張 濤，陳艷紅,2,3,4,*，常高萍，楊遠(yuǎn)帆,2,3,4，杜希萍,2,3,4,*，姜澤東,2,3,4，倪 輝,2,3,4，李清彪,2,3,4

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021；3.廈門(mén)市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361021；4.廈門(mén)南方海洋研究中心海藻資源化利用與深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021）

阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是一種以記憶力喪失、認(rèn)知能力下降為主要特征，并伴有不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)元喪失的神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于65歲以上老人。2020年全球AD患者5 200萬(wàn)以上，預(yù)計(jì)2050年AD患者將增至1.52億。因此，AD已經(jīng)是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，不僅給患者及其家庭帶來(lái)巨大精神負(fù)擔(dān)，也給社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)壓力。乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）作為生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵酶，能催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸，從而阻斷神經(jīng)信號(hào)的傳遞。所以AChE活力升高會(huì)導(dǎo)致乙酰膽堿水平降低，而乙酰膽堿水平降低是AD的關(guān)鍵病因，因此抑制AChE活力、提高乙酰膽堿水平是治療AD的重要方法。目前美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療AD的乙酰膽堿酯酶抑制劑（acetylcholinesterase inhibitor，AChEI）主要有他克林、多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏。除加蘭他敏外，大多數(shù)為合成藥物，雖然有一定的治療效果，但具有頭暈、失眠、惡心、輕度腹瀉等不同程度的副作用，不適于患者長(zhǎng)期使用。因此，尋求高效低毒、適宜患者長(zhǎng)期使用的天然來(lái)源AChEI對(duì)治療AD具有重要的意義。

研究表明，氧化應(yīng)激是AD病理機(jī)理的一個(gè)組成部分，減輕氧化應(yīng)激對(duì)預(yù)防AD至關(guān)重要，因此具有抗氧化和AChE抑制活性的天然化合物對(duì)于預(yù)防和治療AD起著舉足輕重的作用。海膽酮（-胡蘿卜素-4-酮）是一種酮式類胡蘿卜素，由4個(gè)異戊二烯單元以共軛雙鍵的形式連接，首尾兩端則各連接一個(gè)紫羅蘭酮環(huán)，其中一個(gè)紫羅蘭酮環(huán)上的氫被酮基取代，主要從海膽及藻類等海洋生物中提取。Miller等報(bào)道海膽酮具有很強(qiáng)的抗氧化能力，對(duì)2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)陽(yáng)離子自由基的清除能力強(qiáng)于角黃素和蝦青素。課題組前期從法夫酵母中提取得到海膽酮，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Ellman法研究海膽酮對(duì)AChE的抑制作用，并進(jìn)一步通過(guò)抑制動(dòng)力學(xué)分析其對(duì)AChE的抑制類型，利用熒光光譜和圓二色光譜研究其對(duì)AChE構(gòu)象變化的影響，采用分子對(duì)接分析其結(jié)合位點(diǎn)，初步闡明海膽酮對(duì)AChE的抑制機(jī)理，并應(yīng)用淀粉樣β蛋白片段25～35（amyloid beta-peptide 25-35，Aβ）誘導(dǎo)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12細(xì)胞）損傷，以不同質(zhì)量濃度海膽酮干預(yù)，研究海膽酮對(duì)AD細(xì)胞模型氧化應(yīng)激的影響，闡明海膽酮對(duì)AD的潛在作用機(jī)制，為海膽酮在功能食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海膽酮 實(shí)驗(yàn)室自制；AChE（E.C.3.1.1.7，來(lái)源于電鰻魚(yú)，500 U/mg）、碘代硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine iodide，ATCI）、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）（純度98%）、甲醇（色譜級(jí)）、100×雙抗（100 IU/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素）溶液、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；加蘭他敏（純度≥98%）、Aβ上海源葉生物科技有限公司；PC12細(xì)胞、馬血清（horse serum，HS）、噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5- diphenyl-2-tetrazolium bromide，MTT） 北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；R/MINI 1640培養(yǎng)基美國(guó)Gibco公司；二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）總蛋白含量測(cè)定試劑盒、AChE、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測(cè)定試劑盒 南京建城生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Mettler Toledo電子天平 順迪嘉奧有限公司；SPECTROstar Omega全波長(zhǎng)自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀微孔板檢測(cè)儀德國(guó)BMG Labtech公司；7200可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Unico公司；CALR2y Ecliose熒光光譜儀 美國(guó)Varian公司；JASCO J-810圓二色光譜儀 日本Jasco公司；Avanti J26XP高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；DL-CJ-2NDI型超凈工作臺(tái) 中國(guó)北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Galaxy 170R型CO培養(yǎng)箱 中國(guó)上海百賽生物技術(shù)有限公司；Cytation-5細(xì)胞成像多功能酶標(biāo)儀美國(guó)伯騰儀器有限公司；JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乙酰膽堿酯酶抑制率測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]的方法測(cè)定海膽酮的AChE抑制率。在96 孔酶標(biāo)板中依次加入80 μL buffer D（含0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）牛血清白蛋白的pH 8.0、50 mmol/L Tris-HCl）、20 μL AChE（0.4 U/mL）、20 μL不同質(zhì)量濃度（5、10、30、40、50 μg/mL）海膽酮溶液（溶劑為甲醇，后同），分別37 ℃溫育15 min，加入40 μL底物（0.6 mmol/L ATCI）和40 μL顯色劑（0.6 mmol/L DTNB），37 ℃溫育15 min后測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處吸光度。以等體積不同質(zhì)量濃度（5、10、30、40、50 μg/mL）加蘭他敏作為陽(yáng)性對(duì)照，3 次平行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)公式（1）計(jì)算AChE抑制率。

