何錫忠，趙本進(jìn)，林 鷙，朱永軍，李嘉皓，丁衛(wèi)星，彭麗英*

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海佳牧生物制品有限公司，上海 201403)

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)引 起的傳染性疾病，已給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其臨床表現(xiàn)主要是以斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征為主[1-2]。該病主要發(fā)生在7～15周齡的斷奶仔豬，發(fā)病率4%～30%，死亡率可達(dá)50%～90%[3-4]，PCV2感染豬后可對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫抑制作用[5]。目前對(duì)于PCV2引起的豬圓環(huán)病毒病尚無(wú)有效的治療方法，且該病毒對(duì)外界抵抗力強(qiáng)，造成豬場(chǎng)凈化難度高。豬圓環(huán)病毒病防控的主要手段是對(duì)豬接種疫苗。滅活疫苗的安全性高，所以滅活疫苗仍然是當(dāng)前主要的疫苗研發(fā)類(lèi)型，但其免疫效果卻不十分理想[4]。

本試驗(yàn)是將所制備的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗接種豬后對(duì)其安全性及免疫效力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 疫苗

豬圓環(huán)病毒2型疫苗，批號(hào)分別為20200401、20200409和20201001，由上海佳牧生物制品有限公司制備。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

21日齡的健康易感仔豬(用豬圓環(huán)病毒2型特異性PCR方法檢測(cè)PCV2基因、PCV2抗體均為陰性)，購(gòu)自江蘇省茅山鎮(zhèn)某家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.3 豬圓環(huán)病毒2型

豬圓環(huán)病毒2型SN07-12株(滴毒，TCID50107.33/mL)，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所制備、鑒定和保存。

1.4 主要試劑和儀器

DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)、PCV2間接免疫熒光試劑盒(韓國(guó)JBT生物技術(shù)公司)、Retiga 2000R高敏感度冷CDD熒光數(shù)碼顯微鏡(日本OLYMPUS)、GeneAmp9700-PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)AppliedBiosytems公司)、紫外凝膠成像系統(tǒng)(法國(guó) Vilber Lourmat)、DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠(chǎng))。

1.5 PCR方法

PCR引物P1：5'－AAGAGAAATGGCATCTTCAACACC-3'，P2：5'－CAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3'，條帶大小為580 bp。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min。

2 方法

2.1 安全性試驗(yàn)

將21日齡健康易感仔豬(PCV2抗原和抗體檢測(cè)均為陰性)20頭分為4組，每組5頭，3組為免疫組，1組為對(duì)照組。免疫組仔豬頸部肌內(nèi)注射疫苗，2.0 mL/頭，隨后觀(guān)察14 d內(nèi)的采食、飲水、精神是否正常，有無(wú)不良臨床反應(yīng)，注射部位有無(wú)異常反應(yīng)。免疫前3 d和免疫后10 d內(nèi)，測(cè)量體溫。免疫后14 d，從免疫組和對(duì)照組各選擇2頭仔豬進(jìn)行剖檢，觀(guān)察各臟器有無(wú)病理變化。

2.2 免疫效力試驗(yàn)

取21日齡健康易感仔豬(PCV2抗原和抗體檢測(cè)均為陰性)25頭，分為5組，每組5頭，第1～3組為免疫組，第4組接種安慰劑，為攻毒對(duì)照組，第5組不免疫不攻毒，為空白對(duì)照組，各組分別隔離飼養(yǎng)。免疫組仔豬頸部肌內(nèi)注射疫苗 1.0 mL/頭，首免后隔14 d用相同劑量加強(qiáng)免疫一次，二免后18 d分別在每頭仔豬的兩側(cè)腋下和臀部注射1.0 mL弗氏不完全佐劑乳化的鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH/ICFA、0.5 mg/mL)，同時(shí)腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基，10 mL/頭。

