李穎暢，師丹華，張馨元，李笑涵，鄒 倩，儀淑敏*

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

海鱸魚又稱咸水鱸魚，屬硬骨魚綱、鱸形目、鱸魚種，在海洋中的分布比較廣，是產(chǎn)量較高的海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一，其蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸含量豐富。海鱸魚可以鮮食，也可以制成魚糜制品。其鹽溶性肌原纖維蛋白含量較高，對魚糜制品品質(zhì)有著關(guān)鍵作用，直接影響魚糜制品質(zhì)構(gòu)特性與風(fēng)味特性。

沒食子酸即3,4,5-三羥基苯甲酸，是一種酚類化合物，不僅能延緩脂肪蛋白氧化，同時能與蛋白、多糖通過氫鍵、疏水作用力等方式進(jìn)行非共價結(jié)合，也能與蛋白質(zhì)中的巰基和氨基發(fā)生加成反應(yīng)，共價結(jié)合形成巰基-醌、氨基-醌，引起蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)的改變。據(jù)報道，沒食子酸可以改變魚肌原纖維蛋白的表面疏水性，使蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并且這種變化與沒食子酸的添加量具有相關(guān)性。賈娜等發(fā)現(xiàn)沒食子酸可以增加豬肉糜肌原纖維蛋白表面疏水性和溶解度，提高蛋白質(zhì)的凝膠性能。胡熠等研究表明沒食子酸能夠使肌原纖維蛋白的-螺旋、-折疊含量增加，凝膠結(jié)構(gòu)更加致密和光滑。von Staszewski等發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物可促進(jìn)-乳球蛋白和酪蛋白糖肽的凝膠化反應(yīng)。

超聲波作為一種常用的加工技術(shù)，在食品保鮮、輔助工藝優(yōu)化、輔助解凍以及輔助熱處理等方面應(yīng)用廣泛。超聲波可以產(chǎn)生空化氣泡和微流，導(dǎo)致高溫、高壓、高剪切力和湍流的形成，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性。Zhao Chengbin等發(fā)現(xiàn)超聲預(yù)處理可以使大豆分離蛋白偶聯(lián)物的二級結(jié)構(gòu)更加有序。Madadlou等發(fā)現(xiàn)超聲處理的酪蛋白可以推遲凝膠形成時間并增加酪蛋白凝膠的硬度。Li Fangfei等指出，用超聲波強(qiáng)度500 W解凍豬肉可以最大程度地減少對蛋白質(zhì)構(gòu)象的損傷和促進(jìn)肌原纖維蛋白凝膠形成。Zhang Ziye等研究表明，使用不大于600 W的高強(qiáng)度超聲處理肌原纖維蛋白后，肌原纖維蛋白具有更致密和均勻的凝膠微觀結(jié)構(gòu)，提高了凝膠的持水能力。曲文娟等利用沒食子酸改性、超聲波輔助制備的膠原蛋白-殼聚糖復(fù)合涂膜包裹豬肉，發(fā)現(xiàn)可以延緩豬肉腐敗變質(zhì)，延長保質(zhì)期。

目前，關(guān)于超聲波輔助沒食子酸對肌原纖維蛋白凝膠性能的影響鮮有報道。本實(shí)驗(yàn)通過測定凝膠強(qiáng)度、質(zhì)構(gòu)特性、水分分布狀態(tài)、色差、持水性與蒸煮損失率、化學(xué)作用力等，并采用原子力顯微鏡（atom force microscope，AFM）觀察凝膠微觀結(jié)構(gòu)，探究超聲波輔助沒食子酸對海鱸魚肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，為凝膠類肉制品的加工提供技術(shù)參考和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海鱸魚平均體長（30±1）cm、體質(zhì)量（1 000±50）g，購自遼寧省錦州市科技路水產(chǎn)批發(fā)市場。

磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、鹽酸、氯化鈉、氯化鉀、乙二胺四乙酸二鈉、尿素、2-硝基苯甲酸、氯化鈣、鉬酸銨、亞硫酸鈉、2,4-二硝基苯肼、乙醇、冰乙酸、溴酚藍(lán)、25%戊二醛（均為分析純） 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；Tris、ATP、三氯乙酸、沒食子酸、對苯二酚、鹽酸胍、-巰基乙醇、電泳Marker蛋白北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-400KDE超聲波 昆山市超聲儀器有限公司；UV-2550紫外-可見光分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；SORVALL Stratos冷凍高速離心機(jī) 美國Thermo公司；MS105DU分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；970 CRT熒光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；CR-400色差計(jì) 日本Konica-Minolta公司；XE-70 AFM 韓國Park Systems公司；S-4800冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；PQ001低場核磁共振分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；TA.XT-Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；Free Zone2.5真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取參考李學(xué)鵬等的方法。

1.3.2 沒食子酸-肌原纖維蛋白混合體系的制備及超聲處理

沒食子酸-肌原纖維蛋白混合體系的制備方法參考張慧蕓等的方法。每組取肌原纖維蛋白均100 g，用0.6 mol/L NaCl的緩沖溶液（pH 7.2，含20 mmol/L Tris-HCl）稀釋，使得體系中蛋白終質(zhì)量濃度為130 mg/mL，向提取的肌原纖維蛋白溶液中添加0、1、2、4 mg/g和6 mg/g沒食子酸。分為400 W超聲波處理組（400 W超聲處理20 min）和未超聲組（0 W）。處理后的樣品于4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆茫糜诤罄m(xù)指標(biāo)測定。

1.3.3 肌原纖維蛋白凝膠的制備

將1.3.2節(jié)不同處理組肌原纖維蛋白溶液放入直徑25 mm柱形小瓶，85 ℃恒溫水浴鍋加熱30 min，冰水冷卻20 min，制備肌原纖維蛋白凝膠。樣品在4 ℃的冰箱中過夜。測定前蛋白凝膠在室溫下放置20 min。

1.3.4 凝膠強(qiáng)度測定

采用質(zhì)構(gòu)儀凝膠強(qiáng)度測定模式分析凝膠破斷力和凹陷距離。測定條件：探頭為P/5S球形金屬探頭；測前速率為2.0 mm/s，測中速率為1.0 mm/s，測后速率為1.0 mm/s；測試距離為15.0 mm；觸發(fā)力為10.0 g。凝膠強(qiáng)度按照公式（1）計(jì)算。

1.3.5 凝膠質(zhì)構(gòu)特性測定

采用TA.XT-Plus型質(zhì)構(gòu)儀對凝膠質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行測定，探頭為P/50，測試前速率2.0 mm/s，測試中速率1.5 mm/s，測試后速率1.5 mm/s，壓縮比40%，下壓力5.0 g。

1.3.6 凝膠水分分布狀態(tài)測定

將凝膠切成直徑為5 mmh5 mmh20 mm凝膠塊。采用CPMG脈沖序列測定自旋-自旋弛豫時間。參數(shù)設(shè)定：SFI＝22 MHz、P90＝14 μs、SW＝100 kHz、TR＝2 000 ms、NS＝8、＝150 μs、Echocnt＝4 000。

1.3.7 凝膠色澤測定

參考文獻(xiàn)[23]，采用CR-400色差計(jì)測定蛋白凝膠的*（亮度）、*（紅綠度）、*（黃藍(lán)度）值和白度。

1.3.8 凝膠持水性和蒸煮損失率測定

通過Han Minyi等的離心法測定持水性，并略作修改。將蛋白凝膠樣品裝入50 mL離心管（/g），稱質(zhì)量（/g），再5 000h離心15 min，棄去水分，再次稱質(zhì)量（/g）。按式（2）計(jì)算持水性。

參考Ma Xingsheng等的方法測定蒸煮損失率，并稍作修改，將凝膠樣品切成5.0 mm的薄片（5 g），封于蒸煮袋，稱質(zhì)量（/g）。于90 ℃水浴20 min，取出，擦干表面液體再次稱質(zhì)量（/g）。按式（3）計(jì)算蒸煮損失率。

