岳文秀，吳璐璐，韓富亮,2,3,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)合陽葡萄試驗(yàn)示范站，陜西 合陽 715300）

腸道菌群是人體胃腸道內(nèi)微生物的統(tǒng)稱，主要由細(xì)菌組成，也包括少量古細(xì)菌、病毒（主要是噬菌體）和真核生物（主要是酵母菌）。健康成年人的腸道中存在約10個(gè)微生物，主要屬于厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia），其中Firmicutes和Bacteroidetes是優(yōu)勢菌群，占細(xì)菌總量的90%以上。

正常情況下，腸道菌群處于動態(tài)平衡，與人體免疫系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)形成復(fù)雜的共生關(guān)系，直接或間接影響宿主健康。但是該平衡可被多種因素打破，造成菌群失調(diào)。菌群失調(diào)與代謝性疾病、免疫性疾病以及精神類疾病密切相關(guān)。飲食是造成菌群失調(diào)最主要的因素之一。改變飲食結(jié)構(gòu)可直接影響腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而通過腸-肝軸、腸-腦軸等多種途徑間接影響宿主健康。

花色苷是一類具有苯并吡喃結(jié)構(gòu)的類黃酮化合物，廣泛存在于自然界。紅葡萄酒中含有豐富的花色苷。年輕的歐亞種紅葡萄酒中游離的花色苷質(zhì)量濃度可達(dá)2 000 mg/L，以二甲花翠素-3--葡萄糖苷含量最多。人體飲用葡萄酒后，葡萄酒花色苷主要在結(jié)腸中被腸道菌群代謝吸收。目前多酚類物質(zhì)的益生功能已在多種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械玫阶C實(shí)，例如原花青素可通過影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)和多樣性顯著改善高脂飲食造成的小鼠肥胖，但是關(guān)于葡萄酒花色苷對腸道菌群的影響尚不明晰。

本研究采用體外方法將葡萄酒花色苷與腸道菌群共培養(yǎng)，分析花色苷在消化吸收過程中對腸道菌群結(jié)構(gòu)、多樣性及功能的影響，為進(jìn)一步研究花色苷的生理活性功能提供理論基礎(chǔ)，為提高葡萄酒的營養(yǎng)價(jià)值和促進(jìn)葡萄酒健康飲用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣為來自新疆的赤霞珠紅葡萄酒（2015年），酒樣中還原糖、總酸、揮發(fā)酸、總硫、游離硫、總酚質(zhì)量濃度和酒精度具體數(shù)值見表1。

表1 酒樣基本理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical properties of the wine sample tested in this study

十二水合磷酸氫二鈉、氯化鉀、LA0740-250g厭氧培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、磷酸二氫鈉廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司；厭氧混合氣體（10%H、10% CO和80% N）、高純氮?dú)狻⒁旱?楊凌建一工業(yè)氣體供應(yīng)站；乙腈（色譜純）、甲酸（色譜級）、乙酸（色譜級） 楊凌天成化玻站；二甲花翠素-3--葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%） Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YQX-II厭氧培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州安泰氣體技術(shù)有限公司；TGL-18M離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SX-500高壓滅菌鍋 日本TOMY公司；KQ-250DE超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀和AUX320分析天平 日本島津公司；FD-1C-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜法檢測葡萄酒花色苷

參照Yang Ping等的方法并稍作修改。取酒樣1.5 mL經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，直接進(jìn)行高效液相色譜分析。流動相A：（水）∶（乙腈）∶（甲酸）＝32∶10∶5；流動相B：（水）∶（乙腈）∶（甲酸）＝20∶20∶5。色譜柱：Kromasil 100-5-C（250 mmh4.6 mm，5 μm）；梯度洗脫程序：0～15 min，0～10% B；15～30 min，10%～20% B；30～45 min，20%～35% B；45～46 min，35%～100% B；50～51 min，100%～0 B；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長520 nm；進(jìn)樣量20 μL。花色苷定量分析采用外標(biāo)法，所有花色苷質(zhì)量濃度表示為二甲花翠素-3--葡萄糖苷當(dāng)量。

