王 慧，勞 曉，黃琳琳，方以誠(chéng)，熊智強(qiáng)，艾連中，宋 馨*

（上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093）

乳酸菌是一類革蘭氏陽(yáng)性、無孢子、G＋C含量低的細(xì)菌，已被歐洲食品安全局認(rèn)證為“可用于食品生產(chǎn)的安全微生物”。乳酸乳球菌（）是研究乳酸菌的模式菌株，成為繼大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌之后最受關(guān)注的外源基因表達(dá)宿主。

相較大腸桿菌，乳酸乳球菌具有單一的外膜，能夠?qū)⒛康牡鞍字苯臃置诘郊?xì)胞外環(huán)境中，且乳酸乳球菌具有獨(dú)特的胞外管家蛋白酶HtrA，僅分泌一種主要的胞外蛋白Usp45，最大限度減少了胞外蛋白水解系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)的降解，更利于蛋白質(zhì)的下游加工，因此作為細(xì)胞工廠被廣泛應(yīng)用，生產(chǎn)具有商業(yè)價(jià)值的異源蛋白，如酶、化合物、抗原、過敏原和細(xì)胞因子等。

穩(wěn)定的載體骨架和高效可控的啟動(dòng)子是保證乳酸乳球菌表達(dá)外源蛋白的關(guān)鍵因素，本文主要介紹了乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)，著重關(guān)注表達(dá)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件üü啟動(dòng)子，詳細(xì)闡述啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)以及啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)與分析，總結(jié)新啟動(dòng)子的克隆方法，最后對(duì)乳酸乳球菌啟動(dòng)子的研究進(jìn)行展望。以期為深入研究啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能并進(jìn)一步在工業(yè)上生產(chǎn)外源蛋白提供參考。

1 乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)

外源基因在乳酸乳球菌中表達(dá)的方法有兩種，一種是將其整合到染色體上，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄表達(dá)；另一種是將攜帶有外源基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌中，通過質(zhì)粒復(fù)制表達(dá)。根據(jù)上述兩種表達(dá)方式，可將乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)分為整合型及游離型。

整合型表達(dá)系統(tǒng)包括基于質(zhì)粒的同源重組系統(tǒng)，基于外源重組酶的單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）重組系統(tǒng)、雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）重組系統(tǒng)等。該類表達(dá)系統(tǒng)不需要篩選壓力，外源基因能夠隨基因組穩(wěn)定傳代并表達(dá)，但外源基因在基因組上往往是單拷貝，因此表達(dá)強(qiáng)度較低。相較于整合型表達(dá)系統(tǒng)，游離型表達(dá)系統(tǒng)能利用獨(dú)立自主復(fù)制的質(zhì)粒載體更簡(jiǎn)捷地表達(dá)外源蛋白。當(dāng)質(zhì)粒載體進(jìn)入乳酸乳球菌中后，通過θ復(fù)制或滾環(huán)復(fù)制方式進(jìn)行自主復(fù)制，目的基因的表達(dá)強(qiáng)度由表達(dá)載體的拷貝數(shù)決定，表達(dá)量會(huì)隨拷貝數(shù)的增加而提高，但游離型表達(dá)系統(tǒng)需要篩選壓力保持穩(wěn)定，且拷貝數(shù)很大時(shí)會(huì)增加載體的不穩(wěn)定性，進(jìn)而影響基因的表達(dá)。

無論是整合型還是游離型表達(dá)系統(tǒng)，目的基因的穩(wěn)定表達(dá)都離不開啟動(dòng)子元件。根據(jù)啟動(dòng)子作用方式及功能，可將乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)分為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)及組成型啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)。

1.1 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子通常驅(qū)動(dòng)細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境相關(guān)基因的表達(dá)，已知許多脅迫乳酸乳球菌啟動(dòng)子的條件因素，如噬菌體感染、溫度或pH值變化、特定的糖等。由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)系統(tǒng)即為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)。

乳酸乳球菌中應(yīng)用最廣泛的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)是由荷蘭國(guó)家乳品研究所開發(fā)的乳酸鏈球菌素誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)（the nisin controlled gene expression system，NICE）。在NICE系統(tǒng)中，位于膜上的組氨酸激酶NisK感知Nisin的誘導(dǎo)信號(hào)并進(jìn)行自身磷酸化，隨后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白NisR上，激活啟動(dòng)子表達(dá)下游基因。Cia?ma等使用NICE系統(tǒng)，在Nisin誘導(dǎo)的P調(diào)控下，在乳酸菌分泌型表達(dá)載體pNZ8124中合成并克隆了人可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡受體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）cDNA（TRAIL-cDNA）。Feizollahzadeh等以攜帶NICE系統(tǒng)的質(zhì)粒pNZ8149和乳酸乳球菌NZ3900分別作為載體和表達(dá)宿主，分泌表達(dá)白細(xì)胞介素-18。

