC 呈現(xiàn)致敏性的甲殼類過敏患者從19% ～55%不等。 血清IgE 結合研究表明:與兒童相比,成人對MLC 的識別率更高,但目前關于MLC 在甲殼類水產(chǎn)品或其他物種之間的免疫學交叉反應的數(shù)據(jù)仍然缺乏。

1.5 磷酸丙糖異構酶

TPI 是一種廣泛存在于甲殼類水產(chǎn)品中的酶蛋白,分子質(zhì)量在26 ～29 kDa,耐熱性差,但耐酸堿性強。 天然狀態(tài)TPI 主要以二聚體的形式存在,其主要功能是參與葡萄糖能量代謝[5][圖1(e)]。 到目前為止,TPI 已在斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)[28]、北海褐蝦(Crangon crangon)[29]和擬穴青蟹(Scylla paramamosain)[14]中被鑒定為過敏原。 TPI 被認為是一種次要的過敏原,蝦過敏血清IgE 結合測試發(fā)現(xiàn)特異性結合率在15% ～23%。 此外,除甲殼類水產(chǎn)品外,TIM 也在某些軟體、蟑螂和植物中被鑒定為過敏原,但尚未對這些物種之間由TIM 導致的交叉反應性進行詳細研究[5]。

1.6 血藍蛋白

HC 主要位于節(jié)肢動物和軟體動物類的頭胸部,在動物呼吸及多種生理活動中扮演關鍵作用。天然狀態(tài)下,HC 是以6 個高度螺旋異源亞基構成的六聚體[圖1(f)],且其亞基的數(shù)量具有物種特異性,亞基分子質(zhì)量為72 kDa 或75 kDa,具有良好熱穩(wěn)定性和耐胰酶消化特性[2]。 在2011年,HC 首次被鑒定為羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)的過敏原[30]。 Piboonpocanun 等[30]經(jīng)離子交換色譜從羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)中提取純化獲得兩個高分子質(zhì)量的蛋白亞基(72 kDa 和75 kDa),經(jīng)LC-MS/MS 鑒定為HC,通過蝦過敏血清IgE 測試試驗發(fā)現(xiàn)其具有顯著的特異性IgE 反應。 蛋白序列比對發(fā)現(xiàn),72 kDa 和75 kDa 的兩個蛋白亞基與其他甲殼類水產(chǎn)品的HC 序列同源性在62.5% ～100%。同時,此項研究也顯示在未處理和煮處理后的HC提取物中均檢測到了一定的IgE 結合活性,表明HC是又一類甲殼類熱穩(wěn)定的過敏原。 不同的是,Guillen 等[31]通過血清IgE 反應性發(fā)現(xiàn)只在未處理的蝦提取物中發(fā)現(xiàn)了IgE 結合,煮處理的蝦提取物IgE 活性完全喪失,可能這種蛋白質(zhì)只是在某種程度上具有熱穩(wěn)定性,還需要進行更多的研究來證實這個問題。 此外,Guillen 等[31]報道了3 位在攝入南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)后出現(xiàn)過敏性休克的患者,血清IgE 測試發(fā)現(xiàn)均與血藍蛋白有較強IgE反應,這也是第一例在南美白對蝦中發(fā)現(xiàn)HC 為過敏原的報告。

1.7 其他過敏原成分

除了常見甲殼類過敏原以外,隨著國內(nèi)外學者對食物過敏研究的重視,越來越多過敏成分陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。 Lee 等[32]發(fā)現(xiàn)在未處理和蒸處理的南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)提取物中一個63 kDa 的蛋白條帶可與4/7 名蝦過敏患者的血清發(fā)生特異性結合反應,隨后該蛋白通過蛋白質(zhì)組學質(zhì)譜法被鑒定為丙酮酸激酶。 Yang 等[29]發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦(Pro-cambarus clarkii)肌肉提取物中90 kDa 蛋白具有高的IgE 結合活性,進一步采用硫酸銨分步沉淀及陰離子交換柱層析,提取純化并鑒定其為新型過敏原細絲蛋白C(filamin C)。 此外,在甲殼類水產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的肌球蛋白重鏈、α-肌動蛋白、平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP 酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶也被鑒定為過敏原[2,5]。 然而,它們的分子結構特征和致敏潛力還需要進一步研究。 隨著分子生物學和免疫學技術的不斷發(fā)展,對甲殼類水產(chǎn)品過敏原成分的研究一定會更加深入。

