景慕嫻，謝曉莉，李連缺，張一麗，米國華，劉 明，趙 達

(1.石家莊江山動物藥業(yè)有限公司，石家莊050200；2.河北工程技術(shù)學(xué)院，石家莊 050000；3.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038；4.石家莊市藁城區(qū)畜牧工作總站，石家莊 050000；5.河北省口服獸藥制劑創(chuàng)新技術(shù)中心，石家莊050200)

清呼合劑為本文研究的新獸藥復(fù)方制劑，由黃芩、枇杷葉等6味中藥組成，具有清肺化痰、止咳平喘之功效，主治由風(fēng)熱犯肺或風(fēng)寒郁而化熱等各種原因引起的肺熱咳喘證。為客觀評價該制劑的安全性，依據(jù)農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編(2006-2011)》[1]，通過對KM小鼠單次灌胃清呼合劑，連續(xù)觀察試驗小鼠出現(xiàn)的中毒癥狀、中毒程度、性質(zhì)及死亡情況，評價受試藥物毒性作用的性質(zhì)，毒效應(yīng)的特征及可能的靶器官，初步判斷受試藥物的危險性，并探求受試藥物的劑量-效應(yīng)關(guān)系，求出半數(shù)致死量LD50及95%可信限，為評價其安全性提供依據(jù)[2-4]。

1 材料與方法

1.1 受試藥物 清呼合劑，250 mL/瓶，每1 mL相當于原生藥1 g，批號20180327，由石家莊江山動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。試驗時取本品加入蒸餾水，按最大劑量組配制供試品溶液，其他濃度按等容量稀釋法(1:K稀釋)進行稀釋。

1.2 實驗動物 SPF級健康KM小鼠，體重18 g～22 g，72只(其中12只用于首次實驗)，雌雄各半，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2019-0008。將KM小鼠隔離檢疫5～7 d，在檢疫期間動物攝食、飲水和健康狀態(tài)良好。皮毛光滑、反應(yīng)靈敏，糞便成形，眼、耳、鼻及會陰處無分泌物，動物確認健康無病后可用于試驗。

1.3 試驗動物分組及給藥劑量 選取SPF小鼠12只(雌、雄各半)進行首次試驗，設(shè)3個劑量組，每組4只(雌、雄各半)。試驗前禁食不禁水12 h，分別灌服清呼合劑1次，灌胃體積為0.2 mL/10 g體重，具體劑量見表1。如果高劑量組(劑量為5000 mg/kg)死亡率為0%，則進行重復(fù)試驗一、重復(fù)試驗二[5-7]，即分別選取30只小鼠(雌、雄各半)，各設(shè)3個劑量組，每組10只(雌、雄各半)，灌服清呼合劑1次，灌胃體積為0.2 mL/10 g體重，具體劑量見表2和表3。

表1 清呼合劑KM小鼠急性毒性試驗首次試驗-劑量及分組

表2 清呼合劑KM小鼠急性毒性試驗重復(fù)試驗一-劑量及分組

表3 清呼合劑KM小鼠急性毒性試驗重復(fù)試驗二-劑量及分組

1.4 試驗觀察 給藥4 h嚴密觀察動物對供試品的反應(yīng)，以后每天觀察一次，連續(xù)觀察7 d，4 d如有動物死亡則觀察14 d。觀察內(nèi)容：動物外觀、活動情況、呼吸狀態(tài)、糞便形態(tài)、營養(yǎng)狀況、被毛光澤[1,8]。對動物毒性反應(yīng)情況、中毒癥狀、嚴重程度、中毒發(fā)生時間、持續(xù)時間、恢復(fù)時間、動物死亡時間及死亡數(shù)量進行詳細記錄，對死亡動物進行大體解剖。

1.5 結(jié)果統(tǒng)計 統(tǒng)計并分析清呼合劑各劑量組的動物死亡數(shù)。

1.6 毒性分級評定 依據(jù)半數(shù)致死量(LD50)及急性毒性(LD50)劑量分級表[1]，對受試藥物的毒性進行分級。見表4。

表4 急性毒性(LD50)劑量分級表

2 結(jié)果與分析

2.1 首次試驗結(jié)果 首次試驗中，清呼合劑各劑量組實驗小鼠灌胃給藥后，4 h內(nèi)小鼠均未出現(xiàn)異常現(xiàn)象，連續(xù)觀察小鼠7 d后，各組小鼠行為及精神狀態(tài)良好(臨床表現(xiàn)如2.2圖1所示)，眼、鼻、口腔及肛門均無分泌物，二便正常，且各組小鼠均未出現(xiàn)死亡。結(jié)果見表5、表6。

表5 急性毒性試驗首次試驗結(jié)果

表6 嚙齒動物中毒表現(xiàn)及觀察項目

2.2 重復(fù)試驗結(jié)果 重復(fù)試驗一和重復(fù)試驗二中，清呼合劑各劑量組實驗小鼠灌胃給藥后，4 h內(nèi)小鼠均未出現(xiàn)異常現(xiàn)象，連續(xù)觀察小鼠7 d后，各組小鼠均未出現(xiàn)死亡(表7)，且小鼠行為及精神狀態(tài)等均正常(圖1)，觀察結(jié)果同表6。各組小鼠均未出現(xiàn)死亡，即小鼠的死亡率為0。由此可見，清呼合劑對KM小鼠的LD50大于5000 mg/kg·bw。

表7 急性毒性試驗重復(fù)試驗結(jié)果

2.3 毒性分級評定 從本試驗結(jié)果可知清呼合劑的LD50大于5000 mg/kg，按1.6表4急性毒性(LD50)劑量分級表進行分級，清呼合劑屬于實際無毒類中獸藥。

3 討論與結(jié)論

獸藥三個基本要素屬性包括安全性、藥品的質(zhì)量可控性以及臨床的有效性。獸藥的優(yōu)與劣，除取決于有效性，還取決于毒性的高低。因此，在新獸藥的開發(fā)與研究中必須要進行安全性評價[9-10]。急性毒理試驗是安全性評價的首要內(nèi)容，指一日內(nèi)對動物單次或多次給藥，連續(xù)觀察給藥后動物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及死亡情況的試驗方法[11]，進而測定引起動物急性中毒的劑量，揭示動物在中毒過程中出現(xiàn)的毒性反應(yīng)和靶器官[12]。常用LD50的測定來評價獸藥急性毒性試驗。

清呼合劑為純中藥復(fù)方新制劑，由黃芩、枇杷葉等6味中藥組成，前期藥效學(xué)試驗表明，清呼合劑具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗菌、抗炎等作用[13]。本試驗依據(jù)《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編(2006-2011)》“獸藥急性毒性試驗(LD50測定)指導(dǎo)原則”，對清呼合劑進行了急性毒性評價試驗。首次試驗結(jié)果顯示，KM小鼠口服高劑量已達5000 mg/kg的清呼合劑，未出現(xiàn)小鼠的死亡、精神及行為等異常。將小鼠增加至10只(雌雄各半)重復(fù)兩次試驗，結(jié)果仍未見死亡及中毒癥狀。因此，確定了清呼合劑對KM小鼠的LD50大于5000 mg/kg。根據(jù)急性毒性(LD50)劑量分級表進行分級判斷，清呼合劑屬于實際無毒類中獸藥，這為評價其安全性提供了有力依據(jù)，同時為后續(xù)長期毒性試驗的劑量使用提供依據(jù)。