1.3.2 腸道菌群培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)當(dāng)天收集健康志愿者（1 名）（腸道狀態(tài)良好，至少3個(gè)月未服用過抗生素相關(guān)藥物）的糞便，立即稱質(zhì)量。在厭氧培養(yǎng)箱中，糞便樣品與磷酸鹽緩沖液（0.24 g/L KHPO、1.44 g/L NaHPO、8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl）按照1∶9（/）的比例混合均勻，紗布過濾，濾液在5 000 r/min、37 ℃條件下離心5 min。上清液與已滅菌的厭氧培養(yǎng)基以1∶9（/）的比例混合，37 ℃恒溫避光厭氧無菌條件下培養(yǎng)24 h，模擬人體腸道環(huán)境。

1.3.3 模擬消化葡萄酒花色苷和二甲花翠素-3--葡萄糖苷

將赤霞珠紅葡萄酒冷凍干燥至粉末。在厭氧培養(yǎng)體系中加入粉末狀酒樣，葡萄酒花色苷的質(zhì)量濃度分別為42.14、21.07 mg/L和10.54 mg/L，依次設(shè)為高濃度組（A組）、中濃度組（B組）、低濃度組（C組），其中對照組不加酒樣（D組），37 ℃厭氧避光培養(yǎng)24 h。在0、4、12、24 h時(shí)取樣5 mL，于3 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min。取離心沉淀物，液氮速凍后放于－80 ℃冰箱暫存，用于16S rRNA測序。

在厭氧培養(yǎng)體系中加入二甲花翠素-3--葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量濃度分別為50 mg/L和10 mg/L，依次設(shè)為高濃度組（E組）和低濃度組（F組），其中對照組不加標(biāo)準(zhǔn)品（D組），于37 ℃厭氧避光培養(yǎng)24 h。取樣時(shí)間、取樣量和樣品處理方式與模擬消化葡萄酒花色苷一致。

1.3.4 腸道菌群多樣性分析

試劑盒提取DNA，檢測樣本濃度質(zhì)量合格后，選取腸道菌群基因組16S rRNA V3＋V4區(qū)作為擴(kuò)增區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增建庫。建庫測序工作由北京百邁客生物科技有限公司負(fù)責(zé)。使用Usearch軟件對序列在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類，獲得分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）。對OTU進(jìn)行豐度分析和Alpha多樣性（包括Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage指數(shù)）計(jì)算，獲得樣本物種豐富度和均勻度信息。Chao1指數(shù)按照式（1）計(jì)算。

式中：為Chao1指數(shù)；為實(shí)際觀測到的OUT數(shù)目；為只含有一條序列的OUT數(shù)目；為只含有兩條序列的OUT數(shù)目。

ACE指數(shù)按照式（2）～（5）計(jì)算。

式中：為ACE指數(shù)；為多于“abund”條序列的OUT數(shù)目；為含有“abund”條序列或者少于“abund”的OUT數(shù)目；為表示所有低豐度（出現(xiàn)≤10 次）的物種中非singleton的比例；為只含有一條序列的OUT數(shù)目；為稀有物種變異系數(shù)的估算值；n為含有條序列的OUT數(shù)目；為稀有（豐度閾值小于或等于）物種數(shù)；、分別為1和0，表示群落中大于0的物種數(shù)。

Shannon指數(shù)按照式（6）計(jì)算。

式中：為Shannon指數(shù)；為實(shí)際觀測到的OUT數(shù)目；n為含有條序列的OUT數(shù)目；為所有序列數(shù)。

Simpson指數(shù)按照式（7）計(jì)算。

式中：為Simpson指數(shù)；為實(shí)際觀測到的OUT數(shù)目；n為含有條序列的OUT數(shù)目；為所有序列數(shù)。

Coverage指數(shù)按照式（8）計(jì)算。

式中：為Coverage指數(shù)；為含有一條序列的OUT數(shù)目；為所有序列數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPASS 20.0進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)采用Duncan’s多重比較檢驗(yàn)，＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒樣中花色苷的種類分析