由研究報道可知,甲殼類水產(chǎn)品主要過敏原見表1[4,7-8,13-19,22-30,33-43]。

表1 甲殼類水產(chǎn)品過敏原Tab.1 Allergens of crustacean aquatic products

2 甲殼類水產(chǎn)品過敏原致敏性消減技術

甲殼類過敏原主要是水溶性糖蛋白,分子質(zhì)量為10 ～70 kDa,對常規(guī)加熱和酸處理具有一定耐受性。 過敏原的免疫活性主要取決于其抗原表位的保留和IgG 或IgE 的識別。 研究表明:熱加工和非熱加工技術可能會導致蛋白的變性、聚集、交聯(lián)、氧化和糖基化等從而掩蓋或破壞過敏原抗原表位,進而改變食品過敏原致敏性[1-2]。 近年來,國內(nèi)外研究者系統(tǒng)探究了不同的加工方法對甲殼水產(chǎn)品過敏原致敏性的影響,以期制備低敏或無敏甲殼類食品。根據(jù)原理的不同,可將這些手段分為物理加工消減技術、化學修飾消減技術和生物修飾消減技術。 表2 總結了目前常見加工技術類型及其對甲殼類水產(chǎn)品過敏原免疫反應性的影響[11-12,33,44-62]。

表2 不同甲殼類水產(chǎn)品過敏原致敏性消減技術Tab.2 Summary of different processing technologies for mitigating crustacean allergenicity

2.1 物理加工消減技術

物理加工是目前應用最廣泛的食品加工方式,包括熱處理、高壓處理、超聲處理、微波處理和低溫等離子體處理等。

2.1.1 熱處理消減

傳統(tǒng)熱處理是最常用的物理處理方式,且熱處理的方式較多,如煮處理、蒸處理、高壓蒸汽處理和微波處理等。 一般來說,食品的熱處理過程伴隨著不同的修飾反應,如蛋白變性、肽鍵的破壞、二硫鍵的重排以及與其他成分包括碳水化合物和脂類的相互作用[2,44]。 Kamath 等[44]發(fā)現(xiàn)煮處理的甲殼類(蝦、龍蝦和螃蟹)過敏原提取物中僅有兩個主要過敏原組分,分別為TM 和SCP,且免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)煮處理的TM 具有更高的IgG結合能力。 Zhao 等[11-12]也發(fā)現(xiàn)不同烹飪處理使南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)提取物的IgG 和IgE結合能力顯著降低,但不能完全消除其IgG 和IgE反應性,其中,熱處理后蝦提取物中的TM 具有更高的IgG 和IgE 反應性。 然而,Lasekan 等[45]發(fā)現(xiàn)蒸處理、煮處理、炸處理、烤處理和微波處理的斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)TM 致敏性無明顯變化,但高壓蒸汽處理(0.14 MPa、121 ℃、20 min)可顯著降低蝦TM 的IgE 結合能力。 相似地,Yu 等[46]分析比較熱處理、超聲結合熱處理及高壓蒸汽處理的擬穴青蟹(Scylla paramamosain)主要過敏原TM 致敏性和消化性的影響,結果發(fā)現(xiàn),僅加熱處理后的TM 致敏性和消化性無明顯變化,然而加熱結合微波處理與高溫高壓處理(0.14 MPa、121 ℃、20 min)的TM 表現(xiàn)出顯著降低的IgE 結合能力和消化穩(wěn)定性。 研究表明:熱處理可在一定程度上可以降低甲殼類過敏原的整體致敏性,但難以完全消除過敏原致敏性,甚至蝦主要過敏原組分TM 表現(xiàn)出更高的致敏潛力。熱處理結合其他非熱加工形式,如高壓和微波處理,具有更好的致敏性消減潛力。 值得注意的是,熱處理對甲殼類過敏原影響結果表現(xiàn)出不一致性,可能與處理樣品、熱處理的條件或過敏原組分的耐熱性不同有關,未來仍需要進一步研究明確。