2.2.1 PCV2抗體水平檢測(cè)

二免后第21天對(duì)所有仔豬采血，分離血清，用無(wú)血清培養(yǎng)基將PCV2稀釋為103.5TCID50/mL，接種于單層PK-15細(xì)胞，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，80%冷丙酮固定細(xì)胞30 min。采用免疫熒光方法檢測(cè)待檢血清的PCV2抗體水平，熒光顯微鏡下見(jiàn)綠色特異性熒光為陽(yáng)性，無(wú)綠色特異性熒光為陰性，出現(xiàn)特異性熒光的血清最高稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。根據(jù)抗體效價(jià)檢查結(jié)果進(jìn)行判定，免疫組至少4頭仔豬的PCV2抗體效價(jià)不低于1∶ 1 600，攻毒對(duì)照組及空白對(duì)照組仔豬的檢測(cè)結(jié)果均陰性(不高于1∶400)。

2.2.2 免疫攻毒

二免后第21天，用PCV2 SN07-12強(qiáng)毒株(病毒含量為T(mén)CID50107.33/mL)對(duì)各免疫組和對(duì)照組仔豬進(jìn)行攻毒，滴鼻1.0 mL、頸部肌內(nèi)注射8.0 mL，逐日測(cè)量體溫并觀(guān)察25 d。攻毒后第4天分別在每頭仔豬的兩側(cè)腋下及臀部注射1.0 mL弗氏不完全佐劑乳化的鑰孔血藍(lán)蛋白(合計(jì)4.0 mL/頭)，同時(shí)腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基10 mL/頭；攻毒后第11、19天再次腹腔接種巰基乙酸培養(yǎng)基10 mL/頭。觀(guān)察期結(jié)束時(shí)，將試驗(yàn)仔豬稱(chēng)重后撲殺，采集每頭仔豬的腹股溝淋巴結(jié)，通過(guò)免疫組化法對(duì)PCV2抗原進(jìn)行檢測(cè)[4]。根據(jù)體溫、平均日增重和病毒抗原檢查結(jié)果進(jìn)行判定，免疫組應(yīng)至少4頭仔豬受到保護(hù)，攻毒對(duì)照組應(yīng)至少4頭仔豬發(fā)病。

2.2.3 PCV2病毒檢測(cè)

PCR法按照中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供的豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

免疫組化法是將各組仔豬的腹股溝淋巴結(jié)浸泡于2.5%戊二醛-多聚甲醛混合液中固定，8 h～12 h后將固定好的組織修剪成適當(dāng)大小的塊，按免疫組化法[6]進(jìn)行PCV2檢測(cè)。

2.3 仔豬發(fā)病的判定標(biāo)準(zhǔn)

2.3.1 體溫

仔豬體溫升高(≥40℃)(每日上午9點(diǎn)左右測(cè)定仔豬體溫一次)，至少持續(xù)3 d。

2.3.2 平均日增重

攻毒當(dāng)日和攻毒結(jié)束日，分別對(duì)各組仔豬進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算攻毒后各組仔豬的平均日增重，若攻毒仔豬的平均日增重低于空白對(duì)照組仔豬的，且差異顯著(P＜0.05)，判該組仔豬生長(zhǎng)發(fā)育不良，均有臨床癥狀。

2.3.3 病毒抗原檢測(cè)

用常規(guī)免疫組化法檢測(cè)仔豬腹股溝淋巴結(jié)的PCV2抗原。

符合2.3.1、2.3.2、2.3.3中的任何2項(xiàng)，即可判為發(fā)病。

3 結(jié)果

3.1 安全性試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 體溫測(cè)定

3批次疫苗免疫后，免疫組仔豬每日每頭測(cè)得的體溫均低于40 ℃，與對(duì)照組仔豬的相似，體溫處于正常范圍內(nèi)(表1)。

3.1.2 臨床觀(guān)察

由表2可知，3批次疫苗免疫后觀(guān)察14 d，仔豬采食、精神狀態(tài)均正常，被毛整潔有光澤，均無(wú)不良臨床反應(yīng)，疫苗吸收良好，注射部位均無(wú)紅腫、硬塊等局部異常反應(yīng)，與對(duì)照組仔豬相比無(wú)明顯差異。