1.3.9 凝膠化學(xué)作用力測定

凝膠化學(xué)作用力通過蛋白質(zhì)溶解度表示。參考Gómez-Guillén等方法：取2.0 g蛋白凝膠樣品5 份，分別加入0.05 mol/L NaCl（A液）、0.6 mol/L NaCl（B液）、0.6 mol/L NaCl＋1.5 mol/L尿素（C液）、0.6 mol/L NaCl＋8.0 mol/L尿素（D液）、0.6 mol/L NaCl＋8.0 mol/L尿素＋0.05 mol/L-巰基乙醇（E液）5種溶液各10 mL，均質(zhì)混勻，4 ℃放置60 min，10 000 r/min離心15 min，取上清液并用雙縮脲法測定其中蛋白質(zhì)量濃度。按式（4）～（7）分別計(jì)算離子鍵含量、氫鍵含量、疏水相互作用和二硫鍵含量，結(jié)果以每升溶液所含的溶出蛋白質(zhì)量表示（g/L）。

1.3.10 凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察

參考王艷敏等的方法并略作修改，將1.3.2節(jié)蛋白溶液樣品稀釋至20 μg/mL，準(zhǔn)確吸取6 μL蛋白溶液，均勻的涂在載玻片上，室溫下于超凈臺中干燥。純凈水（30 ℃、35 μL）沖洗3 次。放置于AFM載物臺進(jìn)行觀察。采用輕敲模式。使用Gwyddion軟件分析AFM圖片。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件通過Duncan法進(jìn)行顯著性分析，以＜0.05表示差異顯著，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸添加量和超聲處理對肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度的影響

凝膠強(qiáng)度能夠體現(xiàn)肌原纖維蛋白形成凝膠的能力。如圖1所示，未超聲處理?xiàng)l件下，未添加沒食子酸的肌原纖維蛋白和添加沒食子酸組的肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度差異顯著（＜0.05），沒食子酸的添加量小于2 mg/g時，凝膠強(qiáng)度隨著沒食子酸添加量的增加而增加，而沒食子酸的添加量大于2 mg/g時，各組凝膠強(qiáng)度又出現(xiàn)下降趨勢；沒食子酸添加量為2 mg/g時，肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度最大，這是因?yàn)檫m度的多酚氧化會使蛋白中巰基向二硫鍵轉(zhuǎn)化，促進(jìn)肌原纖維蛋白發(fā)生交聯(lián)；而當(dāng)沒食子酸的添加量為6 mg/g時，凝膠強(qiáng)度從612.07 ggmm（添加量為2 mg/g時）下降至496.92 ggmm，可能是由于沒食子酸過度氧化形成醌類物質(zhì)，也有可能是因?yàn)槠溥^度氧化產(chǎn)生的自由基使凝膠結(jié)構(gòu)遭到破壞。由此可知，添加沒食子酸一定程度上能提高肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度，但當(dāng)沒食子酸的添加量過高時，反而會導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度下降，這與Pan Jinfeng等研究魚肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度對沒食子酸的添加量具有劑量依賴性的結(jié)論一致。超聲波400 W處理組凝膠強(qiáng)度高于未超聲組的凝膠強(qiáng)度，不同沒食子酸添加量處理組差異顯著（＜0.05）。說明超聲波處理后，蛋白質(zhì)分子展開，溶解度增加，粒度減小，促進(jìn)肌原纖維蛋白形成致密均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠強(qiáng)度增強(qiáng)。Amiri等研究發(fā)現(xiàn)300 W超聲波處理牛肉肌原纖維蛋白30 min，凝膠強(qiáng)度最大。說明超聲波處理具有促進(jìn)肌原纖維蛋白形成凝膠的能力。

圖1 超聲波處理下沒食子酸對肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of gallic acid on gel strength of myofibrillar protein under ultrasonic treatment

