成麗媛，劉 薇，郭笑言，戈曉愛，王丁丁，王 濤*

（1中國藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院新藥篩選中心，南京 210009；2南京市職業(yè)病防治院，南京 210042）

艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS），是世界范圍內(nèi)的重大感染性疾病，感染人數(shù)還在不斷上升［1］。當(dāng)前，各種抗病毒藥物的合理治療可獲得良好的病毒抑制，多數(shù)艾滋病患的生活質(zhì)量和存活時(shí)間均得到改善［2］。然而，現(xiàn)有抗病毒藥物尚不能完全清除患者體內(nèi)病毒，隨著藥物使用時(shí)間的延長，藥物相關(guān)不良癥狀日益顯著，如代謝綜合征、糖尿病、慢性肝腎及骨骼疾病等［3-4］，已成為影響艾滋病患者生存質(zhì)量和預(yù)后的主要原因。

齊多夫定（AZT）是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于治療AIDS 的核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑［5］，也是抗人類免疫缺陷病毒感染的一線藥物之一，但是長期用藥所引起的機(jī)體代謝紊亂限制了其臨床療效發(fā)揮［6-7］。目前AZT的不良反應(yīng)研究主要集中在線粒體毒性方面［8-10］，AZT 可干擾線粒體DNA 的復(fù)制或抑制線粒體相關(guān)蛋白的合成而造成線粒體損傷［11］，這可能是其誘發(fā)糖脂代謝的障礙和失衡的潛在機(jī)制。AZT 對(duì)于整體糖脂代謝平衡的作用特征及其靶器官目前尚不明確。

正常情況下，機(jī)體組織細(xì)胞可以利用葡萄糖、脂肪酸等多種能量物質(zhì)代謝供能，可根據(jù)組織環(huán)境和能量物質(zhì)的供應(yīng)情況，在不同能量代謝底物之間切換［12］，而線粒體則是維持和調(diào)節(jié)代謝平衡的核心細(xì)胞器［13］?；贏ZT 誘發(fā)的臨床代謝失衡癥狀和潛在的線粒體毒性特征，本研究采用正常小鼠長期給藥，考察AZT 對(duì)整體糖脂代謝平衡的作用特征，同時(shí)探討肝臟在AZT 所致線粒體毒性和糖脂代謝失衡中的靶器官角色，為其臨床安全精準(zhǔn)用藥及不良反應(yīng)防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

齊多夫定（CAS：A122924，純度大于98%，阿拉丁試劑有限公司）；胰島素注射液（諾和靈30R，丹麥諾和諾德公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；總RNA提取試劑，HiScript?Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix DNA 擴(kuò)增試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；β-actin、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Glut2）、肉堿棕櫚酸轉(zhuǎn)移酶（Cpt1α）、中鏈?；o酶A 脫氫酶（Mcad）抗體（美國Proteintech 公司）；Akt、P-Akt 抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）。葡萄糖、甘油三脂檢測(cè)試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）血生化試劑盒（南京威特曼生物科技有限公司）；非酯化脂肪酸檢測(cè)試劑盒（日本W(wǎng)ako公司）。所用引物由上海英濰捷基公司合成。

1.2 儀 器

Legend Micro 21R 低溫離心機(jī)，Varioskan Lux多功能微孔板讀數(shù)儀，Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀，Applied Biosystems StepOneTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國Thermo 公司）；TL 系列中高通量組織細(xì)胞研磨破碎儀（北京鼎昊源科技有限公司）；D1100-230V 恒溫金屬?。绹鳯abnet 公司）；PowerPac?HC 電泳儀電源，Gel Doc XR+凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；BX53 生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 動(dòng) 物

SPF級(jí)雄性ICR小鼠，6～8周齡，體重18～22 g，購自河南斯克貝斯生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫）2020-0005。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合中國藥科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 劑量設(shè)置及分組

24 只雄性ICR 小鼠隨機(jī)分為3 組，每組8 只，分別為溶劑對(duì)照組（CON）、齊多夫定低、高劑量組（AZT-L、AZT-H）。齊多夫定給藥組每天灌胃給予AZT 100，300 mg/kg，溶劑對(duì)照組灌胃給予相應(yīng)體積的蒸餾水，連續(xù)12 周。給藥結(jié)束后禁食12 h 摘眼球采血，頸椎脫臼處死小鼠，分離肝臟。