3.1.3 剖檢

免疫后14 d各組隨機(jī)選1頭仔豬剖檢，觀(guān)察仔豬各臟器病理變化。結(jié)果顯示，免疫組及對(duì)照組仔豬各臟器均無(wú)病理變化(表3)。

3.2 效力試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 抗體測(cè)定

由表4可知，豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗二免后3周，各批次疫苗免疫仔豬的抗體效價(jià)均不低于1∶1 600，攻毒對(duì)照組及空白對(duì)照組每頭仔豬的抗體效價(jià)不高于1∶400。

3.2.2 臨床觀(guān)察

如表5所示，攻毒后14 d內(nèi)逐日測(cè)量各組仔豬的體溫，并進(jìn)行臨床觀(guān)察，各批次疫苗免疫仔豬后均無(wú)不良臨床反應(yīng)，每日每頭仔豬的體溫均不高于40 ℃，與空白對(duì)照組仔豬的差異不顯著(P＞0.05)；攻毒對(duì)照組有部分仔豬在攻毒后3 d～5 d體溫略有升高，其中體溫高于40 ℃持續(xù)3 d。

3.2.3 平均日增重、剖檢以及PCR方法和免疫組化法檢測(cè)結(jié)果

攻毒后25 d對(duì)各組仔豬稱(chēng)重，并計(jì)算仔豬的平均日增重。結(jié)果表明，3批次疫苗免疫組、攻毒對(duì)照組及空白對(duì)照組仔豬攻毒后的平均的日增重分別為(0.533±0.012)kg、(0.534±0.014)kg、(0.537±0.011)kg、(0.492±0.009)kg、(0.532±0.018)kg，免疫組與空白對(duì)照組之間差異不顯著(P＞0.05)。攻毒后25 d剖檢所有試驗(yàn)仔豬，3批次疫苗免疫組、攻毒對(duì)照組及空白對(duì)照組仔豬各臟器均未發(fā)現(xiàn)病理變化，通過(guò)PCR方法及免疫組化法對(duì)腹股溝淋巴結(jié)檢測(cè)PCV2時(shí)發(fā)現(xiàn)，3批次疫苗免疫組和空白對(duì)照組仔豬的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，攻毒對(duì)照組仔豬也均為陽(yáng)性(表6)。

4 討論

安全性試驗(yàn)表明，仔豬以2倍劑量接種3批次疫苗后，體溫、采食量、毛色、精神狀態(tài)均正常，生長(zhǎng)發(fā)育良好，無(wú)異常臨床反應(yīng)，符合疫苗安全要求。

潘杰等發(fā)現(xiàn)，在二免2周后，該疫苗不僅能提高仔豬體液免疫水平，誘導(dǎo)高效特異性抗體產(chǎn)生，而且能夠有效抵抗強(qiáng)毒株的攻擊，保護(hù)率可達(dá)100%[6]。本研究從攻毒后試驗(yàn)仔豬的體溫變化、平均日增重、抗體水平、PCR方法及免疫組化法等方面對(duì)疫苗免疫保護(hù)效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：免疫組及空白對(duì)照組仔豬體溫正常，毛色整潔有光澤；攻毒對(duì)照組仔豬體溫升高(高于40 ℃)持續(xù)3 d，毛色紊亂無(wú)光澤。攻毒后25 d剖檢，各組仔豬均無(wú)特征性的豬圓環(huán)病毒病的病理變化；但是免疫組及空白對(duì)照組仔豬的平均日增重大于攻毒對(duì)照組仔豬的；免疫組每頭仔豬的抗體效價(jià)均不低于1∶1 600，攻毒對(duì)照組及空白對(duì)照組每頭仔豬的抗體不高于1∶400；在用PCR方法和免疫組化法檢測(cè)PCV2上，免疫組均為陰性，而攻毒對(duì)照組均為陽(yáng)性。依據(jù)仔豬的發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)判定免疫組保護(hù)率為100%，攻毒對(duì)照組保護(hù)率為0。由此可見(jiàn)，豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗能夠有效預(yù)防豬圓環(huán)病毒2型強(qiáng)毒株對(duì)豬的侵入。