2.2 沒食子酸添加量和超聲處理對肌原纖維蛋白質(zhì)構(gòu)特性的影響

質(zhì)構(gòu)是決定凝膠感官品質(zhì)的一個重要特性。由表1可知，隨著沒食子酸添加量在0～2 mg/g范圍內(nèi)的增加，凝膠硬度和咀嚼度不斷增大，當(dāng)沒食子酸添加量為2 mg/g時，凝膠硬度、咀嚼度達(dá)到最大值，且此時硬度與其他添加量沒食子酸處理組差異顯著（＜0.05）。這是因?yàn)檫m量的沒食子酸可以促使蛋白質(zhì)的巰基與酚發(fā)生加成反應(yīng)，形成穩(wěn)定構(gòu)象，與張典等研究多酚協(xié)同磷酸化處理對蛋白凝膠特性的影響結(jié)果一致。而沒食子酸的添加量繼續(xù)增加時，硬度、咀嚼度呈下降趨勢，可能是因?yàn)闆]食子酸被氧化成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)可以與蛋白質(zhì)巰基發(fā)生加成反應(yīng)生成硫代醌加合物。有研究表明，隨著茶多酚含量的增加，羊肉肌原纖維蛋白的硬度、咀嚼度一直呈上升趨勢，與本研究結(jié)果不同，這可能是茶多酚和沒食子酸的結(jié)構(gòu)不同以及添加量的不同造成的。不同添加量沒食子酸處理對肌原纖維蛋白的彈性沒有顯著影響。400 W超聲波輔助處理后的肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性變化結(jié)果如表2所示，相對于未超聲組，400 W超聲處理后凝膠硬度、彈性與咀嚼度均有所提高。這是因?yàn)槌曁幚碛欣诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)的展開，埋藏在內(nèi)部的氨基酸殘基更多地暴露出來，氨基酸與氨基酸及氨基酸與酚羥基間的相互作用增強(qiáng)。Zhao Yingying等發(fā)現(xiàn)超聲波處理可以提高雞胸肉肌原纖維蛋白-大豆油復(fù)合溶膠的凝膠強(qiáng)度、硬度、咀嚼度，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。

表1 沒食子酸對肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 1 Effect of gallic acid on texture of myofibrillar protein gels

表2 400 W超聲波輔助下沒食子酸對纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 2 Effect of gallic acid combined with 400 W ultrasonic treatment on texture of myofibrillar protein gels

2.3 沒食子酸添加量和超聲處理對肌原纖維蛋白水分分布狀態(tài)的影響

水分分布狀態(tài)與凝膠性能密切相關(guān)，低場核磁共振技術(shù)常用于評估水分移動與分布情況。如圖2所示，在弛豫時間0～1 000 ms分布4個峰，依次為0～1 ms強(qiáng)結(jié)合水峰、1～10 ms弱結(jié)合水峰、10～100 ms不易流動水峰、100～1 000 ms自由水峰。其中不易流動水所占比例最大，結(jié)合水和自由水比例較小。

圖2 肌原纖維蛋白凝膠橫向弛豫時間（T2）圖譜Fig.2 Transverse relaxation time (T2) of myofibrillar protein gels

強(qiáng)結(jié)合水、弱結(jié)合水、不易流動水和自由水峰面積比例分別用、、、表示，本實(shí)驗(yàn)主要就不易流動水和自由水的峰面積比例進(jìn)行分析。由表3可以看出，各處理組中未添加沒食子酸組最小，而最大，未添加沒食子酸組和添加組差異顯著（＜0.05）。隨著沒食子酸添加量的增加，先升高后降低。當(dāng)添加量為2 mg/g時，最大，最小，這是因?yàn)檫m量的沒食子酸羥基可與蛋白質(zhì)分子相互作用，形成致密的肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)，使一部分自由水轉(zhuǎn)化為不易流動水，結(jié)合在蛋白質(zhì)周圍或被固定在凝膠結(jié)構(gòu)中。李玲等通過研究氧化條件下茶多酚對豬肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著茶多酚含量的增加，凝膠中不易流動水含量顯著增加，而自由水含量顯著下降（＜0.05）。由表4可知，超聲波處理后，與未經(jīng)超聲處理組相比，明顯提高，而總體呈下降趨勢。這是因?yàn)槌曊T導(dǎo)的空化作用以及樣品中肌纖維結(jié)構(gòu)的變化可以減少不易流動水的損失，對水分分布狀態(tài)產(chǎn)生積極的影響。Zhang Ziye等研究不同功率高強(qiáng)度超聲處理對肌原纖維蛋白的影響，結(jié)果表明結(jié)合水具有較低的水遷移率，而不易流動水和自由水的比例在600 W條件下分別具有最大值和最小值，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與之相似。