2.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

12 周給藥結(jié)束后，分別在禁食6 h 和12 h 后進(jìn)行眼眶取血，將全血于200 μL 離心管中常溫靜置30 min 后，4 ℃，3 000 r/min 離心15 min，吸取上層血清至200 μL EP 管中，按血生化試劑盒說明測(cè)定血清葡萄糖（GLU）和甘油三酯（TG）水平。

2.3 糖耐量實(shí)驗(yàn)

給藥結(jié)束前7 天，小鼠禁食不禁水12 h 后，灌胃給予2 g/kg 葡萄糖溶液。分別測(cè)定給予葡萄糖0，15，30，60，120 min 后小鼠的血糖，計(jì)算血糖濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC）。

2.4 胰島素耐量實(shí)驗(yàn)

給藥結(jié)束前4天，小鼠禁食不禁水6 h后，腹腔注射0.75 U/kg 胰島素注射液。分別測(cè)定給予胰島素0，15，30，60，120 min 后小鼠的血糖，計(jì)算血糖濃度-時(shí)間AUC。

2.5 肝臟指數(shù)及肝脂檢測(cè)

小鼠肝臟用生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)，即肝臟占體重的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。稱取肝組織30 mg，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）研磨，使用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，吸取肝勻漿上清液測(cè)定肝臟組織TG、非酯化脂肪酸（NEFA）水平。

2.6 肝臟病理學(xué)檢測(cè)

取小鼠肝臟左葉中間部分，在4%中性甲醛中固定48 h，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅（HE）染色，最后在顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)變化。

2.7 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

稱取肝組織30 mg，加入RIPA 裂解液提取肝總蛋白，使用BCA法定蛋白，金屬浴煮蛋白，-20 ℃保存變性蛋白。取等體積蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，在冰上恒流模式下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5% BSA 封閉2 h，4 ℃孵育一抗過夜，一抗為Cpt1α、Mcad、Glut2、Akt、P-Akt 抗體。第2 天用TBST 洗膜，孵育二抗羊抗兔IgG 抗體1 h，再洗膜，采用化學(xué)發(fā)光法曝光。使用Image J進(jìn)行蛋白條帶的灰度分析。

2.8 RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

稱取肝組織30 mg，加Trizol 裂解液1 mL 提取總RNA。使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度，在逆轉(zhuǎn)錄儀上將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法測(cè)定cDNA 樣品中的Cpt1α、Mcad、Pepck、G6pase 和Glut2 的基因水平。選用βactin作為內(nèi)參基因，引物序列如表1所示。

2.9 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 6.01 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xˉ± s 表示。組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用One-Way ANOVA 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR assay

3 結(jié) 果

3.1 齊多夫定對(duì)小鼠體重及肝臟系數(shù)的影響

如圖1所示，各組小鼠在給藥期間體重均有所上升，而各組間體重及肝臟指數(shù)均無明顯差異。

Figure 1 Effect of zidovudine(AZT)on the body weight(A)and liver index(B)in mice(xˉ± s,n = 8)CON:Solvent control;AZT-L:Zidovudine(100 mg/kg);AZT-H:Zidovudine(300 mg/kg)

3.2 齊多夫定對(duì)小鼠血糖、血脂的影響

如圖2血清生化結(jié)果顯示，隨著禁食時(shí)間的延長，對(duì)照組小鼠血清葡萄糖和甘油三酯水平都顯著降低；與溶劑對(duì)照組相比，AZT給藥對(duì)于禁食6 h與禁食12 h 血糖水平無明顯影響（圖2-A），但卻顯著抑制禁食12 h血清甘油三酯的降低（圖2-B）。

Figure 2 Effect of AZT on serum glucose（A）and triglyceride(TG)(B)in mice after fasting for 6 h or 12 h(xˉ± s,n = 8)*P ＜0.05

3.3 齊多夫定對(duì)小鼠糖耐量及胰島素耐量的影響

如圖3 口服糖耐量（OGTT）結(jié)果顯示，溶劑對(duì)照組小鼠灌胃葡萄糖后，血糖在15 min 時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸下降，120 min 時(shí)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。與對(duì)照組相比，低劑量組小鼠血糖無明顯變化，而高劑量組小鼠在15 min 和30 min 的血糖明顯高于對(duì)照組（圖3-A）。計(jì)算AUC 發(fā)現(xiàn)，AZT 高劑量組可明顯降低糖耐量水平（圖3-B）。

