李浩宇，唐寶強(qiáng)，何東升*，涂家生**

（1中國藥科大學(xué)藥學(xué)院藥用輔料及仿創(chuàng)藥物研發(fā)評價(jià)中心，南京 210009；2國家藥品監(jiān)督管理局藥物制劑及輔料研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009）

聚西托醇1000（又稱聚乙二醇十六烷基醚），是一種常見的藥用輔料，化學(xué)式為CmH2m+1（OCH2CH2）nOH（m = 16，n ～20），本品由十六醇與一定數(shù)量的環(huán)氧乙烷通過縮合反應(yīng)制得，產(chǎn)品中聚乙二醇的重復(fù)單元在2 ～20 之間，當(dāng)n=20 時(shí)即為聚西托醇1000（商品名Brij-58）［1］。聚西托醇1000 在藥物制劑領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，常作為乳劑、乳膏、氣霧劑的非離子O/W 型乳化劑和揮發(fā)油的增溶劑等，在藥物控釋、增溶等方面具有重要作用［2］。然而，在臨床應(yīng)用中，含有聚西托醇1000作為乳化劑的乳膏存在多例患者發(fā)生醫(yī)源性過敏性皮炎的案例［3］，因此，建立良好的方法檢測聚西托醇1000有關(guān)雜質(zhì)對于控制本品的質(zhì)量并保障患者用藥安全具有重要意義［4］。

在聚西托醇1000 的生產(chǎn)中，環(huán)氧乙烷作為主要原料可能殘留于產(chǎn)物中，與其相關(guān)的副產(chǎn)物還包括1，4-二氧六環(huán)、乙二醇及其次級副產(chǎn)物二甘醇和三甘醇等。環(huán)氧乙烷對黏膜和皮膚具有一定的刺激性，是世界衛(wèi)生組織列出的一類致癌物，短時(shí)間內(nèi)少量吸入即可引起明顯的中樞神經(jīng)毒性［5］；1，4-二氧六環(huán)則為二類致癌物，對皮膚黏膜有刺激性，誤服可導(dǎo)致肝腎毒性［6］；乙二醇、二甘醇和三甘醇等均對人體有一定的毒性［7］，可通過食入、吸入和經(jīng)皮吸收侵入機(jī)體并主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)、心肺和肝腎毒性［8-9］。這些殘留雜質(zhì)不僅會影響產(chǎn)品質(zhì)量，更具有潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，有必要對其進(jìn)行檢測和控制。

現(xiàn)行聚西托醇1000的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要收載于英國藥典BP2020［10］、美國藥典USP43-NF38［11］和國際藥典Ph. Int-Tenth Edition［12］中，《中華人民共和國藥典》（2020 版）［13］尚未收錄該品種。在雜質(zhì)檢查項(xiàng)下，BP2020和USP43-NF38僅要求檢查環(huán)氧乙烷雜質(zhì)，對于生產(chǎn)過程中可能存在的1，4-二氧六環(huán)、乙二醇、二甘醇和三甘醇雜質(zhì)的檢查存在缺失。本研究在參考國內(nèi)外藥典標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)輔料生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，首次對聚西托醇1000 中環(huán)氧乙烷、1，4-二氧六環(huán)、乙二醇、二甘醇和三甘醇等雜質(zhì)建立了針對性的氣相色譜檢測方法。所建立的方法能有效測定聚西托醇1000 中的有關(guān)雜質(zhì)，為生產(chǎn)工藝改進(jìn)以及保障患者用藥安全提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀 器

Trace 1300 氣相色譜儀（美國Thermo Fisher 公司）配備氫火焰離子化檢測器（FID）及自動(dòng)進(jìn)樣器；SECURA25-1CN、BSA124S電子天平（德國Sartorius公司）；VF-17MS 氣相色譜柱（30 m × 0.53 mm，1 μm），DB-1 氣相色譜柱（30 m×0.32 mm，5 μm）（美國安捷倫科技有限公司）；Omni-A 獨(dú)立超純水系統(tǒng)（廈門瑞思捷科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥品