表3 沒食子酸添加量對肌原纖維蛋白凝膠峰面積比例的影響Table 3 Effect of gallic acid on percentage peak area of myofibrillar protein gels

表4 400 W超聲波輔助下沒食子酸添加量對肌原纖維蛋白凝膠峰面積比例的影響Table 4 Effect of gallic acid combined with 400 W ultrasonic treatment on percentage peak area of myofibrillar protein gels

2.4 沒食子酸添加量和超聲處理對肌原纖維蛋白色澤的影響

色澤與肉制品食用品質(zhì)及消費(fèi)者偏好和可接受程度相關(guān)。未超聲和超聲波輔助下沒食子酸對蛋白凝膠色澤的影響分別如表5、6所示，隨著沒食子酸添加量的增加，蛋白凝膠的*值、白度呈下降趨勢，*值變化不顯著，而*值增加，表明沒食子酸的添加會干擾凝膠色澤的形成，添加量越大，顏色變化越明顯。孫科等通過向鲅魚魚糜中添加蘋果多酚，發(fā)現(xiàn)蘋果多酚含量的增加會使魚糜顏色偏紅，對白度產(chǎn)生一定的影響。400 W超聲波輔助處理后，與未經(jīng)超聲處理組相比，*值、白度總體呈下降趨勢，這是因?yàn)槌曁幚砗?，凝膠進(jìn)一步交聯(lián)，持水力和光吸收程度增加，所以白度下降。沒食子酸會對凝膠色澤產(chǎn)生影響，但是色澤變化整體可接受。

表5 沒食子酸對肌原纖維蛋白凝膠L*、a*、b*值和白度的影響Table 5 Effect of gallic acid on color parameters L*, a* and b* and whiteness of myofibrillar protein gels

表6 400 W超聲波輔助下沒食子酸對肌原纖維蛋白凝膠L*、a*、b*值和白度的影響Table 6 Effect of gallic acid combined with 400 W ultrasonic treatment on color parameters L*, a* and b* and whiteness of myofibrillar protein gels

2.5 沒食子酸添加量和超聲處理對肌原纖維蛋白凝膠持水性和蒸煮損失率的影響

持水性和蒸煮損失率是評價蛋白凝膠優(yōu)劣的重要指標(biāo)，持水性高、蒸煮損失率低，表明凝膠保持內(nèi)部水分的能力強(qiáng)，間接證明凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密。如圖3所示，隨著沒食子酸添加量增加，凝膠持水性先上升后下降，蒸煮損失率變化趨勢相反。未超聲處理組中未添加沒食子酸的肌原纖維蛋白持水性最低，而蒸煮損失率最高；其次是沒食子酸添加量為6 mg/g的肌原纖維蛋白；當(dāng)沒食子酸添加量為1、4 mg/g時兩者的持水性、蒸煮損失率差異都不顯著（＞0.05）；而添加量為2 mg/g時，持水性最高，約達(dá)到70%，蒸煮損失率僅約為5%。這是由于沒食子酸能與蛋白質(zhì)氨基酸的-或-NH產(chǎn)生共價交聯(lián)作用，在較大范圍內(nèi)形成了酚-蛋白復(fù)合物，使蛋白和水分結(jié)合更牢固。胡熠等向海鰻肌原纖維蛋白凝膠中加入沒食子酸，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，持水性隨沒食子酸含量的增加而增加，但是進(jìn)一步增加沒食子酸的含量時會使蛋白質(zhì)聚集從而導(dǎo)致持水性下降，本研究結(jié)果與之一致。超聲波400 W處理肌原纖維蛋白后，與未經(jīng)超聲處理組相比持水性增加，蒸煮損失率降低，因?yàn)榻?jīng)過超聲處理后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，暴露出更多的帶電基團(tuán)，使蛋白質(zhì)與水之間的相互作用增強(qiáng)。Liu Ru等研究表明超聲波可使鰱魚肌球蛋白持水性增加、蒸煮損失降低。尹藝霖等發(fā)現(xiàn)超聲400 W處理可以降低鰱魚肌原纖維蛋白蒸煮損失率，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致。

