陳燕樂(lè)，唐昭山，2，楊廣民，曾建國(guó)

(1.湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，長(zhǎng)沙 410331；2.湖南省中藥提取工程研究中心，長(zhǎng)沙410329；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省中獸藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128；4.湖南省獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，長(zhǎng)沙410128)

罌粟科博落回屬的博落回(Macleayacordata(Willd.)R.Br.)是一種多年生直立草本植物。湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司專業(yè)從事博落回藥用植物的種植、生產(chǎn)、銷售以及相關(guān)的研究工作。博落回植株中富含生物堿，在各個(gè)部位中果實(shí)含量最高[1]，是主要的生產(chǎn)原料。生物堿中主要包括血根堿，白屈菜紅堿，原阿片堿，別隱品堿[2-3]，另外還含有微量的二氫白屈菜紅堿等生物堿等[4]。美可達(dá)公司經(jīng)過(guò)多年的生產(chǎn)實(shí)踐，不斷的優(yōu)化和研究，對(duì)博落回藥用植物資源進(jìn)行全面開發(fā)。博落回果提取苯并菲啶類生物堿后產(chǎn)生的廢棄的濾殘液和殘?jiān)?，有著大量的普托類生物堿，具有顯著的抗炎活性，公司將包含普托類生物堿的濾殘液部分開發(fā)成治療大腸桿菌性腹瀉的博普總堿國(guó)家二類新獸藥[5]。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)該獸藥進(jìn)行特征譜圖研究，用對(duì)照品定性鑒別博普總堿的特征峰，并對(duì)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行規(guī)定，建立簡(jiǎn)便快速的方法，為全面控制博普總堿原料藥的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津20A型高效液相色譜儀(SPD-20A檢測(cè)器和LC solution B.1.24色譜工作站)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(梅托勒-托利儀器(上海)有限公司)。

1.2 材料 原阿片堿(批號(hào)：110853-201003，純度：99.9%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；別隱品堿(批號(hào)：17101504，純度：99.9%，湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司自制)；鹽酸血根堿(批號(hào)：510001-201101，純度：99.3%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；白屈菜紅堿(批號(hào)：111718-201402，純度：80.5%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；博普總堿原料藥(湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司生產(chǎn))；乙腈為色譜純；水為純化水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 取對(duì)照品原阿片堿、別隱品堿、鹽酸血根堿和白屈菜紅堿適量，精密稱定，加甲醇-1.0%鹽酸(50∶50)100 mL溶解，制成每1 mL含原阿片堿0.095 mg、別隱品堿0.049 mg、鹽酸血根堿0.021 mg、白屈菜紅堿0.012 mg的溶液即得。

2.2 供試品溶液的制備 取博普總堿粉末約20 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-1.0%鹽酸水(50∶50)50 mL，稱定重量，超聲(功率250 W，33 KHz)處理30 min，取出，放冷，稱定重量，用甲醇-1.0%鹽酸水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 根據(jù)公司博落回系列產(chǎn)品的內(nèi)部高效液相分析方法及相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道[6～8]，確定的高效液相色譜條件：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(優(yōu)化使用Agilent TC柱(250×4.6 mm，5 μm))；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～14 min，25% A；14～27 min，25%～60% A；27～29 min，60%～25% A；29～35 min，25% A；流速為0.8 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為287 nm。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，即得。

2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 液相特征圖譜中呈現(xiàn)的4個(gè)特征峰分別為原阿片堿峰、別隱品堿峰、鹽酸血根堿峰和白屈菜紅堿峰，使用全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)4個(gè)成份在270～290 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)均有較好吸收，這4個(gè)成份的紫外最大吸收波長(zhǎng)分別為289、285、274 及269 nm，因?yàn)椴┢湛倝A中原阿片堿和別隱品堿峰為主要成份，故其檢測(cè)波長(zhǎng)確定為287 nm。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察 取同一份供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行下連續(xù)進(jìn)樣6次，每次5 μL。供試品特征圖譜中應(yīng)有4個(gè)特征峰，以原阿片堿參照物峰為S峰，計(jì)算特征峰2、特征峰3、特征峰4的相對(duì)保留時(shí)間，如表1所示，結(jié)果表明該方法的儀器精密度良好。

表1 精密度考察結(jié)果

2.5.2 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行下分別于0、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣，供試品特征圖譜中應(yīng)有4個(gè)特征峰，以原阿片堿參照物峰為S峰，計(jì)算特征峰2、特征峰3、特征峰4的相對(duì)保留時(shí)間，如表2所示，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.5.3 重復(fù)性考察 取同一批次樣品制備供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)行下平行進(jìn)樣6份，結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試品的重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性考察結(jié)果