式中：為添加海膽酮、AChE時(shí)的吸光度；為添加海膽酮、用等體積buffer D代替AChE時(shí)的吸光度；為用等體積甲醇替代海膽酮、加入AChE時(shí)的吸光度；為用等體積buffer D代替AChE、等體積甲醇替代海膽酮時(shí)的吸光度。

1.3.2 乙酰膽堿酯酶抑制類型的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]的方法，固定底物ATCI濃度為0.6 mmol/L，加入量為40 μL，分別添加20 μL不同質(zhì)量濃度（0、5、10、20 μg/mL）海膽酮溶液，測(cè)定不同AChE濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 U/mL）下的酶促反應(yīng)速率（以每分鐘吸光度的變化（Δ）表示，下同）（），以AChE濃度為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)酶促反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)作圖，根據(jù)所得線性擬合曲線是否通過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn)判斷AChE的抑制類型。

如果上述抑制類型為可逆抑制，固定AChE濃度為0.4 U/mL，在不同底物ATCI濃度（0.5、1、2、4、8 mmol/L）下測(cè)定不同質(zhì)量濃度（0、5、10、20 μg/mL）海膽酮的酶促反應(yīng)速率，以底物濃度的倒數(shù)（1/[]）為橫坐標(biāo)、酶促反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/）為縱坐標(biāo)繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線。根據(jù)米氏常數(shù)（）和最大反應(yīng)速率（）的變化判斷抑制類型，以海膽酮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，雙倒數(shù)曲線各質(zhì)量濃度直線的斜率為縱坐標(biāo)作二級(jí)曲線圖，曲線與橫軸的截距為抑制常數(shù)。

1.3.3 熒光光譜分析

將50 μL AChE溶液（50 U/mL）和25 μL不同質(zhì)量濃度（0、5、10、20、30 μg/mL）海膽酮溶液混合均勻后加入1 cm石英試管中用熒光光譜儀記錄熒光強(qiáng)度變化。掃描條件：溫度為25 ℃，波長(zhǎng)為290～490 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm。

1.3.4 圓二色光譜分析

利用圓二色光譜研究海膽酮對(duì)AChE二級(jí)構(gòu)象的影響。將0.2 mL AChE溶液（50 U/mL）與20 μL不同質(zhì)量濃度（0、10、20 μg/mL）海膽酮溶液混合均勻后加入到1 cm的石英樣品池中用JASCO J-810圓二色光譜儀進(jìn)行測(cè)定。掃描條件：波長(zhǎng)范圍190～290 nm；掃描速率100 nm/s；分辨時(shí)間0.5 s；響應(yīng)時(shí)間1 s；帶寬2 nm。

1.3.5 分子對(duì)接分析

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org）下載AChE和多奈哌齊復(fù)合物（PDB ID：1EVE）的晶體結(jié)構(gòu)。從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得底物ATCI和抑制劑海膽酮的2D結(jié)構(gòu)，并使用Discovery Studio 2.5軟件轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Discovery Studio 2.5軟件進(jìn)行分子對(duì)接。用Autodock 4.2軟件測(cè)定抑制劑海膽酮、底物ATCI與AChE相互作用的結(jié)合能。