本實(shí)驗(yàn)酒樣中，高效液相色譜儀共檢測到9種花色苷，分別為花翠素-3--葡萄糖苷、花青素-3--葡萄糖苷、甲基花翠素-3--葡萄糖苷、甲基花青素-3--葡萄糖苷、二甲花翠素-3--葡萄糖苷、甲基花青素-3--乙?；?葡萄糖苷、二甲花翠素-3--乙?；?葡萄糖苷、甲基花青素-3--香豆?；?葡萄糖苷和二甲花翠素-3--香豆?；?葡萄糖苷。花色苷總質(zhì)量濃度為150.51 mg/L，其中二甲花翠素-3--葡萄糖苷質(zhì)量濃度最高（84.28 mg/L），占總花色苷的56.00%。?；ㄉ罩校谆ù渌?3--乙?；?葡萄糖苷質(zhì)量濃度最高（29.94 mg/L），占總花色苷的19.89%。

2.2 葡萄酒花色苷對腸道菌群的影響

2.2.1 Alpha多樣性

Alpha多樣性反映單個(gè)樣品物種豐富度及物種多樣性，有多個(gè)衡量指標(biāo)：ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage指數(shù)。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)用于評價(jià)菌群豐度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性。ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)越高，Simpson指數(shù)越低，樣本物種多樣性越高。Coverage指數(shù)為各樣文本庫的覆蓋率，其數(shù)值越接近1，表明樣本測序結(jié)果越符合真實(shí)情況。表2為各組樣本的Alpha多樣性指數(shù)?？梢钥闯觯? 組樣本的Coverage指數(shù)都接近1，說明測序結(jié)果可以代表樣本的真實(shí)情況。培養(yǎng)24 h后，高濃度和中濃度組的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)均顯著高于對照組（＜0.05），且Simpson指數(shù)顯著低于對照組（＜0.05）。表明葡萄酒花色苷能增加腸道菌群的物種多樣性和豐富度，且高濃度和中濃度處理效果更好，呈現(xiàn)一定濃度效應(yīng)。該結(jié)果與le Roy等的研究結(jié)果一致，即適當(dāng)飲用紅酒可以增加人體腸道菌群的Alpha多樣性。

表2 葡萄酒花色苷對腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)的影響Table 2 Effect of wine anthocyanins on alpha diversity indices of intestinal bacteria

2.2.2 門水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)組分分析

如圖1所示，腸道菌群主要由Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobacteria組成，優(yōu)勢菌群為Proteobacteria和Bacteroidetes。這與先前報(bào)道的成年人群腸道菌群的主要組成一致。除Proteobacteria和Bacteroidetes外，處理組中其他菌門的平均總占比為55%左右，遠(yuǎn)高于對照組（低于30%），表明葡萄酒花色苷能有效增加腸道菌群物種多樣性。

圖1 門水平腸道菌群相對豐度柱狀圖Fig.1 Histogram of relative abundance of intestinal microbiota at phylum level

24 h時(shí)，高濃度組厚壁菌門/擬桿菌門的比值（Firmicutes/Bacteroidetes，F(xiàn)/B）顯著低于對照組（＜0.05）（圖2A）。0～24 h，高濃度組的F/B值從0.94降低至0.63，降幅達(dá)32.98%；而對照組的F/B值從0.30上升至1.64。中濃度和低濃度組F/B值與對照組變化趨勢一致。F/B值過高與高脂飲食有關(guān)，且該比值與肥胖發(fā)生率呈正相關(guān)，被作為肥胖的有效生物標(biāo)記指標(biāo)。這表明較高濃度的葡萄酒花色苷可以調(diào)節(jié)宿主脂質(zhì)代謝，有一定減脂減肥功能。

高濃度組樣品的放線菌相對豐度在24 h內(nèi)由16.58%降低至14.95%，降幅為9.83%（圖2B）；對照組樣品的放線菌相對豐度在24 h內(nèi)由2.14%降低至0.46%，降幅為78.50%。由此可以看出，紅葡萄酒中的花色苷可以減緩放線菌相對豐度降低的速度。

圖2 門水平腸道菌群相對豐度變化Fig.2 Change in relative abundance of intestinal microbiota at phylum level

2.2.3 屬水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)組分分析

如圖3所示，對照組和處理組的腸道菌群主要由擬桿菌屬（）、大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬（）、副桿菌屬（）、韋榮球菌屬（）、鏈球菌屬（）、毛螺菌屬（）、考拉桿菌屬（）和普拉梭桿菌（）組成。