NICE系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）操作簡(jiǎn)便、易于使用；2）可嚴(yán)格控制、誘導(dǎo)高產(chǎn)表達(dá)外源蛋白；3）能減少毒性蛋白的積累、避免細(xì)胞死亡。NICE系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑、宿主菌和載體都是食品級(jí)的，安全可靠，應(yīng)用前景相當(dāng)廣闊。但Nisin的添加成本較高，且在蛋白的生產(chǎn)過程中（尤其是藥用蛋白）需進(jìn)行下游提純。

P170表達(dá)系統(tǒng)是乳酸乳球菌中的另一類誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)，由強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P170控制。P170是通過轉(zhuǎn)座子誘變篩選而獲得的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子調(diào)控未知功能基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)菌生長(zhǎng)至穩(wěn)定期時(shí)，低pH值誘導(dǎo)P170表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而調(diào)控蛋白表達(dá)。與NICE系統(tǒng)相比，P170表達(dá)系統(tǒng)通過生長(zhǎng)過程中乳酸的積累實(shí)現(xiàn)自我誘導(dǎo)，利于下游蛋白的純化，該表達(dá)系統(tǒng)已廣泛用于乳酸乳球菌的工業(yè)生產(chǎn)中。雖然該系統(tǒng)的啟動(dòng)子是一個(gè)強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，但其適宜運(yùn)作的pH值范圍較狹窄，僅當(dāng)pH 5.5時(shí)才能夠強(qiáng)烈轉(zhuǎn)錄。此外，該系統(tǒng)受培養(yǎng)溫度影響較大，溫度低時(shí)活性更強(qiáng)。

當(dāng)培養(yǎng)基中鋅含量豐富時(shí)，乳酸乳球菌操縱子中的阻遏物與啟動(dòng)子P結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄，而缺鋅會(huì)導(dǎo)致失活，使得RNA聚合酶與P結(jié)合并進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄，研究者依此建立了P誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。它基于乳酸乳球菌操縱子，該操縱子編碼緊急Zn吸收ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其調(diào)控因子，而Zn可以抑制該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。當(dāng)外源添加乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）時(shí)，EDTA減少了培養(yǎng)基中的可用鋅，誘導(dǎo)P啟動(dòng)，從而激活緊急攝取系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄。雖然通過EDTA可以耗盡Zn從而實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)，但這會(huì)阻礙需要陽(yáng)離子的酶的過表達(dá)。

此外，鋅離子濃度調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng)（zinc-regulated expression system，Zirex）由肺炎鏈球菌P及其編碼調(diào)控蛋白SczA組成，將Nisin誘導(dǎo)的啟動(dòng)子與鋅誘導(dǎo)的啟動(dòng)子P結(jié)合，使不同基因在同一乳酸菌細(xì)胞中分別以Nisin和ZnSO為誘導(dǎo)劑，同時(shí)獨(dú)立表達(dá)。該系統(tǒng)有利于活性依賴Zn的羊毛硫肽環(huán)化酶及其他金屬酶的過表達(dá)。

除以上所述，乳酸乳球菌誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)還包括熱休克誘導(dǎo)系統(tǒng)、壓力誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)（stress-inducible controlled expression，SICE）、木糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)（xylose-inducible expression system，XIES）、噬菌體?31爆發(fā)式誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)、胍丁胺控制表達(dá)系統(tǒng)（agmatine-controlled expression，ACE）等。但這些系統(tǒng)大多實(shí)用價(jià)值不高，因?yàn)樗鼈冎荒茉谟邢薹秶鷥?nèi)可控，效率較低。具體表現(xiàn)在：1）相應(yīng)的誘導(dǎo)劑是必需的營(yíng)養(yǎng)物或代謝物，其在培養(yǎng)物中的濃度無法完全控制；2）對(duì)分解代謝物的抑制非常敏感（如某些糖誘導(dǎo)系統(tǒng)）；3）誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子活性會(huì)降低；4）操作過程復(fù)雜繁瑣。目前最廣泛使用和最有效的基因表達(dá)系統(tǒng)依然是NICE系統(tǒng)。