2.1.2 超高壓消減

超高壓處理主要通過破壞蛋白的一些非共價鍵,如氫鍵、離子鍵和疏水相互作用,從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)結構的修飾,但一般不會涉及蛋白一級結構的改變[63]。 近年來,人們陸續(xù)探究了高壓處理對食品致敏性的影響,其可能的機制包括蛋白質(zhì)變性、構象改變、促進酶解等,達到致敏性消減的作用。 此外,高壓處理通過提取或釋放膜內(nèi)的過敏原到外部環(huán)境中,從而使這些分子可以被水解酶去除而破壞,達到間接減輕或消除一些食品的致敏性,但不需要消除致敏蛋白本身[2]。 Long 等[48]對南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)提取物進行高壓和/或熱處理,并通過競爭ELISA 和BALB/c 小鼠過敏模型分析了TM的致敏性,與煮處理的TM 相比,當樣品在55 ℃、500 MPa 下處理10 min,發(fā)現(xiàn)IgE 結合能力減少73.59%。 此外,在BALB/c 小鼠過敏模型中,高壓結合55 ℃熱處理的TM 喂養(yǎng)的小鼠,其特異性IgE水平明顯降低,同時血清中的組胺水平也顯著低于陽性對照組。 胡志和等[49]采用不同高壓處理凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)TM,結果發(fā)現(xiàn)隨著處理壓力的增加TM 致敏性出現(xiàn)先減弱后增強的趨勢,在300 MPa 處理40 min 的TM 疏水性殘基暴露程度最小,致敏性最低,然而700 MPa 處理條件的TM 疏水性殘基暴露程度最高,且致敏性最高。Faisal 等[47]利用高壓蒸汽處理(600 MPa、120 ℃、5 min)結合不同溫度(40、80、120 ℃)熱處理墨吉對蝦(Penaeus merguiensis)提取物5 min,發(fā)現(xiàn)其致敏性先出現(xiàn)顯著增加,后與未處理樣品無明顯差異；相同條件處理10 min,發(fā)現(xiàn)蝦提取物其致敏性出現(xiàn)先顯著增加,后顯著降低,結果的不同可能歸因于加工過程中IgE 結合表位的暴露與掩蓋。 研究結果表明:在高溫條件下,通常會獲得普遍的致敏性降低的效果,不同的研究結果可能歸因于樣品和處理條件,如溫度、壓力、處理時間等的不同。 此外,當進行某些樣品的處理時,應對處理參數(shù)進行優(yōu)化,并需要進行更多的動物和人體試驗來確認致敏性降低的可行性。