2.6 博普總堿特征圖譜的建立及相關(guān)數(shù)值的規(guī)定

2.6.1 特征圖譜的建立和特征峰的定性鑒別 取15個(gè)不同批次的博普總堿原料藥，批號(hào)分別為100701、100702、100703、110901、110902、110903、140501、140502、140503、180401、180402、180403、200501、200502及200503，按已確定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以半峰寬為20，斜率為1000，最小峰高為最高峰的1.5%進(jìn)行積分。將所有批次樣品色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”，以S1(100702)樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度0.10S，進(jìn)行多點(diǎn)校正，得到15批樣品疊加圖，并建立博普總堿特征圖譜的對(duì)照?qǐng)D譜，詳見(jiàn)圖1和圖2，各批次樣品的相似度結(jié)果均大于0.95。

圖1 15個(gè)批次博普總堿原料藥的特征圖譜

峰1：原阿片堿 峰2：別隱品堿 峰3：血根堿 峰4：白屈菜紅堿

將含有原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿的混合對(duì)照品溶液，以及博普總堿供試品溶液按已確定的色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖3。

A：博普總堿混合對(duì)照 B：博普總堿供試品

2.6.2 特征圖譜內(nèi)容的規(guī)定 按上述的色譜條件測(cè)定，記錄15個(gè)不同批次博普總堿原料藥各特征峰的保留時(shí)間，計(jì)算各特征峰和參照物峰S的相對(duì)保留時(shí)間(表4)，所有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于5%。故應(yīng)規(guī)定各供試品溶液的色譜圖中應(yīng)有4個(gè)特征峰，其原阿片堿峰為S峰，計(jì)算特征峰2、峰3和峰4與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)。規(guī)定值為：1.19±0.06(峰2)，1.92±0.10(峰3)，2.41±0.12(峰4)。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化 采用4個(gè)不同液相流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)博普總堿原料藥進(jìn)行洗脫：(Ⅰ)甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)；(Ⅱ)甲醇(A)-0.2%三乙胺-0.1%磷酸水(B)；(Ⅲ)乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)；(Ⅳ)乙腈(A)-0.2%三乙胺(磷酸調(diào)pH=2.5)(B)。

其中流動(dòng)相系統(tǒng)Ⅲ和Ⅳ，效果較好，即乙腈水系統(tǒng)分離洗脫效果比甲醇水系統(tǒng)好；其中三乙胺磷酸屬于緩沖鹽，對(duì)液相設(shè)備損害較大，操作較為復(fù)雜，最終選擇流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響 使用同一供試品溶液，選擇不同檢測(cè)波長(zhǎng)282、285、287、289和292 nm進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果顯示各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1%，故檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間影響很小。

3.3 柱溫對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響 使用同一供試品溶液，選擇不同柱溫25、30、35、40 ℃進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果顯示特征峰2和特征峰3的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于5%，但特征峰4相對(duì)保留時(shí)間RSD為5.41%?？梢?jiàn)不同柱溫對(duì)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間影響較大，尤其是特征峰4(白屈菜紅堿峰)。

3.4 流動(dòng)相流速對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響 使用同一供試品溶液，選擇不同流速0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果顯示特征峰2和特征峰3的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于5%，但特征峰4相對(duì)保留時(shí)間RSD為8.48%?？梢?jiàn)不同流速對(duì)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間影響較大，尤其是特征峰4(白屈菜紅堿峰)。

3.5 不同品牌色譜柱對(duì)高效液相特征譜圖的影響 使用同一供試品溶液，選擇不同品牌C18(250×4.6 mm，5 μm)液相色譜柱Xunion、Welch Ultimate、ACE Excel、Agilent HC和Agilent TC，進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果顯示除了特征峰2相對(duì)保留時(shí)間RSD小于5%外，特征峰3的相對(duì)保留時(shí)間RSD為8.79%，特征峰4的相對(duì)保留時(shí)間RSD為11.80%，故不同品牌色譜柱對(duì)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間影響較大，最好固定色譜柱品牌進(jìn)行使用，考慮市場(chǎng)上銷售量較大和使用效果，優(yōu)化使用Agilent C18系列色譜柱，尤其使用Agilent TC柱。

本研究對(duì)原料藥博普總堿有效部位進(jìn)行了特征圖譜研究，可在含量測(cè)定的同時(shí)，進(jìn)行特征圖譜的測(cè)定，相較于博落回生物堿的薄層鑒別[3]更為快速和方便。同時(shí)，應(yīng)用特征圖譜技術(shù)指認(rèn)了4個(gè)特征峰并規(guī)定了相對(duì)保留時(shí)間。該方法具有良好的精密性、溶液穩(wěn)定性和樣品重復(fù)性，為全面控制博普總堿的質(zhì)量提供了依據(jù)。