1.2 組成型啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)

許多已鑒定的啟動(dòng)子不受任何調(diào)節(jié)劑或生長(zhǎng)條件的控制，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平通常恒定在一定水平上，具有無時(shí)空特異性的特點(diǎn)，被稱為組成型啟動(dòng)子。在乳酸乳球菌中，已鑒定出一些組成型啟動(dòng)子，如P、P、P、P以及P、P、P、P，目前已被廣泛應(yīng)用于乳酸乳球菌中表達(dá)外源基因（表1）。

表1 組成型啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)異源蛋白Table 1 Constitutive promoters regulating the expression of heterologous proteins

盡管組成型啟動(dòng)子成本較低、易于使用且不受培養(yǎng)基的限制，但與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子相比，其表達(dá)強(qiáng)度不高。因此，篩選強(qiáng)組成型啟動(dòng)子成為近年的研究熱點(diǎn)。

2 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)

啟動(dòng)子作為表達(dá)系統(tǒng)的一個(gè)重要元件，對(duì)基因的高水平表達(dá)起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。

原核生物啟動(dòng)子長(zhǎng)度約20～200 bp，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（transcription start site，TSS）上游200 bp到下游100 bp為啟動(dòng)子的保守區(qū)域。對(duì)于典型的原核啟動(dòng)子，其保守區(qū)域包括TSS、-35區(qū)（Sextama框）、-10區(qū)（Pribnow框）以及間隔區(qū)（指在-10區(qū)和-35區(qū)之間的序列）（圖1）。

幾乎所有的啟動(dòng)子TSS上游10 bp處都有一個(gè)6 bp的保守序列（TATAAT），即-10區(qū)。另外一個(gè)6 bp的保守區(qū)域位于-35區(qū)，序列為TTGACA，其堿基的保守性較-10區(qū)低。研究發(fā)現(xiàn)，替換-10區(qū)內(nèi)序列比替換-35區(qū)內(nèi)序列對(duì)啟動(dòng)子活性影響更大。然而，相較于間隔區(qū)域的距離差異，序列構(gòu)成并不重要，間隔太小或太大均會(huì)不同程度地影響啟動(dòng)子活性。-35區(qū)和-10區(qū)間的最佳間隔序列為17 bp，也可能小于15 bp或者大于20 bp。另外，-10區(qū)延伸序列、-35區(qū)上游的UP元件、-10區(qū)與TSS的間隔序列等非典型元件都對(duì)啟動(dòng)子的活性有影響（圖1）。

圖1 原核啟動(dòng)子核心保守序列Fig.1 Conserved core sequences of prokaryotic promoters

在基因轉(zhuǎn)錄過程中RNA聚合酶具有重要作用，它能特異性識(shí)別啟動(dòng)子并與之結(jié)合，隨后轉(zhuǎn)錄才能開始。啟動(dòng)子與RNA聚合酶的親和力越高，啟動(dòng)子活性越高，基因的表達(dá)水平越高。RNA聚合酶由5個(gè)亞基構(gòu)成，分別為亞基、亞基、’亞基、亞基和Sigma（σ）因子。σ因子能使RNA聚合酶核心酶識(shí)別和結(jié)合到啟動(dòng)子的TSS上，決定了RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子序列的特異性，在基因轉(zhuǎn)錄過程中起著關(guān)鍵作用。

核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosome binding site，RBS）是位于起始密碼子AUG上游的一段富含嘌呤的DNA序列（AGGAGG），也稱作Shine-Dalgarno（SD）序列。該序列能識(shí)別核糖體16S rRNA并與之進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，促使mRNA與核糖體結(jié)合，從而促進(jìn)翻譯的起始。目前，并沒有研究揭示乳酸乳球菌的RBS序列，但有研究者假定乳酸乳球菌載體pTRKH的RBS序列為“AAGGAGGT”，通過改變pTRKH質(zhì)粒repDE操縱子的RBS序列來修飾pAMβ1復(fù)制子的拷貝數(shù)，從而影響核糖體與mRNA結(jié)合的強(qiáng)度，并最終影響復(fù)制起始蛋白R(shí)epE的產(chǎn)生。