2.1.3 超聲消減

高強度超聲波是一種機械振蕩頻率高于20 kHz的聲波,其作為一種新型的食品加工技術被廣泛應用于食品加工過程中的干燥、均質(zhì)、過濾、提取、酶滅活和肉類嫩化等。 同時,這種含有能量的超聲波振動引起的與食品基質(zhì)的相互作用,可產(chǎn)生一系列機械效應、熱效應和空化效應,導致部分蛋白質(zhì)的三維結構發(fā)生改變[63]。 研究表明:超聲處理可導致過敏原結構改變,從而降低食物過敏原的致敏性。 Li等[64]利用超聲處理南美白對蝦(Penaeus vannamei)過敏原提取物,通過免疫印跡和ELISA 試驗分析發(fā)現(xiàn)超聲處理能夠降低蝦過敏原蛋白的IgE 結合能力,并推斷這可能歸因于超聲波的空穴效應破壞了蝦過敏原的IgE 結合表位。 Zhang 等[33]探究了高強度超聲處理對秀麗白蝦(Exopalaemon modestus)TM結構、體外消化性和致敏性的影響,發(fā)現(xiàn)超聲處理導致TM α-螺旋含量顯著減少,而β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲含量增加。 通過免疫印跡和ELISA 分析發(fā)現(xiàn)這些結構的變化降低了TM 的致敏性,并有助于TM 消化性的改善。 Dong 等[50]探究了高濃度超聲處理對南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)理化性質(zhì)和致敏性的影響,超聲處理(20 kHz、400 W)蝦過敏原含量隨著時間的延長而逐漸降低,在20 min 時具有最低的致敏性,TM 含量減少了76%,且體外消化性顯著提高。 劉光明等[52]發(fā)現(xiàn)超聲處理可顯著降低擬穴青蟹(Scylla paramamosain)TM 的致敏性和消化穩(wěn)定性,并發(fā)現(xiàn)結合蒸煮處理效果更好,其可能原因是超聲處理使TM 蛋白結構發(fā)生一定改變,進一步結合蒸煮處理可導致TM 結構的進一步降解與結構變化,有利于后續(xù)蛋白酶的酶解。 相似的,Yu 等[65]發(fā)現(xiàn)單獨蒸煮處理對擬穴青蟹(Scylla paramamosain)TM 致敏性和消化性無明顯影響,但蒸煮結合超聲處理可顯著降低TM 致敏性和消化穩(wěn)定性。 高強度超聲作為一種新型的非熱加工技術,在降低食品的致敏性方面表現(xiàn)出巨大的潛力。 與熱加工技術相比,它消耗的能量更少,傳質(zhì)率更高,而不改變食品的基本特性,但超聲處理也很難消除蝦的過敏原致敏性,超聲處理協(xié)同其他加工技術,如熱處理、高壓蒸汽處理等,將更具應用潛力。

2.1.4 低溫等離子體消減

低溫等離子體技術是一種新興的食品非熱加工技術,具有食品組分破壞性小、殺菌效率高、作用時間短等優(yōu)點,并可以改善食品理化特性,已成功應用于肉制品保藏和果蔬殺菌保鮮等領域[63]。然而,目前關于低溫等離子體處理對于甲殼類水產(chǎn)品過敏原致敏性消減的影響研究較少,關于冷等離子體降解過敏原的確切機制和詳細路徑仍有一些不確定性。 研究表明,低溫等離子體處理可造成蛋白質(zhì)肽鍵的斷裂,氨基酸殘基的氧化和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)的形成,進一步誘發(fā)蛋白質(zhì)結構的破壞引起過敏原線性和構象表位的變化,從而消減過敏原的IgE 結合能力[1]。 最近,Ekezie等[66]探究不同時間低溫等離子體處理南美白對蝦(Litopenaeus vannamei),發(fā)現(xiàn)低溫等離子體處理后的蝦提取物pH 值和蛋白質(zhì)溶解度顯著下降,且低溫等離子處理對蝦的理化和結構特征有相當大的影響。 在另一項研究中,Ekezie 等[53]利用低溫等離子體處理南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)TM,發(fā)現(xiàn)蝦TM 的二級結構發(fā)生顯著變化,出現(xiàn)α-螺旋含量降低,β-折疊和無規(guī)則卷曲含量升高,最終使得TM 的IgE 和IgG 結合能力下降。 Shriver 等[67]發(fā)現(xiàn),南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)經(jīng)30 kV、60 Hz 的等離子體處理5 min,蝦TM 致敏性降低76%。 可見,低溫等離子體技術可以有效降低甲殼類水產(chǎn)品過敏原致敏性,但還需要更多的研究來證實其有效性,并優(yōu)化等離子體處理參數(shù)。