胰島素耐量（ITT）結(jié)果顯示，溶劑對(duì)照組小鼠注射胰島素后，血糖急速下降，在30 min 時(shí)降到最低，隨后90 min 內(nèi)肝臟糖異生增加使血糖恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。與對(duì)照組相比，AZT給藥組可以劑量依賴性的增加胰島素注射后30 min 內(nèi)的降糖速率，然而，AZT 各劑量組血糖上升趨勢(shì)明顯被抑制，提示小鼠肝臟糖異生能力受損（圖3-C）。結(jié)果顯示AZT明顯降低AUC水平（圖3-D）。

3.4 齊多夫定對(duì)小鼠肝組織病理學(xué)的影響

肝臟HE 染色結(jié)果如圖4 所示，溶劑對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，AZT 高劑量組小鼠表現(xiàn)出肝細(xì)胞體積增大，胞漿淡染，而低劑量組對(duì)小鼠肝臟無明顯影響。

3.5 齊多夫定對(duì)小鼠肝臟的影響

血清生化結(jié)果顯示，AZT給藥組呈劑量相關(guān)性的增加ALT、AST 水平，說明AZT 可導(dǎo)致肝臟受損（圖5-A、B）；肝臟組織TG、NEFA 指標(biāo)明顯升高，說明肝臟脂質(zhì)蓄積（圖5-C、D）。

3.6 齊多夫定對(duì)小鼠肝臟糖脂代謝基因表達(dá)的影響

PCR 結(jié)果如圖6 所示，與溶劑對(duì)照組相比，AZT 給藥后參與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶Cpt1α 及脂肪酸β 氧化反應(yīng)第一步的中鏈?；o酶A 脫氫酶（Mcad）基因表達(dá)劑量依賴性的下調(diào)。而糖代謝相關(guān)基因結(jié)果顯示葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Glut2）的基因表達(dá)上調(diào)，糖異生基因Pepck、G6pase表達(dá)呈劑量相關(guān)性的下調(diào)。結(jié)果表明AZT 導(dǎo)致肝臟脂肪酸氧化被抑制，能量缺乏導(dǎo)致糖酵解增強(qiáng)，同時(shí)糖異生過程被抑制。

3.7 齊多夫定對(duì)肝臟糖脂代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖7 所示，與溶劑對(duì)照組相比，AZT 給藥組脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Cpt1α表達(dá)明顯下調(diào)，與基因結(jié)果一致；Glut2、Mcad 及胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)無明顯變化。

4 討 論

新陳代謝是生命體的基本要素，既有整體的特征，也有組織細(xì)胞層面的機(jī)制。當(dāng)疾病、損傷、藥物等外界因素作用于機(jī)體代謝的某個(gè)過程，如果超過了機(jī)體自身調(diào)節(jié)能力，即表現(xiàn)為某些代謝失衡特征，甚至誘發(fā)多種代謝性疾?。?4-15］。

Figure 3 Effect of AZT in oral glucose tolerance test(OGTT)(A)and insulin tolerance test(ITT)(B)(xˉ± s,n = 8)*P ＜0.05, ***P ＜0.001

Figure 4 Effect of AZT on liver histopathology of mice(HE staining,×200)A:CON;B:AZT-L;C:AZT-H

葡萄糖是機(jī)體多數(shù)組織主要的能量代謝底物，也是多數(shù)代謝失衡病癥的主要易損指標(biāo)［17］。本實(shí)驗(yàn)中口服糖耐量結(jié)果顯示，AZT高劑量組出現(xiàn)明顯的糖耐量受損，提示機(jī)體對(duì)于外源性葡萄糖處置能力顯著下降。胰島素耐量結(jié)果顯示，正常組小鼠血糖曲線先是經(jīng)歷30 min 的快速下降相，再出現(xiàn)90 min 的緩慢上升相，前者是外源性胰島素的降糖作用，后者則是血糖降低繼發(fā)的肝糖輸出所致，其中肝糖異生發(fā)揮主要貢獻(xiàn)。與正常小鼠相比，AZT 給藥可使得血糖下降相的斜率更大，提示給藥組胰島素的血糖處置能力增強(qiáng)或者敏感性增加；同時(shí)血糖上升相接近消失，提示給藥組肝臟糖異生作用被抑制。由此可見，AZT 長期給藥一方面使得機(jī)體處置外源性葡萄糖能力（糖耐量實(shí)驗(yàn)）受損，另一方面卻又使得胰島素敏感性增強(qiáng)（胰島素耐量實(shí)驗(yàn)）和肝臟糖異生減弱，表明AZT可損害機(jī)體葡萄糖代謝，但是對(duì)胰島素介導(dǎo)的內(nèi)源性糖代謝無不良影響。