乙二醇（純度≥99.5%，批號：L1902032）、二甘醇（純度≥99.5%，批號：H1814132）、乙醇（色譜級，純度≥99.5%，批號：J2027121）、乙醛（純度≥99.5%，批號：E2107134）、N，N-二甲基乙酰胺（色譜級，純度≥99.9%，批號：A2115160）、1，4-二氧六環(huán)標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.7%，批號：L2011016）（上海阿拉丁試劑有限公司）；三甘醇（純度≥99.0%，批號：L1712031）、1，3-丁二醇（純度≥99.0%，批號：ZLCGF-DM）（上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；環(huán)氧乙烷水溶液（1.85 mg/mL，中國食品藥品檢定研究院，批號：190255-202001）；聚西托醇1000 樣品由生產(chǎn)企業(yè)贈(zèng)送（A 公司，批號記為A1、A2、A3、A4和A5；B公司，批號記為B1、B2和B3）。

2 方法與結(jié)果

2.1 環(huán)氧乙烷和1,4-二氧六環(huán)的檢測

2.1.1 溶液配制

供試品溶液：取本品1.0 g，精密稱定，置于頂空瓶中，精密加入N，N-二甲基乙酰胺1.0 mL 和水0.2 mL，密封，搖勻，作為供試品溶液。

環(huán)氧乙烷對照品儲備液：精密量取環(huán)氧乙烷水溶液0.15 mL 于25 mL 量瓶中，用水定容得質(zhì)量濃度為11.1 μg/mL的溶液。

1，4-二氧六環(huán)對照品儲備液：精密稱取1，4-二氧六環(huán)50 mg于50 mL量瓶中，用水稀釋成約1 mg/mL 的溶液。再精密量取1 mL 于20 mL 量瓶中，用水定容得質(zhì)量濃度為50 μg/mL的溶液。

對照品混合儲備液：精密稱取1，4-二氧六環(huán)50 mg 于20 mL 量瓶中，用水稀釋成約2.5 mg/mL的溶液，精密量取0.5 mL 于25 mL 量瓶中，另精密量取環(huán)氧乙烷水溶液0.15 mL于該量瓶中，用水定容得環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度為11.1 μg/mL 同時(shí)1，4-二氧六環(huán)質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的對照品混合儲備液。

對照品溶液：取本品1.0 g，精密稱定，置于頂空瓶中，精密加入環(huán)氧乙烷和1，4-二氧六環(huán)對照品儲備液各0.1 mL，再精密加入N，N-二甲基乙酰胺1.0 mL，密封，搖勻。

系統(tǒng)適用性溶液：精密量取環(huán)氧乙烷和1，4-二氧六環(huán)對照品溶液各0.1 mL 置于頂空瓶中，加入新配制的0.001%乙醛水溶液0.1 mL，再精密加入N，N-二甲基乙酰胺1.0 mL，密封搖勻。

2.1.2 色譜條件及測定方法 使用安捷倫DB-1色譜柱（以聚二甲基聚硅氧烷為固定液的石英毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，5 μm）），頂空進(jìn)樣。起始溫 度 為35 ℃，維 持5 min，以5 ℃/min 升 溫 至180 ℃，再以30 ℃/min 升溫至230 ℃，維持5 min。進(jìn)樣口溫度為150 ℃，氫火焰離子化檢測器溫度為250 ℃，頂空平衡溫度為70 ℃，平衡時(shí)間45 min。進(jìn)樣體積1000 μL，分流比5∶1。取樣品注入氣相色譜儀，按標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算。

2.1.3 系統(tǒng)適用性和專屬性 取空白溶劑（N，N-二甲基乙酰胺1.0 mL 加水0.2 mL 的混合溶液）、系統(tǒng)適用性溶液和供試品溶液頂空進(jìn)樣分析，檢測結(jié)果見圖1。保留時(shí)間分別為：乙醛3.077 min，環(huán)氧乙烷3.930 min，1，4-二氧六環(huán)15.768 min。環(huán)氧乙烷和1，4-二氧六環(huán)理論塔板數(shù)均大于10 000，信噪比均大于10，空白溶劑和樣品在目標(biāo)峰出峰位置無干擾，各相鄰峰的分離度均大于2.0，表明該方法專屬性良好。

Figure 1 Chromatograms of blank solution(A),system suitability solution(B)and reference solution(C)1:Acetaldehyde;2:Ethylene oxide;3:1,4-Dioxane