2.1.5 輻照消減

輻照處理是另一種新型的非熱加工技術,可促進生物大分子的降解、交聯(lián)和分子構象的變化,破壞或改變抗體結合點,使過敏原的致敏性降低,甚至完全喪失[55-56]。 最近,Muanghorn 等[68]采用γ-輻射處理羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii),在免疫印跡分析中發(fā)現(xiàn),γ-輻照處理導致TM 免疫印跡條帶強度顯著降低,這可能歸因于γ-輻照改變了TM結構,導致IgG 無法識別。 研究表明輻照結合熱處理可以更好地達到降低過敏原致敏性的效果,且輻照劑量在過敏原的消減中扮演重要作用[54]。 然而,Liu 等[56]研究了輻照處理對冷凍刀額新對蝦(Metapenaeus ensis)的影響,發(fā)現(xiàn)在輻照劑量為0 ～3 kGy時,IgE 結合能力出現(xiàn)明顯增加,隨著進一步輻照劑量的增加(3 ～10 kGy),TM IgE 結合能力出現(xiàn)降低,隨著劑量增加到10 kGy,TM 的IgE 結合能力僅降低約20%。 這可能是由于輻照的能量無法穿透冷凍蝦。 此研究與Costa 等[69]報道結果一致:高劑量和長時間的輻射可造成過敏原結構變化,降低TM 的IgE 結合能力,而小劑量的輻射則使其增加。應該指出的是,輻照處理似乎并非是控制甲殼水產(chǎn)品過敏原的理想技術。 因為低劑量的輻照劑量可能會增加其致敏性,雖然高劑量的輻照可使甲殼類水產(chǎn)品過敏原的致敏活性下降,但高劑量的輻照可能會引起劑量殘留,從而對消費者產(chǎn)生不良影響。

2.2 化學修飾消減技術

2.2.1 酸處理消減

食物基質(zhì)環(huán)境中酸堿性的變化是加工過程中的常見環(huán)節(jié),也是目前工業(yè)化以“堿溶酸沉”為主要工藝生產(chǎn)分離蛋白的基本原理之一。 目前,關于酸處理后甲殼類水產(chǎn)品過敏原致敏性變化報道較少。Perez-Macalalag 等[70]發(fā)現(xiàn),經(jīng)煮處理并預先在醋中浸泡8 h 的蝦提取物表現(xiàn)出更低的致敏性。 然而,Lasekan 等[57]發(fā)現(xiàn)在pH 值為1.0 ～3.5 的醋中腌制的蝦可溶性肌纖維蛋白的可提取性明顯降低,大量的TM 出現(xiàn)在不溶性沉淀中,且可溶性蛋白部分中的TM 表現(xiàn)出IgE 結合能力的顯著降低。 然而,所有腌制蝦的不溶性蛋白部分的TM 都顯示出更強的IgE 結合能力。 酸處理對過敏原結構修飾進而消減其致敏性,主要是通過蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸質(zhì)子化實現(xiàn)的。 在低于蛋白等電點的條件下,溶液中多余的H+將使蛋白質(zhì)分子中的自由氨基和羧基質(zhì)子化,分子內(nèi)部將發(fā)生相同電荷的相互排斥,從而導致蛋白質(zhì)結構的解折疊,進而破壞其構象表位,導致致敏性顯著降低。 然而,在存在大量線性表位的情況下,酸性條件可能無法降低其致敏性。