1.3.6 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞復(fù)蘇后，用含5% FBS、10% HS、1%雙抗（青霉素、鏈霉素）的R/MINI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，用R/MINI 1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液（濃度為1h10個(gè)/mL）進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 海膽酮對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響

參考文獻(xiàn)[15]的方法應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)PC12細(xì)胞活力。將100 μL PC12細(xì)胞（1h10個(gè)/mL）接種于96 孔板中，37 ℃下孵育24 h。孵育結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)液，加入100 μL含不同質(zhì)量濃度（0（即對(duì)照組）、1、5、10、20 μg/mL）海膽酮的R/MINI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃繼續(xù)孵育24 h。吸棄培養(yǎng)液，每孔中加入100 μL質(zhì)量濃度5 mg/mL的MTT溶液（溶于磷酸鹽緩沖液（pH 7.4、0.01 mol/L，后同）），37 ℃繼續(xù)孵育30 min。之后用磷酸鹽緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2 次，每孔加入100 μL DMSO，振蕩20 min，于570 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)量其吸光度，以100 μL DMSO為空白組。根據(jù)公式（2）計(jì)算細(xì)胞活力。

式中：、和分別表示為樣品處理組、對(duì)照組和空白組的吸光度。

1.3.8 海膽酮對(duì)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活性的影響

將100 μL PC12細(xì)胞（1h10個(gè)/mL）接種到96 孔板中培養(yǎng)24 h。待其貼壁后分為3 組：空白組：不作任何處理，用培養(yǎng)基孵育48 h；模型組：用培養(yǎng)基孵育24 h后，吸棄培養(yǎng)液，用含20 μmol/L Aβ培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h；實(shí)驗(yàn)組：用含不同質(zhì)量濃度（5、10、20 μg/mL）海膽酮的培養(yǎng)基孵育24 h，吸棄培養(yǎng)液，用含20 μmol/L Aβ培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h。3 組細(xì)胞孵育結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2 次，加入100 μL質(zhì)量濃度5 mg/mL的MTT，繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，振蕩20 min，用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值OD。Aβ孵育的模型組與海膽酮孵育的實(shí)驗(yàn)組統(tǒng)稱為處理組，根據(jù)公式（3）計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3.9 PC12細(xì)胞中MDA含量及AChE、SOD、CAT和GSH-Px活力測(cè)定

PC12細(xì)胞培養(yǎng)及分組加樣參照1.3.8節(jié)，孵育結(jié)束后，利用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，冰浴中用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞（80 W、20 kHz），2 min后4 ℃下1 200 r/min離心10 min，收集上清液。上清液中的MDA含量及酶活力的測(cè)定分別按照MDA、SOD、CAT和GSH-Px試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)后作圖，采用SPSS 2017軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey’s檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 海膽酮對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用

由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著海膽酮質(zhì)量濃度的升高，對(duì)AChE的抑制作用顯著增強(qiáng)（＜0.05），表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。通過(guò)線性擬合計(jì)算海膽酮、加蘭他敏的半抑制質(zhì)量濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC）分別為（16.29f0.97）、（23.20f1.08）μg/mL，由此可知，海膽酮對(duì)AChE的抑制作用強(qiáng)于加蘭他敏。此外，據(jù)報(bào)道海膽酮是一種可食用的橙色素，抗氧化劑和VA原，具有較強(qiáng)的自由基清除能力。因此，海膽酮具有抗氧化和抑制AChE的雙重功效，且食用安全性高，有望用于預(yù)防和治療AD。

圖1 海膽酮和加蘭他敏對(duì)AChE的抑制作用Fig.1 AChE inhibitory effects of echinenone and galanthamine

2.2 海膽酮對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制類型分析結(jié)果

由圖2A可知，不同質(zhì)量濃度海膽酮作用下的酶濃度-酶促反應(yīng)速率的線性擬合曲線均通過(guò)原點(diǎn)，且線性擬合曲線的斜率隨著海膽酮質(zhì)量濃度的增加而降低，說(shuō)明加入海膽酮抑制酶促反應(yīng)速率，表明海膽酮可逆抑制AChE，海膽酮與AChE通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合，從而導(dǎo)致AChE活力降低或喪失，并未引起AChE分子構(gòu)象的永久變化，可通過(guò)物理方法使AChE活力恢復(fù)。

圖2 海膽酮對(duì)AChE抑制類型分析結(jié)果Fig.2 Analysis of the type of inhibition of echinenone on AChE