乳酸乳球菌作為典型的原核生物，其啟動(dòng)子序列遵循原核啟動(dòng)子的特點(diǎn)。在乳酸乳球菌的啟動(dòng)子中，大多包含-35區(qū)及-10區(qū)保守序列，與大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的啟動(dòng)子相似。此外，大約一半的乳酸乳球菌啟動(dòng)子包含一個(gè)-10區(qū)延伸序列，該延伸序列經(jīng)常出現(xiàn)在革蘭氏陽(yáng)性菌的啟動(dòng)子中。目前，對(duì)乳球乳酸菌σ因子的研究較少，僅鑒定出一個(gè)σ因子（σ），由基因編碼。σ與來自枯草芽孢桿菌的σ和來自大腸桿菌的σ具有高度的相似性，表明σ能夠識(shí)別并結(jié)合到-35區(qū)序列“TTGACA”和-10區(qū)序列“TATAAT”上。然而，目前尚不清楚缺乏-35區(qū)的啟動(dòng)子是否被σ識(shí)別，或者其他可能存在的σ因子是否參與乳酸乳球菌中啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。

3 啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)及分析

由于啟動(dòng)子在基因轉(zhuǎn)錄中的重要作用，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)啟動(dòng)子位點(diǎn)成為基因表達(dá)、模型解釋以及建立和理解遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的必要步驟。為獲得可能的啟動(dòng)子序列，研究者們通過對(duì)啟動(dòng)子序列堿基偏好、局部保守模塊信息以及啟動(dòng)子空間構(gòu)象特征、能量分布特征等的研究，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，開發(fā)有效的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)工具。

早期，啟動(dòng)子序列的預(yù)測(cè)僅基于各生物特有的核苷酸序列，缺乏足夠大的已知基因樣本庫(kù)，進(jìn)而會(huì)產(chǎn)生不準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)結(jié)果。此外，一些基因預(yù)測(cè)方法是基于兩個(gè)或多個(gè)基因組之間的同源性，對(duì)于沒有同源性的菌株，這些方法并不適用。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)在所有類型的啟動(dòng)子中，最突出的特征是上游和下游區(qū)域的DNA雙鏈穩(wěn)定性不同，并提出了一種基于啟動(dòng)子和非啟動(dòng)子區(qū)域之間DNA序列穩(wěn)定性差異的原核啟動(dòng)子預(yù)測(cè)方法。利用DNA的物理特性預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的方法逐漸受到了廣泛的關(guān)注，SEPro是一種通過研究和利用DNA序列的內(nèi)置結(jié)構(gòu)和能量信息而開發(fā)的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)工具，適用于包括古細(xì)菌在內(nèi)的所有原核生物。表2列出了部分原核生物啟動(dòng)子預(yù)測(cè)工具。

表2 原核生物啟動(dòng)子在線預(yù)測(cè)軟件Table 2 Online prediction software for prokaryotic promoters

現(xiàn)有的預(yù)測(cè)軟件大多依據(jù)典型模式生物數(shù)據(jù)庫(kù)建立，例如革蘭氏陰性菌啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件依據(jù)大腸桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)建立，革蘭氏陽(yáng)性菌啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件依據(jù)枯草芽孢桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)建立。BacPP能夠在線預(yù)測(cè)革蘭氏陰性菌的啟動(dòng)子，其通過識(shí)別革蘭氏陰性菌給定序列的σ因子以預(yù)測(cè)可能的啟動(dòng)子序列。

除對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)外，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（transcription factor binding site，TFBS）等的預(yù)測(cè)分析同樣具有重要意義。用戶能利用在線搜索工具Virtual Footprint通過全基因組搜索以交互方式識(shí)別可能的TFBS，并立即獲得有關(guān)啟動(dòng)子、相應(yīng)基因、操縱子和編碼蛋白的詳細(xì)信息。用于預(yù)測(cè)原核生物啟動(dòng)子元件和調(diào)節(jié)子的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器PePPER，可在任何測(cè)序的細(xì)菌基因組中挖掘調(diào)控子和TFBS，研究者也借此建立了乳酸乳球菌TFBS數(shù)據(jù)庫(kù)。

4 乳酸乳球菌啟動(dòng)子的克隆

從乳酸乳球菌和其他乳酸菌中分離克隆啟動(dòng)子的策略有很多，主要分為啟動(dòng)子探針質(zhì)粒載體篩選法和克隆法。

4.1 啟動(dòng)子探針質(zhì)粒載體篩選法

啟動(dòng)子探針載體是指無啟動(dòng)子，攜帶報(bào)告基因、抗性標(biāo)記和轉(zhuǎn)錄終止子的克隆載體。啟動(dòng)子探針質(zhì)粒載體法是一種簡(jiǎn)單有效而且精準(zhǔn)的篩選啟動(dòng)子的方法。篩選分離啟動(dòng)子時(shí)，用合適的限制性內(nèi)切酶來消化相應(yīng)的基因組DNA，啟動(dòng)子探針載體也同時(shí)用相同的酶進(jìn)行酶切處理，然后，將酶切處理好的基因組片段和相同方式處理的啟動(dòng)子探針連接重組，使克隆的片段恰好插在報(bào)告基因的上游位置，根據(jù)報(bào)告基因的表達(dá)與否、表達(dá)的強(qiáng)弱來確定啟動(dòng)子的篩選情況。