圖3 屬水平腸道菌群分布柱狀圖Fig.3 Histogram of relative abundance of intestinal microbiota at genus level

培養(yǎng)24 h后，高濃度組中和的相對豐度均顯著低于對照組（＜0.05）。0～24 h，高濃度組的相對豐度由1.07%降低至0.36%，降幅為66.36%（圖4A）；的相對豐度由0.18%降低至0.12%，降幅為33.33%（圖4B）。而對照組中這兩種菌的相對豐度均增加。是一種腸道致病菌，在某些條件下也可致病。二者均會導(dǎo)致糖尿病患者病情的惡化?；ㄉ湛赡芡ㄟ^破壞細(xì)菌細(xì)胞膜/細(xì)胞壁，促使其裂解死亡，從而抑制致病菌的生長。

圖4 屬水平腸道菌群相對豐度變化Fig.4 Change in relative abundance of intestinal microbiota at genus level

高濃度組和中濃度組乳桿菌屬（）的相對豐度在0～4 h增加，24 h時(shí)相對豐度均顯著高于對照組（＜0.05）（圖4C）。對照組梭桿菌屬（）的相對豐度在0～24 h由6.26%降低至0.40%，減少了93.61%，高濃度處理組的相對豐度由1.15%降低至0.18%，減少了84.35%（圖4D）。是一種腸道益生菌，可利用精氨酸產(chǎn)生-鳥氨酸來促進(jìn)腸黏膜形成，調(diào)節(jié)腸道黏膜穩(wěn)態(tài)。而是已知的下唯一物種，除了能夠?qū)⑸攀忱w維分解產(chǎn)生丁酸鹽和其他短鏈脂肪酸，為腸上皮細(xì)胞提供能量外，還具有抗炎功能。高濃度葡萄酒花色苷處理減緩了和相對豐度的下降趨勢，可能是由于乳桿菌屬、雙歧桿菌屬等益生菌可以通過編碼多種葡萄糖苷酶代謝花色苷，并以花色苷釋放的葡萄糖苷作為營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)自身增殖。與該結(jié)果類似，枸杞花色苷、越橘花色苷也能調(diào)節(jié)腸道菌群，提高、、和的相對豐度，降低和的比例。由此可推測，葡萄酒花色苷具有促進(jìn)腸道有益菌增殖、抑制致病菌生長的潛力。

2.2.4 基因預(yù)測分析

圖5為腸道菌群功能基因豐度圖。在新陳代謝方面，處理組在氨基酸代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝、輔助因子和維生素代謝以及外源性物質(zhì)的降解與代謝方面有明顯優(yōu)勢；對照組在碳水化合物代謝方面有明顯優(yōu)勢。在遺傳信息處理方面，高濃度組在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)化以及蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸和降解方面優(yōu)于對照組；中濃度組在轉(zhuǎn)化方面優(yōu)于對照組。在環(huán)境信息處理方面，低濃度組更加具有優(yōu)勢。

圖5 京都基因與基因組百科全書分類柱狀圖Fig.5 Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis

2.3 二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷對腸道菌群的影響

2.3.1 Alpha多樣性

如表3所示，高濃度組的Chao1指數(shù)顯著高于對照組（＜0.05），ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)也均高于對照組。低濃度組的Alpha多樣性指數(shù)與對照組接近。該結(jié)果與葡萄酒花色苷基本一致，即較高濃度的花色苷標(biāo)準(zhǔn)品比低濃度更能增加樣本物種的豐富度和多樣性，表現(xiàn)出濃度依賴性。這表明葡萄酒花色苷混合物對腸道菌群多樣性的影響可能主要是由于二甲花翠素-3--葡萄糖苷的存在。相較于葡萄酒花色苷，花色苷標(biāo)準(zhǔn)品對Alpha多樣性指數(shù)的影響程度整體較低，或許是葡萄酒花色苷中存在基質(zhì)效應(yīng)，因?yàn)槠咸丫浦猩倭康奶?、酸以及多酚物質(zhì)也可對腸道菌群的多樣性產(chǎn)生影響。

表3 二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷對腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)的影響Table 3 Effect of wine malvidin-3-O-glucoside on alpha diversity indices of intestinal microbiota