固定AChE濃度為0.4 U/mL，由圖2B可知，不同質(zhì)量濃度海膽酮作用下的擬合曲線相交于縱軸一點(diǎn)，縱軸截距為1/，說(shuō)明添加不同質(zhì)量濃度的海膽酮，1/不變。隨著海膽酮質(zhì)量濃度的增大，擬合直線的斜率增大，說(shuō)明米氏常數(shù)隨著抑制劑濃度的增大而增大。以圖2B的直線斜率為縱坐標(biāo)、AChE濃度為橫坐標(biāo)作圖2C，計(jì)算得到AChE的為3.82 μg/mL。由以上分析可知，海膽酮對(duì)AChE的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，說(shuō)明海膽酮與底物ATCI競(jìng)爭(zhēng)AChE的催化位點(diǎn)，降低底物與酶的親和力從而抑制酶的活力。該抑制類型與二氫小檗堿和黃芩苷對(duì)AChE的抑制類型一致。

2.3 海膽酮對(duì)AChE熒光光譜的影響

由圖3可知，隨著海膽酮質(zhì)量濃度的增加，AChE的熒光強(qiáng)度降低，表明海膽酮對(duì)AChE有熒光猝滅作用；但AChE最大發(fā)射波長(zhǎng)334 nm沒(méi)有改變，表明AChE色氨酸微環(huán)境沒(méi)有改變。推測(cè)AChE與海膽酮通過(guò)次級(jí)鍵（如氫鍵和疏水作用）結(jié)合，該結(jié)合并未改變色氨酸所處的溶劑環(huán)境，而改變AChE內(nèi)除色氨酸外其他熒光性質(zhì)氨基酸的微環(huán)境產(chǎn)生熒光猝滅，導(dǎo)致酶活力降低。Tang Hongjin等報(bào)道丹酚酸C與AChE結(jié)合形成新的丹酚酸C-AChE復(fù)合物，誘導(dǎo)酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致熒光猝滅。

圖3 海膽酮對(duì)AChE熒光光譜的影響Fig.3 Fluorescence spectra of AChE in the presence of echinenone

2.4 海膽酮對(duì)AChE圓二色光譜的影響

圓二色光譜技術(shù)廣泛用于分析酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，蛋白質(zhì)的圓二色光譜中-螺旋在208、222 nm處呈負(fù)峰，在192 nm附近有一個(gè)正峰。-折疊在215 nm處呈現(xiàn)負(fù)峰，在198 nm處有一個(gè)正峰。由圖4可知，隨著加入海膽酮質(zhì)量濃度的增加，-螺旋相對(duì)含量從15.7%下降到7.6%，-折疊相對(duì)含量從25.3%下降到16.3%，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量從32.2%下降到20.6%，而-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量從31.2%上升到55.5%。表明海膽酮與AChE結(jié)合引起AChE二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，破壞酶的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而導(dǎo)致AChE活力下降。

圖4 海膽酮對(duì)AChE圓二色光譜的影響Fig.4 Circular dichroism spectra of AChE in the presence of echinenone