2.1.4 線性 稱量樣品1.0 g，精密稱定6份置于頂空瓶中。依次精密移取對照品混合儲備液各0、0.10、0.20、0.30、0.40 和0.50 mL 于頂空瓶中，并再往第一份和第二份樣品中分別補(bǔ)加水0.2 mL和0.1 mL。然后按順序依次精密量取N，N-二甲基乙酰胺1.0、1.0、1.0、0.9、0.8、0.7 mL 加至頂空瓶內(nèi)，密封搖勻，得到線性測試溶液：環(huán)氧乙烷加樣量分別為0、0.555、1.11、1.665、2.22 和2.775 μg/g；1，4-二氧六 環(huán)加樣 量分別 為0、2.512、5.023、7.535、10.046和12.558 μg/g。每個(gè)加樣量組平行配制3 份溶液，取上述溶液進(jìn)樣分析，以各樣品峰面積對加樣量（μg/g）作圖并進(jìn)行線性擬合。檢測結(jié)果見表1。

結(jié)果顯示，環(huán)氧乙烷在0 ～2.775 μg/g 的加樣范圍內(nèi)線性良好，在各加樣量下的RSD 均小于6%，線性方程y=0.035 1x-0.000 7，r=0.999 5；1，4-二氧六環(huán)在0 ～12.558 μg/g 的加樣范圍內(nèi)線性良好，在各加樣量下的RSD 均小于9%，線性方程y=0.009 9x-0.001 9，r=0.999 4。

Table 1 Linearity of ethylene oxide and 1,4-dioxane(xˉ± s,n = 3)

2.1.5 進(jìn)樣精密度 平行制備6 份對照品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，環(huán)氧乙烷和1，4-二氧六環(huán)峰面積的RSD 分別為7.4%和4.0%（n = 6），表明色譜系統(tǒng)進(jìn)樣精密度良好。

2.1.6 檢測限與定量限 取樣品約1.0 g，精密稱定于頂空瓶中，分別加入不同體積的環(huán)氧乙烷對照品儲備液和1，4-二氧六環(huán)對照品儲備液，補(bǔ)足水至水相體積到0.2 mL 后，各精密量取1.0 mL 的N，N-二甲基乙酰胺加入頂空瓶，配制成含有不同環(huán)氧乙烷和1，4-二氧六環(huán)加樣量的溶液，進(jìn)樣分析。當(dāng)信噪比為3 和10 時(shí)，分別為儀器對環(huán)氧乙烷和1，4-二氧六環(huán)的檢測限定量限。結(jié)果顯示，環(huán)氧乙烷的檢測限（S/N=3）為0.222 μg/g，定量限（S/N = 10）為0.888 μg/g，1，4-二氧六環(huán)的檢測限（S/N = 3）為1.501 μg/g，定 量 限（S/N = 10）為3.503 μg/g。

2.1.7 回收率 稱量聚西托醇1000 樣品（B1）1.0 g 共6 份，精密稱定，置于頂空瓶中。依次分別加入環(huán)氧乙烷對照品儲備液和1，4-二氧六環(huán)對照品儲備液各0.10 mL，然后依次精密量取N，N-二甲基乙酰胺1.0 mL加入頂空瓶，密封搖勻，配制成環(huán)氧乙烷加樣量為1.11 μg/g及1，4-二氧六環(huán)加樣量為5.023 μg/g 的回收率溶液。另取樣品1.0 g，精密稱定，置于頂空瓶中，精密加入水0.2 mL 和N，N-二甲基乙酰胺1.0 mL 加至頂空瓶內(nèi)，用于測量空白本底值。將各溶液進(jìn)樣分析，檢測結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，在該加樣水平下，環(huán)氧乙烷平均回收率為90.6%，1，4-二氧六環(huán)平均回收率為101.2%，環(huán)氧乙烷和1，4-二氧六環(huán)的RSD 均小于8.0%，符合《中華人民共和國藥典》（2020 版）要求。

Table 2 Recovery of ethylene oxide and 1,4-dioxane(xˉ± s,n = 6)

2.1.8 樣品含量測定 取共8 批次樣品按照“2.1.1”項(xiàng)下的方法配制供試品溶液和對照品溶液，并照“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，按標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算各批次樣品中環(huán)氧乙烷和1，4-二氧六環(huán)的含量。結(jié)果顯示，8 批樣品中，僅A1 和A2 批次樣品分別檢出環(huán)氧乙烷1.9 和0.8 μg/g，其余批次環(huán)氧乙烷均未檢出。所有批次樣品均未檢出1，4-二氧六環(huán)。

2.2 乙二醇、二甘醇和三甘醇的檢測

2.2.1 溶液的配制

內(nèi)標(biāo)溶液：取1，3-丁二醇適量，精密稱定，加無水乙醇配制成質(zhì)量濃度為4 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