脂肪酸作為另一種主要的能量物質(zhì)，可與葡萄糖共同參與能量代謝供應(yīng)，這即是機(jī)體代謝靈活性特征之一［18］。本實(shí)驗(yàn)中，通過檢測(cè)禁食（能量匱乏）狀態(tài)下小鼠血糖、血脂的水平，觀察AZT 對(duì)糖脂代謝選擇性的影響。隨著禁食時(shí)間的延長，正常小鼠血清葡萄糖和甘油三酯水平都顯著降低，表明機(jī)體在利用內(nèi)源性的糖和脂代謝供能；AZT 長期給藥對(duì)于內(nèi)源性葡萄糖利用無明顯影響，但卻顯著抑制甘油三酯的代謝利用，表明AZT損害小鼠對(duì)能量代謝底物的選擇，影響了糖脂代謝平衡。

Figure 5 Effect of AZT on liver of mice(xˉ± s,n = 8)A:Alanine aminotransferase(ALT);B:Aspartate aminotransferase(AST);C:TG D:Non-esterified fatty acids(NEFA)*P ＜0.05, **P ＜0.01,***P ＜0.001

Figure 6 Effects of AZT on gene expression of glycolipid metabolism in mice(xˉ± s,n = 6)*P ＜0.05, ***P ＜0.001 vs CON group

線粒體是糖、脂等能量物質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要場所，在糖脂代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［19-20］。在富含碳水化合物的餐后，葡萄糖和胰島素高時(shí)，葡萄糖攝取、糖酵解和丙酮酸氧化增加，脂肪酸氧化受到抑制。在禁食期間，Cpt1α 的活性增加，脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行β 氧化［21-22］，脂肪酸利用率的增加會(huì)抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，阻礙葡萄糖的攝取和使用。肝臟是協(xié)調(diào)全身代謝的的主要器官，也是線粒體含量豐富的器官，在機(jī)體代謝調(diào)節(jié)中具有重要作用［23］。本實(shí)驗(yàn)中，AZT 給藥組血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高，肝臟脂質(zhì)含量（TG、NEFA）增加，提示肝細(xì)胞損害和脂質(zhì)代謝障礙。AZT 給藥組肝臟糖代謝基因表達(dá)明顯上調(diào)，而脂肪酸氧化基因及糖異生基因表達(dá)明顯下降。AZT 明顯抑制Cpt1α 的蛋白水平，但對(duì)于糖代謝相關(guān)蛋白（Glut2、Mcad 及胰島素信號(hào)通路）表達(dá)未見明顯影響，提示AZT 長期給藥導(dǎo)致肝臟脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，不能通過脂肪酸β氧化來提供能量。由此可見，肝臟是AZT 誘發(fā)代謝失衡的潛在靶器官，而肝臟線粒體脂肪酸代謝障礙是其影響代謝平衡的潛在機(jī)制。

總之，AZT 長期給藥可導(dǎo)致小鼠代謝失衡，主要表現(xiàn)為糖耐量受損和脂肪酸代謝障礙，肝臟是其重要的靶器官，其可能作用機(jī)制是通過下調(diào)脂肪酸氧化代謝及糖異生基因表達(dá)，從而導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)蓄積和糖脂代謝紊亂。機(jī)體糖脂代謝的調(diào)節(jié)是由多器官參與的，器官之間的交叉對(duì)話在能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中也至關(guān)重要，后續(xù)研究可繼續(xù)從代謝平衡調(diào)節(jié)著手，通過肌肉、脂肪、胰腺等多器官探討，進(jìn)一步闡釋AZT導(dǎo)致代謝紊亂的機(jī)制。

Figure 7 Effect of AZT on the expression of protein relative to glucose and lipid metabolism in mice (xˉ± s,n = 3)A:Glut2;B:Mcad;C:Cpt1α;D:P-Akt/Akt*P ＜0.05 vs CON group