2.5 分子對(duì)接分析海膽酮與AChE的相互作用

采用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步闡明海膽酮、底物ATCI與AChE的結(jié)合方式（圖5）。AChE在球形分子結(jié)構(gòu)的表面有一向內(nèi)凹陷的又深又窄的活性中心“峽谷”，中間狹窄，兩端開(kāi)闊，由3個(gè)主要區(qū)域組成：位于峽谷底部由Ser200、Glu327和His440組成的催化三聯(lián)體，催化底物乙酰膽堿的乙?；?；位于峽谷中部由Trp84、Phe330、Tyr442和Glul99組成的陰離子活性位點(diǎn)，此位點(diǎn)氨基酸主要通過(guò)陽(yáng)離子-π或π-π電子的堆積與底物結(jié)合；位于峽谷入口以Trp279為中心的外周陰離子位點(diǎn)，為變構(gòu)調(diào)節(jié)劑和抑制劑提供結(jié)合位點(diǎn)。從圖5B可以看出，海膽酮和底物ATCI均可與AChE的活性中心結(jié)合。底物ATCI與AChE的催化三聯(lián)體位點(diǎn)Ser200形成氫鍵，與His440通過(guò)范德華力相互作用；與陰離子活性位點(diǎn)Trp84、Phe330以陽(yáng)離子-π鍵相互作用；與外周陰離子Tyr121形成碳?xì)滏I（圖5A）。當(dāng)加入海膽酮時(shí)結(jié)合的氨基酸和作用力發(fā)生改變（圖5 B）。海膽酮與AChE的催化三聯(lián)體位點(diǎn)Ser200形成碳?xì)滏I，與His440形成疏水作用力；與陰離子活性位點(diǎn)Trp84形成π-σ鍵；與外周陰離子位點(diǎn)Tyr121以范德華力相互作用，與Tyr334、Trp279以疏水作用力相互作用?？梢?jiàn)，海膽酮和底物ATCI與AChE有共同的活性中心氨基酸作用位點(diǎn)：Ser200、His440、Trp84和Tyr121。通過(guò)分子對(duì)接計(jì)算可知海膽酮、ATCI與AChE的結(jié)合能分別為－10.9 kcal/mol和－4.9 kcal/mol。結(jié)合能越低，表明與受體蛋白的親和力越高。由于海膽酮與AChE的結(jié)合能更低，更容易與AChE結(jié)合且結(jié)合狀態(tài)更穩(wěn)定，因而阻礙底物ATCI與活性中心氨基酸結(jié)合，從而引起酶活力降低，抑制乙酰膽堿水解，使患者腦內(nèi)ACh水平提高。海膽酮對(duì)AChE有更強(qiáng)的抑制作用可能與海膽酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。海膽酮的長(zhǎng)碳鏈一端可以作用于AChE活性中心峽谷底部的催化位點(diǎn)，另一端可作用于活性中心峽谷入口處外周陰離子位點(diǎn)。中間碳鏈可以滿足兩個(gè)位點(diǎn)之間的距離，使海膽酮很好的契合在AChE的整個(gè)活性中心峽谷，與底物競(jìng)爭(zhēng)AChE的活性中心，從而降低酶活力。此結(jié)果也與抑制動(dòng)力學(xué)結(jié)果一致，進(jìn)一步表明海膽酮是一種競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。

圖5 ATCI、海膽酮與AChE的分子對(duì)接Fig.5 Molecular docking interaction of echinenone and ATCI with AChE

此外，AChE的外周陰離子結(jié)構(gòu)域在誘發(fā)Aβ聚集中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)寡聚體及斑塊形成。海膽酮與AChE的催化三聯(lián)體和外周陰離子活性位點(diǎn)同時(shí)作用，不僅可以抑制AChE活力而且可以干擾Aβ聚集，從而發(fā)揮雙重治療AD的作用。

2.6 海膽酮對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響

由圖6可知，在質(zhì)量濃度0～20 μg/mL范圍內(nèi)，海膽酮對(duì)PC12細(xì)胞活力均無(wú)顯著影響（＞0.05），細(xì)胞活力均接近100%，表明海膽酮在質(zhì)量濃度0～20 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)PC12細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用20 μg/mL海膽酮作為實(shí)驗(yàn)上限質(zhì)量濃度。

圖6 海膽酮對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響Fig.6 Effects of echinenone on the viability of PC12 cells

2.7 海膽酮對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活力的影響

由圖7可知，模型組的PC12細(xì)胞在Aβ誘導(dǎo)后細(xì)胞活力為（65.19f2.58）%，顯著低于空白組，說(shuō)明Aβ成功誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷。經(jīng)5、10、20 μg/mL海膽酮處理的Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的活力分別為（75.61f2.54）%、（79.12%f2.11）%、（84.50f2.44）%；與模型組相比，海膽酮顯著提高PC12細(xì)胞的活力（＜0.05），并呈劑量依賴性，對(duì)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

圖7 海膽酮對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活力的影響Fig.7 Effect of echinenone on the viability of PC12 cells induced by Aβ25-35

2.8 海膽酮對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中AChE活力的影響

由圖8可知，與空白組相比，模型組中AChE的活力顯著升高（＜0.05），表明Aβ成功誘導(dǎo)PC12細(xì)胞膽堿能系統(tǒng)損傷。與模型組相比，不同質(zhì)量濃度的海膽酮預(yù)處理PC12細(xì)胞后，Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中AChE的活力隨著海膽酮質(zhì)量濃度的增加顯著降低（＜0.05），具有劑量依賴性，表明海膽酮能有效抑制PC12細(xì)胞中AChE的活力。

圖8 海膽酮對(duì)PC12細(xì)胞AChE活力的影響Fig.8 Effect of echinenone on the activity of AChE in PC12 cells

2.9 海膽酮對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中MDA含量及SOD、CAT、GSH-Px活力的影響