對照品儲備溶液：取乙二醇、二甘醇和三甘醇適量，精密稱定，用無水乙醇溶解并稀釋制成各樣品濃度均為4 mg/mL的混合溶液。

對照品溶液：精密移取對照品儲備溶液1.0 mL，置100 mL 量瓶中，精密移取內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

供試品溶液：取本品4.0 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)儲備液1.0 mL，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

線性對照品溶液：稱量乙二醇、二甘醇和三甘醇適量，精密稱定，用無水乙醇溶解并稀釋成各樣品濃度均為0.75 mg/mL的線性對照品溶液。

線性內(nèi)標(biāo)溶液：取1，3-丁二醇適量，精密稱定，加無水乙醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

回收率對照品溶液：稱量乙二醇、二甘醇和三甘醇適量，精密稱定，用無水乙醇溶解并稀釋成各樣品質(zhì)量濃度均為1.25 mg/mL 的線性對照品溶液。

回收率內(nèi)標(biāo)溶液：取1，3-丁二醇適量，精密稱定，加無水乙醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2 色譜條件 使用安捷倫VF-17MS 色譜柱（以50%苯基-50%甲基聚硅氧烷為固定液的石英毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，1 μm）），液體進(jìn)樣；起始溫度60 ℃，維持5 min，以5 ℃/min升溫至110 ℃，維持5 min，再以2 ℃/min升溫至170 ℃，維持5 min，再以35 ℃/min升溫至280 ℃，維持30 min。進(jìn)樣口溫度為270 ℃，氫火焰離子化檢測器溫度為290 ℃。取對照品溶液作為系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)樣，要求乙二醇、二甘醇和三甘醇色譜峰之間的分離度不得小于2.0。載氣為氮?dú)?，分流?∶1，流速4 mL/min，進(jìn)樣體積1.0 μL。取供試品溶液和對照品溶液注入氣相色譜儀，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

2.2.3 系統(tǒng)適用性和專屬性 分別取空白溶劑（無水乙醇）、對照品溶液、供試品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖2。保留時(shí)間分別為：乙二醇5.313 min，1，3-丁二醇10.968 min，二甘醇14.935 min，三甘醇29.628 min。乙二醇、二甘醇、三甘醇理論塔板數(shù)均大于20 000，各相鄰峰的分離度均大于1.5，空白溶劑和樣品在目標(biāo)峰出峰位置無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.2.4 線 性 依次精密移取0.1、0.5、1、1.5 和2 mL 線性對照品溶液于25 mL 量瓶中，再各精密加入線性內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL，加無水乙醇定容得到線性測試溶液，其中1，3-丁二醇質(zhì)量濃度均為40.168 μg/mL，乙 二 醇 分 別 為3.009、15.046、30.092、45.138 和60.184 μg/mL，二甘醇分別為3.047、15.236、30.472、45.708 和60.944 μg/mL，三甘醇分別為3.016、15.082、30.164、45.246 和60.328 μg/mL。以各樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比對各樣品濃度作圖，并進(jìn)行線性擬合。

結(jié)果顯示，乙二醇在3.009 2 ～60.184 0 μg/mL的范圍內(nèi)線性良好，線性方程為y = 0.016 2x -0.010 9，r=0.999 5；二甘醇在3.047 2 ～60.944 0 μg/mL的范圍內(nèi)線性良好，線性方程為y=0.016x-0.015 1，r=0.999 7；三甘醇在3.016 4 ～60.328 0 μg/mL的范圍內(nèi)線性良好，線性方程為y=0.014x-0.030 9，r=0.999 4。

2.2.5 進(jìn)樣精密度 平行制備6 份對照品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，乙二醇、二甘醇和三甘醇與內(nèi)標(biāo)峰面積之比的RSD 分別為2.3%、1.3%和2.7%（n=6），表明色譜系統(tǒng)進(jìn)樣精密度良好。

2.2.6 檢測限與定量限 取不同體積的對照品儲備溶液于100 mL 量瓶中，用無水乙醇稀釋至不同濃度，當(dāng)信噪比為3 和10 時(shí)，分別為各樣品的檢測限和定量限。結(jié)果顯示，乙二醇的檢測限（S/N=3）為1.942 μg/mL，定量限（S/N=10）為5.665 μg/mL；二甘醇的檢測限為1.567 μg/mL，定量限為3.254 μg/mL；三甘醇的檢測限為1.112 μg/mL，定量限為3.567 μg/mL；1，3-丁二醇的檢測限為0.707 μg/mL，定量限為1.768 μg/mL。