2.2.2 糖基化消減

糖基化是廣泛存在于食品工業(yè)中蛋白質(zhì)和糖之間的一種非酶褐變,是還原糖的羰基和氨基酸的游離氨基(通常是精氨酸和賴氨酸)在食品熱加工或長期儲存后發(fā)生的反應,又稱美拉德反應。 研究發(fā)現(xiàn),美拉德反應可引起蛋白功能特性、生物利用率、免疫反應性和致敏性的改變,其主要機理是通過氨基酸和糖相互作用導致蛋白質(zhì)三級結構的改變,從而改變了它們的構象表位。 此外,形成的高分子質(zhì)量和不溶性聚集體的形成有助于掩蓋構象和線性表位,從而降低了糖化蛋白的潛在致敏性[58,71]。 國內(nèi)外眾多學者研究發(fā)現(xiàn)糖基化反應能夠消減食物過敏原的致敏性,且消減程度主要取決于所用還原糖的種類。 Zhang 等[58]利用不同分子質(zhì)量糖與秀麗白蝦(Exopalaemon modestus)TM 進行糖基化,發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量越小的糖分子越易與TM 發(fā)生糖基化反應,進而產(chǎn)生更多糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation endproducts,AGEs)。 此外,動物實驗發(fā)現(xiàn),與未糖基化的TM 相比,糖基化的TM 能夠顯著降低小鼠脾臟和腸系膜淋巴結淋巴細胞內(nèi)Th2 型細胞因子(IL-4和IL-13)和Th1 型細胞因子(IL-10 和TGF-β)的分泌,減弱對小鼠的過敏反應。 此外,Fu 等[72]利用核糖、低聚半乳糖和低聚殼聚糖與中國對蝦(Penaeus chinensis)TM 過敏原進行美拉德反應,發(fā)現(xiàn)不同類型糖糖基化均可顯著降低TM α-螺旋含量,造成TM結構和表位的顯著變化,導致TM 致敏性均顯著降低,致敏性最高可降低60%。 Han 等[71]利用核糖、阿拉伯糖、乳糖、葡萄糖和麥芽糖與擬穴青蟹(Scylla paramamosai)TM 和AK 進行美拉德反應,發(fā)現(xiàn)糖基化后的TM 和AK 致敏性均有不同程度的下降。 值得注意的是,糖基化和交聯(lián)反應較難控制,生成的有害伴隨產(chǎn)物(如AGEs)存在潛在安全風險等。

2.3 生物修飾消減技術

2.3.1 酶處理消減

酶解處理是溫和的,可以破壞蛋白質(zhì)的一級蛋白序列和原始功能特性,已被認為是降低致敏性的有效工具。 常用的水解酶,如胰蛋白酶和木瓜蛋白酶；而其他酶包括酪氨酸酶、多酚氧化酶和漆酶,主要用于蛋白質(zhì)的交聯(lián)[10]。 相應的機制主要分為兩種方式。 1)TM 可以被蛋白酶水解為多肽、氨基酸或其他小分子,從而改變空間構象[2]；2)由酶引起的分子間或分子內(nèi)交聯(lián)導致了蛋白質(zhì)構象的破壞[59]。 Huang 等[73]分別用胃蛋白酶和胰蛋白酶研究了鋸緣青蟹(Scylla serrata)TM 在模擬胃液(SGF)和模擬腸液(SIF)中的消化穩(wěn)定性,結果顯示,在SGF 中,肌動蛋白和肌球蛋白重鏈被胃蛋白酶迅速降解,而TM 對胃蛋白酶有一定的抵抗力。 然而,在SIF 系統(tǒng)中,肌球蛋白重鏈被迅速降解,而肌動蛋白表現(xiàn)出與TM 同樣的抗胰蛋白酶消化性。 在另一項研究中, Mejrhit 等[74]發(fā)現(xiàn)蝦TM 經(jīng)胃蛋白酶(30 μg/mL)在條件下pH 2 處理2 h,結果顯示酶解后的TM 與20 種人血清IgE 的識別度下降89.4%,而與兔IgG 的識別度下降90.5%。 當結合加熱(90 ℃) 時, IgG 結合能力的最大下降幅度為85.1%。