由表1可知，與空白組相比，模型組脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA含量顯著增多（＜0.05），抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活力顯著下降（＜0.05）。表明Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組的MDA含量顯著減少（＜0.05），并且當(dāng)海膽酮質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，MDA含量與空白組無(wú)顯著差異（＞0.05）。表明經(jīng)海膽酮處理的Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞可以降低氧化應(yīng)激。當(dāng)海膽酮質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)，SOD活力與模型組無(wú)顯著差異（＞0.05），隨著加入海膽酮質(zhì)量濃度的增大，SOD活力顯著升高（＜0.05），并且當(dāng)海膽酮質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，SOD活力為（77.44f7.92）U/mg，顯著高于空白組（＜0.05）。隨著海膽酮質(zhì)量濃度的增加，CAT活力和GSH-Px活力均顯著升高（＜0.05），呈明顯的劑量依賴性；并且當(dāng)海膽酮質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，CAT活力已顯著高于空白組（＜0.05）。綜上所述，添加海膽酮可以引起MDA含量顯著減少，SOD、CAT和GSH-Px活力顯著升高，表明給予海膽酮預(yù)保護(hù)可以明顯減輕Aβ誘導(dǎo)AD細(xì)胞模型的氧化應(yīng)激損傷。

表1 海膽酮對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中MDA含量和抗氧化酶系活力的影響Table 1 Effect of echinenone on MDA content and antioxidant enzyme activity in PC12 cells induced by Aβ25-35

3 討 論

AD是多因素復(fù)雜疾病，膽堿能系統(tǒng)損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致AD的兩大重要機(jī)制。膽堿能損傷的主要表現(xiàn)為AChE活力升高，乙酰膽堿缺失。氧化應(yīng)激是過(guò)氧化物和抗氧化劑之間的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定狀態(tài)。其特征是機(jī)體內(nèi)活性氧類、活性氮類等自由基含量顯著增加，超過(guò)機(jī)體本身的清除能力，造成氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致氧化損傷的產(chǎn)生，最終影響細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)和DNA/RNA的翻譯后修飾，造成細(xì)胞損傷或凋亡。脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA含量增加、抗氧化物酶如SOD、CAT和GSH-Px等活性下降是AD氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要表現(xiàn)。PC12細(xì)胞來(lái)源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，是常用的神經(jīng)元細(xì)胞模型。Aβ具有神經(jīng)毒性作用，會(huì)損傷膽堿能神經(jīng)元，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致AD，Aβ的主要毒性片段為Aβ。本實(shí)驗(yàn)研究海膽酮對(duì)AChE的抑制機(jī)理，并通過(guò)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型，進(jìn)一步研究海膽酮對(duì)Aβ誘導(dǎo)AD細(xì)胞模型氧化應(yīng)激的影響。結(jié)果表明，海膽酮對(duì)AChE具有很強(qiáng)的抑制作用，可引起AChE二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，與底物競(jìng)爭(zhēng)AChE的結(jié)合位點(diǎn)，從而降低酶活力。Aβ誘導(dǎo)AD細(xì)胞模型結(jié)果顯示，細(xì)胞活性降低，MDA水平顯著升高，SOD、CAT和GSH-Px活力顯著降低，表明Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生了氧化應(yīng)激。海膽酮處理后細(xì)胞活性升高，MDA含量降低，SOD、CAT和GSH-Px活力升高；表明海膽酮通過(guò)提高SOD、CAT和GSH-Px的活力，以及防止脂質(zhì)過(guò)氧化作用，從而減少脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，減輕Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。綜上，海膽酮通過(guò)抑制AChE活力減輕膽堿能損傷；海膽酮通過(guò)提高細(xì)胞抗氧化酶SOD、CAT和GSHPx的活力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA的含量，從而減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，具有潛在的預(yù)防和輔助治療AD的功效。

4 結(jié) 論

本研究基于AChE活力和氧化應(yīng)激研究了海膽酮對(duì)AD的作用機(jī)制，結(jié)果表明，海膽酮可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制降低AChE活力減輕膽堿能損傷，降低乙酰膽堿的水解速率，維持乙酰膽堿水平，保證神經(jīng)信號(hào)的正常傳遞；此外，海膽酮可通過(guò)提高抗氧化酶的活力降低脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA含量，對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷起到保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)為海膽酮用于預(yù)防和治療AD提供了參考，同時(shí)為海膽酮在功能食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論支持和科學(xué)依據(jù)。