2.3.2 門水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)組分分析

根據(jù)門水平下的物種分布柱狀圖可知（圖6），樣品的腸道菌群主要由Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria組成，優(yōu)勢菌群為Firmicutes和Bacteroidetes。

圖6 門水平腸道菌群豐度柱狀圖Fig.6 Relative abundance of intestinal microbiota at phylum level

如圖7所示，高濃度組的F/B值在24 h內(nèi)從4.17降低至1.65，降幅為60.43%；對照組的F/B值在24 h內(nèi)從1.65上升至1.94。24 h時(shí)，高濃度組的F/B值低于對照組，Actinobacteria的相對豐度高于對照組，但差異均不顯著（＜0.05）。該結(jié)果與葡萄酒花色苷處理的結(jié)果基本一致，即較高濃度的花色苷在降低F/B值、促進(jìn)Actinobacteria增殖方面效果更好。

圖7 門水平腸道菌群相對豐度變化Fig.7 Change in relative abundance of intestinal microbiota at phylum level

2.3.3 屬水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)組分分析

如圖8所示，在屬的水平上，3 組樣品中腸道菌群豐度前10的物種為擬桿菌屬（）、大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬（）、挑剔真桿菌（[]__）、梭狀芽胞桿菌（___）、克雷伯氏菌（）、普拉梭桿菌（）、鏈球菌屬（）、考拉桿菌屬（）、乳桿菌屬（）、副擬桿菌（）。

圖8 屬水平腸道菌群分布柱狀圖Fig.8 Histogram of relative abundance of intestinal microbiota at genus level

高濃度組的相對豐度在0～4 h從7.45%上升至14.60%，在4～24 h從14.60%降低至4.70%（圖9A）。對比0 h和24 h的相對豐度，高濃度組的共降低了36.91%。對照組的相對豐度在0～24 h一直降低，從10.40%降低至5.32%，共降低了48.85%。在0～4 h內(nèi)高濃度組的相對豐度由2.28%上升到2.42%，在4～12 h由2.42%降低至0.73%，共降低了67.98%。對照組的相對豐度在0～24 h內(nèi)一直降低，由3.71%降低至0.51%，共降低了86.25%（圖9B）。表明在營養(yǎng)充足的條件下，高濃度二甲花翠素-3--葡萄糖苷可以促進(jìn)這兩種菌的生長。參與人體糖代謝，具有治療糖尿病和胰島素抵抗的潛力。

圖9 屬水平腸道菌群相對豐度變化Fig.9 Change in relative abundance of intestinal microbiota at genus level

2.3.4 基因預(yù)測分析

在新陳代謝方面，高濃度組在氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝有優(yōu)勢，低濃度組在脂質(zhì)代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、核苷酸代謝方面有優(yōu)勢（圖10）。在遺傳信息處理方面，處理組在轉(zhuǎn)化、復(fù)制和修復(fù)方面更有優(yōu)勢。在環(huán)境信息處理方面，高濃度組在膜運(yùn)輸方面更有優(yōu)勢。

圖10 KEGG分類柱狀圖Fig.10 KEGG pathway analysis

3 結(jié) 論

葡萄酒中的花色苷具有增加腸道菌群多樣性、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用。具體表現(xiàn)為可以促進(jìn)Bacteroidetes和Actinobacteria的生長，抑制Firmicutes生長；同時(shí)促進(jìn)乳桿菌和梭桿菌等益生菌生長，抑制和等致病菌的增殖，提高人體腸道的新陳代謝能力。

二甲花翠素-3--葡萄糖苷對和的生長有促進(jìn)作用，這兩種有益菌均有助于改善糖脂代謝紊亂。二甲花翠素-3--葡萄糖苷作為葡萄酒中含量最高的花色苷，同樣具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，它或許是葡萄酒花色苷可以調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)的主要原因。

葡萄酒花色苷和二甲花翠素-3--葡萄糖苷對腸道菌群的影響均具有濃度效應(yīng)，濃度越高，對腸道菌群的影響時(shí)間越長，效果越明顯。因此，葡萄酒花色苷或可通過調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成部分發(fā)揮抑制肥胖和高血脂、改善糖尿病和調(diào)節(jié)腸道炎癥等生理活性功能。