2.3.2 發(fā)酵處理消減

利用雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌發(fā)酵,是當前應用較多的一種食品加工工藝。 利用益生菌對食物進行發(fā)酵處理,可以使難溶解的大分子物質(zhì)在益生菌分泌物的作用下分解為易溶的小分子物質(zhì),不僅能夠改善質(zhì)地、風味、營養(yǎng)價值,增加穩(wěn)定性,而且還能夠降低過敏原的致敏性。 目前,關于發(fā)酵大豆制品、發(fā)酵牛乳制品和發(fā)酵小麥制品相關研究已有較多報道,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵制品致敏性明顯低于其非發(fā)酵制品[75]。 食物中的過敏原主要為蛋白質(zhì),通過發(fā)酵處理可以大分子蛋白分解或變性,破壞其構象表位和線性表位,以達到消除過敏原或降低致敏性的目的。Park 等[62]發(fā)現(xiàn)采用傳統(tǒng)韓國泡菜發(fā)酵工藝處理的日本毛蝦(Acetes japonicus)致敏性顯著降低。 李鴻雁等[61]報道了乳酸菌發(fā)酵可顯著降低海蝦過敏原致敏性,在采用乳酸菌發(fā)酵溫度為37 ～42 ℃,發(fā)酵時間48 ～60 h 的蝦肉中已無IgE 結合能力。

3 結論與展望

當前,食物過敏的發(fā)病率逐年攀升,這給社會、家庭及個人帶來了嚴重的經(jīng)濟及健康負擔。雖然,目前對甲殼類過敏原鑒定、理化性質(zhì)表征、抗原表位的確認及過敏原消減技術的研究已經(jīng)取得了一定進展,但仍有很多方面值得深入研究。首先,雖然一些甲殼類過敏原已經(jīng)被鑒定,甚至三維結構晶體已被表征,但抗原表位尚未完全闡明,且仍需采過敏患者血清進一步挖掘新的甲殼類過敏原,以實現(xiàn)更好的過敏診斷和預防。 其次,目前過敏原消減技術機制研究大多集中在整個過敏原,而不是特定的過敏原表位區(qū)域。 表位是位于蛋白質(zhì)特定區(qū)域的氨基酸序列,通常被受體細胞識別,可以激活淋巴細胞引發(fā)免疫反應,是過敏原致敏性的分子基礎。 因此,在隨后的研究中,可以應用跨學科的技術和生物學方法,如重疊合成肽、噬菌體展示、表面等離子體共振、蛋白質(zhì)芯片和生物信息學方法等來識別這些特定的表位區(qū)域,更好闡明不同加工技術對過敏原結構和表位修飾的影響機制,以開發(fā)適合過敏性患者食用的低致敏甲殼類食品。 此外,多種過敏原消減技術被證實可以降低甲殼類水產(chǎn)品過敏原致敏性,但目前僅處于研究階段,離實際應用還有一定距離。 并且單一加工技術手段的應用難以徹底消除多種過敏原致敏性,結合不同新型加工技術的優(yōu)勢可能為過敏原致敏性完全消除提供一個可靠解決方案,同時保持甲殼類水產(chǎn)品的感官和質(zhì)量特性,這些可以成為未來研究的主題。 最后,國內(nèi)外研究者還需要進行體內(nèi)外毒理學分析,由于個體差異過敏癥患者可能對加工的甲殼類產(chǎn)品有完全不同的反應。 需要更多的動物和人體試驗來確認這些創(chuàng)新的非熱能技術的可行性,同時也應認真考慮人體試驗的倫理問題。 總之,未來研究者有必要繼續(xù)深入系統(tǒng)地研究甲殼類水產(chǎn)品過敏原及其消減技術,為推進過敏原消減技術的實際應用,開發(fā)低致敏性甲殼類食品提供依據(jù)。