圖3 超聲波處理下沒食子酸添加量對肌原纖維蛋白凝膠持水性和蒸煮損失率的影響Fig.3 Effect of gallic acid combined with ultrasonic treatment on water-holding capacity and cooking loss rate of myofibrillar proteins

2.6 沒食子酸添加量和超聲處理對肌原纖維蛋白化學(xué)作用力的影響

決定蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的化學(xué)作用力有離子鍵、氫鍵、二硫鍵、疏水相互作用等。氫鍵主要用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。疏水相互作用是蛋白質(zhì)發(fā)生折疊時的主要動力，影響大部分蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。由圖4A可知，隨著沒食子酸添加量的增加，離子鍵含量呈下降趨勢，氫鍵和二硫鍵含量呈上升趨勢，且二硫鍵的含量隨沒食子酸添加量的增加變化顯著（＜0.05）。這是由于沒食子酸含有3個酚羥基，親水基團(tuán)數(shù)量多，可與蛋白結(jié)合形成氫鍵；同時在凝膠形成過程中，添加的沒食子酸可以改變蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)，與暴露出的基團(tuán)相互結(jié)合，更容易發(fā)生蛋白質(zhì)交聯(lián)，形成二硫鍵，使蛋白結(jié)構(gòu)更加緊密。而疏水相互作用隨沒食子酸添加量的增加呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)沒食子酸的添加量為2 mg/g時疏水相互作用最強(qiáng)，因?yàn)檫m量的沒食子酸會促進(jìn)蛋白質(zhì)的展開，而沒食子酸的含量過高時，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，甚至變性，進(jìn)一步折疊使疏水性氨基酸埋藏在內(nèi)部。其他一些酚類物質(zhì)，如兒茶素、茶多酚等也均會對疏水作用產(chǎn)生影響。由圖4B可知，經(jīng)400 W超聲波處理后，隨著沒食子酸添加量的增加，氫鍵含量逐漸增加，二硫鍵含量顯著增加（＜0.05），但是離子鍵含量變化不明顯。這是因?yàn)槌曁幚砗蟮目栈?yīng)會加速蛋白質(zhì)的展開，同時暴露出更多的巰基和氨基，使蛋白質(zhì)交聯(lián)進(jìn)一步加強(qiáng)。400 W超聲波可以產(chǎn)生高反應(yīng)性自由基，與沒食子酸反應(yīng)生成沒食子酸醌類物質(zhì)，形成蛋白質(zhì)-硫-沒食子酸-硫-蛋白質(zhì)聚合物，使二硫鍵含量上升。Pan Jinfeng等研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理后會增加蛋白質(zhì)二硫鍵含量，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致。

圖4 未超聲與超聲波處理下沒食子酸添加量對肌原纖維蛋白凝膠化學(xué)作用力的影響Fig.4 Effect of gallic acid alone or in combination with ultrasonictreatment on the chemical forces of myofibrillar protein gels