2.2.7 回收率 取聚西托醇1000 樣品（B1 批）1.0 g 共9 份分成3 組，精密稱定，置25 mL 量瓶中，精密加入回收率內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL，再分別精密量取回收率對照品溶液0.4、0.5 和0.6 mL 加入量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，配制成低（20 μg/mL）、中（25 μg/mL）和高（30 μg/mL）3 種質(zhì)量濃度的回收率供試溶液。

另取樣品（B1 批）1.0 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，精密移取1.0 mL 回收率內(nèi)標(biāo)溶液后加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，用于測量空白本底值。另精密量取回收率對照品溶液0.5 mL 至25 mL 量瓶中，精密加入回收率內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加無水乙醇定容，用于測量校正因子。將各溶液分別進(jìn)樣分析，檢測結(jié)果見表3。

結(jié)果顯示，各加樣濃度下，乙二醇回收率均在101%～103%，二甘醇回收率均在96%～103%，三甘醇回收率均在100%～103%，RSD 均小于3.0%，均符合《中華人民共和國藥典》（2020版）要求。

Table 3 Recovery of ethylene glycol,diethylene glycol and triethylene glycol(n=3)

2.2.8 樣品含量測定 取共8 批次樣品按照“2.2.1”項(xiàng)下的方法配制供試品溶液和對照品溶液，并照“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算各批次樣品中乙二醇、二甘醇和三甘醇的含量。檢測結(jié)果見表4。

結(jié)果顯示，8 批樣品中，A1 和A2 批次乙二醇、二甘醇和三甘醇含量相對于其他批次較大，其余批次乙二醇、二甘醇和三甘醇含量均小于0.01%。

3 討 論

本研究所建立的檢測方法主要參考了《中華人民共和國藥典》中部分與聚西托醇1000 化學(xué)結(jié)構(gòu)及制備工藝相似品種的現(xiàn)行檢測方法，并在其基礎(chǔ)上加以改進(jìn)使其更適合本品的檢測，參考品種包括聚乙二醇1000、聚氧乙烯50 硬脂酸酯和聚氧乙烯油酸酯等。

3.1 環(huán)氧乙烷和1,4-二氧六環(huán)的測定

檢測過程中發(fā)現(xiàn)，在參考品種所規(guī)定的雜質(zhì)限度下，由于環(huán)氧乙烷和1，4-二氧六環(huán)的對照品溶液濃度較低，兩者的對照溶液進(jìn)樣后峰面積均較小，信噪比低難以達(dá)到儀器的定量限，重復(fù)性和線性較差。因此通過調(diào)整進(jìn)樣分流比至5∶1，實(shí)現(xiàn)了在不提高樣品濃度情況下使目標(biāo)峰可穩(wěn)定達(dá)到儀器檢測限，各雜質(zhì)峰均滿足檢測要求。

Table 4 Content of ethylene glycol, diethylene glycol and triethylene glycol in 8 batches samples

3.2 乙二醇、二甘醇和三甘醇的測定

由于聚西托醇1000的化學(xué)結(jié)構(gòu)和所參考的其他輔料存在一定差異，因此在直接采用參考品種的檢測方法進(jìn)行系統(tǒng)適用性和專屬性分析時(shí)，三甘醇與雜質(zhì)不能有效分離。通過調(diào)整升溫程序，將110 ～170 ℃升溫時(shí)的升溫速率由15 ℃/min 降低到2 ℃/min 進(jìn)而提高三甘醇和雜質(zhì)的分離度，同時(shí)調(diào)整進(jìn)樣分流比至2∶1 以提高信噪比來保證后續(xù)檢測的重復(fù)性。調(diào)整后的方法可使各批次樣品中乙二醇、二甘醇和三甘醇均能良好分離并滿足檢測要求。樣品檢測結(jié)果顯示，部分批次中的3種雜質(zhì)含量較高，具有潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此增加對這3 類雜質(zhì)的檢測對產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有重要意義。

4 總 結(jié)

本研究建立了適用于聚西托醇1000中環(huán)氧乙烷、1，4-二氧六環(huán)、乙二醇、二甘醇和三甘醇等殘留雜質(zhì)的氣相色譜檢測方法，所建立的方法具有良好的專屬性、線性、精密度和回收率，檢測靈敏度高，涵蓋的雜質(zhì)種類多。同時(shí)，本研究還通過測定收集到的8批樣品中的殘留雜質(zhì)，為聚西托醇1000殘留雜質(zhì)的檢測和限度控制提供了參考依據(jù)，為藥用輔料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了理論支撐。