在構(gòu)建探針質(zhì)粒載體中，報(bào)告基因的選取至關(guān)重要，一般要求報(bào)告基因序列已知，目的蛋白特征清晰，檢測(cè)方便快捷，且在宿主中表達(dá)時(shí)不存在背景干擾。啟動(dòng)子研究中最常用的報(bào)告基因大多是編碼抗生素抗性蛋白的基因，除此之外，還有編碼氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、-半乳糖苷酶或-葡萄糖醛酸酶的基因以及熒光蛋白基因等。

利用啟動(dòng)子探針載體法無需具體的基因核苷酸序列，不用設(shè)計(jì)引物即可隨機(jī)篩選分離得到大量的啟動(dòng)子，簡(jiǎn)單輕松，但這種方法需要先構(gòu)建一個(gè)啟動(dòng)子探針載體，且后續(xù)篩選工作量較大，既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，因此主要在早期的啟動(dòng)子篩選克隆工作中應(yīng)用較多。

4.2 克隆法

對(duì)于已知序列的啟動(dòng)子，可以設(shè)計(jì)序列特異性引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)克隆獲得基因的啟動(dòng)子序列。該方法結(jié)合了生物信息學(xué)技術(shù)和PCR技術(shù)，先用計(jì)算機(jī)相關(guān)軟件對(duì)基因序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，然后利用PCR技術(shù)獲取已知序列中的啟動(dòng)子，該方法已逐漸成為獲取啟動(dòng)子的主要手段。

利用PCR技術(shù)獲得啟動(dòng)子的速度快、特異性強(qiáng)，避免了DNA本身連接和環(huán)化的問題，但其對(duì)啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)和分析要求比較精準(zhǔn)。

5 結(jié) 語(yǔ)

近年來，研究者通過建立有效的乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)高效生產(chǎn)異源蛋白，并將其應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等行業(yè)。相比于傳統(tǒng)的大腸桿菌系統(tǒng)，對(duì)乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后。

在進(jìn)一步發(fā)展和完善乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，完善和擴(kuò)大乳酸乳球菌載體系統(tǒng)和宿主系統(tǒng)是研究的重點(diǎn)，而在載體系統(tǒng)的改造過程中，啟動(dòng)子調(diào)控元件是重中之重。未來的研究方向主要有：1）對(duì)乳酸乳球菌啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)進(jìn)行更深入全面的研究，包括其σ因子、核糖體起始位點(diǎn)序列、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)等；2）現(xiàn)有的概念框架尚不足以完全理解啟動(dòng)子信號(hào)的性質(zhì)，應(yīng)開發(fā)針對(duì)乳酸乳球菌的模型或理論來解釋與啟動(dòng)子相關(guān)的蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子及配體等在轉(zhuǎn)錄過程中的結(jié)構(gòu)及能量變化；3）提供準(zhǔn)確的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)對(duì)于理解啟動(dòng)子及RNA聚合酶如何進(jìn)行轉(zhuǎn)錄過程十分重要，應(yīng)將實(shí)驗(yàn)與計(jì)算預(yù)測(cè)相結(jié)合，以獲得精準(zhǔn)有效的預(yù)測(cè)工具。

啟動(dòng)子的研究主要集中在兩個(gè)方面：1）新型高效可控強(qiáng)啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)是滿足工業(yè)生產(chǎn)高要求的最佳措施；2）對(duì)現(xiàn)有啟動(dòng)子的改造。啟動(dòng)子是控制目的基因表達(dá)的開關(guān)，對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行精確的定位，闡明其各部分元件的工作原理及意義，有針對(duì)性地加以改造，可使啟動(dòng)子利用效率最大化。

從啟動(dòng)子出發(fā)，篩選新的強(qiáng)啟動(dòng)子元件，構(gòu)建成熟高效的乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)，無論是在理論研究還是實(shí)際生產(chǎn)中都有十分重要的意義。