2.7 沒食子酸添加量和超聲處理對肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

AFM是表征蛋白質(zhì)表面形貌特征的常用方法，可表征樣品表面不同維度的形貌，且空間分辨率高。圖5、6分別為超聲波輔助下肌原纖維蛋白二維、三維成像圖。如圖5A、圖6A所示，未添加沒食子酸時，肌球蛋白無序聚集，形成不規(guī)則的簇狀聚集體。當(dāng)添加1 mg/g的沒食子酸時，凝膠分布相對均勻，存在輕微的交聯(lián)現(xiàn)象（圖5B、圖6B）。添加2、4 mg/g沒食子酸時，凝膠聚集體更小，分布更均勻，且交聯(lián)有序，此時形成的凝膠結(jié)構(gòu)最好（圖5C、圖6C和圖5D、圖6D）。說明隨著沒食子酸添加量的增加，凝膠微觀結(jié)構(gòu)由不規(guī)則、不均勻向更加規(guī)則均勻致密轉(zhuǎn)化，這是因?yàn)檫m量的沒食子酸可以改變蛋白的結(jié)構(gòu)，使埋藏在內(nèi)部的基團(tuán)暴露，更易形成二硫鍵，同時，本實(shí)驗(yàn)中凝膠強(qiáng)度、二硫鍵含量、持水性的增加以及蒸煮損失率的降低進(jìn)一步表明了凝膠性能的增強(qiáng)。然而，當(dāng)沒食子酸的添加量為6 mg/g時，此時凝膠分布雖然均勻，但形成了較密集的聚集（圖5E、圖6E）。因?yàn)樘砑舆^量的沒食子酸后，肌球蛋白構(gòu)象改變，兩者進(jìn)一步發(fā)生加成反應(yīng)，形成醌類物質(zhì)，產(chǎn)生較大的蛋白質(zhì)聚集體。400 W超聲處理后，凝膠微觀結(jié)構(gòu)整體增強(qiáng)，且更加均勻。觀察發(fā)現(xiàn)未添加沒食子酸凝膠呈現(xiàn)了有序的聚集（圖5A、圖6A），且有簇狀聚集體。沒食子酸添加量為1 mg/g和2 mg/g時凝膠聚集行為少，分布更加均勻（圖5B、圖6B和圖5C、圖6C），而沒食子酸添加量為4 mg/g和6 mg/g凝膠分布呈現(xiàn)密集狀態(tài)（圖5D、圖6D和圖5E、圖6E）。這可能是因?yàn)槌暡ǖ目栈?yīng)等作用使得蛋白分子分布一致有序。因此，超聲波輔助下沒食子酸可以提高肌原纖維蛋白的凝膠性能。

圖5 超聲波輔助下肌原纖維蛋白AFM二維成像圖Fig.5 Two-dimensional AFM images of myofibrillar protein subjected to ultrasonic treatment

圖6 超聲波輔助下肌原纖維蛋白AFM三維成像圖Fig.6 Three-dimensional AFM images of myofibrillar protein subjected to ultrasonic treatment

3 結(jié) 論

超聲波輔助處理下，隨著沒食子酸添加量的增加，肌原纖維蛋白的凝膠強(qiáng)度、硬度、化學(xué)作用力、微觀結(jié)構(gòu)等得到顯著改變。隨沒食子酸添加量的增加，沒食子酸處理的肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度、硬度、咀嚼性呈先上升后降低的趨勢，當(dāng)沒食子酸的添加量為2 mg/g時，凝膠強(qiáng)度、硬度、咀嚼度最大，此時不易流動水峰面積比例最高，自由水峰面積比例最低，持水性最高，蒸煮損失率最低；肌原纖維蛋白二硫鍵含量隨著沒食子酸添加量的增加顯著上升（＜0.05）；微觀結(jié)構(gòu)隨沒食子酸添加量的增加變得更加致密，孔隙較小，形成的凝膠性能更好。綜上，超聲波輔助沒食子酸可以提高海鱸魚肌原纖維蛋白的凝膠性能。同時，需要對沒食子酸的添加量進(jìn)行控制，因?yàn)檫m量的沒食子酸可以提高蛋白凝膠性能，但是沒食子酸的添加量過高時，會對凝膠產(chǎn)生不利影響，使其品質(zhì)下降。