邱振興， 熊津名， 蔡少芬， 邱君志， 陳宇熹

(福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建福州 350002)

化學(xué)殺蟲劑在控制農(nóng)業(yè)有害生物、保護(hù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面發(fā)揮了重要的積極作用，但其長期大量、不合理使用帶來了環(huán)境污染、食品安全和昆蟲抗性等一系列問題(Casidaet al，2017；Yigitet al，2020)。 因此，人們把注意力轉(zhuǎn)向害蟲生物防治 (Richardsonet al，2019； Sequeira，2019)。 昆蟲病原真菌可用于刺吸式口器害蟲粉虱和介殼蟲的生物防治。 昆蟲病原真菌孢子在芽管萌發(fā)后會侵染害蟲，通過穿透寄主體表、破壞昆蟲血腔、產(chǎn)生多種毒素和摧毀免疫系統(tǒng)等方式侵染寄主并在其群體中傳播流行，進(jìn)而控制寄主群體(Shinet al，2020)。 在近1 000 種昆蟲病原真菌中，莫勒菌屬(Moelleriella)能高度專一地寄生粉虱和蚧類，因此大量生產(chǎn)該菌孢子并加以應(yīng)用值得深入研究。

在莫勒菌生產(chǎn)中，培養(yǎng)基的配方直接影響孢子產(chǎn)量和制劑致病力(Maet al，2020； Diaset al，2021)，因此，培養(yǎng)基配方的篩選和優(yōu)化便顯得尤為重要。 一般菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上僅能獲得較低水平的產(chǎn)孢量，大多研究者通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)和響應(yīng)面效應(yīng)法來優(yōu)化產(chǎn)孢培養(yǎng)基的配方，旨在顯著提高孢子產(chǎn)量(Jianget al，2020)。 由于不同菌株對營養(yǎng)需求有所差異，本研究基于前期單因素篩選的結(jié)果，進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)，優(yōu)化莫勒菌培養(yǎng)基組成成分(碳源、氮源、金屬離子和維生素)，達(dá)到提高產(chǎn)孢量的目的，同時為該菌今后工業(yè)化大量生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為拉瑟波斯基莫勒菌(Moelleriella raciborskiiLiu，Chaverri ＆ Hodge)，由福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離自福建省三明沙縣感病柑桔粉虱，純化、鑒定后保存?zhèn)溆谩?/p>

基礎(chǔ)培養(yǎng)基原料為硫酸銨2 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、磷酸氫二鈉0.65 g、磷酸二氫鉀0.5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，并設(shè)為對照。 分離和保存菌株用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 15～20 g、蒸餾水 1 L、自然 pH)。

1.2 試驗(yàn)方法

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入不同碳源、氮源、金屬離子、維生素，在培養(yǎng)基中的濃度分別為7 g·L-1、10 g·L-1、4×10-4mol·L-1、50 mg·L-1，基于 4 因素 3 水平 L9(34)設(shè)計正交試驗(yàn)(表 1)。

表1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test for optimization of the medium composition

1.2.1 孢子懸液的制備及濃度測量 將拉瑟波斯基莫勒菌轉(zhuǎn)接至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，在23±1 ℃下培養(yǎng)10～14 d。 加入0.05%的吐溫-80 無菌水 10 ～15 mL 至已產(chǎn)孢的培養(yǎng)皿中，在磁力攪拌器的驅(qū)動下使橙色粘孢團(tuán)均勻分散在溶解液中而獲得孢子液，用顯微鏡試紙過濾除去雜質(zhì)和殘存的菌絲，然后借助血球板計數(shù)器測量孢子數(shù)目并算出其濃度。

1.2.2 孢子產(chǎn)量的測試 在直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中倒入20 mL 不同組合的培養(yǎng)基，當(dāng)各培養(yǎng)基凝固后分別在每皿中接種3×107孢子·mL-1的孢子液0.5 mL，用無菌玻璃刮刀均勻涂布孢子液后，在23 ℃下培養(yǎng)14 d。 在已充分產(chǎn)孢培養(yǎng)基上加入0.05% 吐溫-80 無菌水10 mL，用玻璃刮刀刮取所產(chǎn)孢子，用顯微鏡試紙過濾后獲得孢子液，基于血球板計數(shù)器計數(shù)，設(shè)置3 個重復(fù)，計算其平均孢子產(chǎn)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSSAU 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，借助SPSS 軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用SPSSAU 軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計的極差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，與對照的產(chǎn)孢量(0.02×108孢子·cm-2)相比，最有助于莫勒菌產(chǎn)孢的培養(yǎng)基組合是 7(A3B1C3D2，7 g·L-1甘露醇、10 g·L-1酵母浸粉、4×10-4mol·L-1Fe2＋、50 mg·L-1VC)，產(chǎn)孢量可達(dá) 1.09×108孢子·cm-2；其次是組合 4 和 6，其孢子產(chǎn)量分別為 0.87×108和0.90×108孢子·cm-2；孢子產(chǎn)量最低的為組合 2，其產(chǎn)孢量為0.05×108孢子·cm-2，因此經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基能顯著提高莫勒菌孢子產(chǎn)量。

表2 莫勒菌孢子產(chǎn)量的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Moelleriella raciborskii sporulation obtained in the orthogonal matrix experiment

2.2 正交試驗(yàn)極差分析

表 2 中的K1、K2 和K3 分別代表水平 1、2、3 對應(yīng)的產(chǎn)孢量之和，極差R表示K1、K2 和K3中的極大值與極小值間的差值。 從極差R值可見，碳源種類差異對產(chǎn)孢影響最大(5.94)，其次是不同種類的維生素對產(chǎn)孢量的影響(3.69)，對產(chǎn)孢量影響最小的是不同種類的金屬離子(1.26)。 由此可見，不同營養(yǎng)要素對該菌產(chǎn)孢量影響差別較大，這為優(yōu)化莫勒菌培養(yǎng)基成分增加產(chǎn)孢量提供了參考。

2.3 產(chǎn)孢驗(yàn)證試驗(yàn)

基于正交試驗(yàn)分析結(jié)果，配置最佳組合 A2B1C3D2 培養(yǎng)基(7 g·L-1可溶性淀粉、10 g·L-1酵母浸粉、4 × 10-4mol·L-1Fe2＋、50 mg·L-1VC)， 培 養(yǎng) 后 莫 勒 菌 產(chǎn) 孢 量 可 達(dá)1.2×108孢子·cm-2，而該菌在優(yōu)化前的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(對照)上產(chǎn)孢量僅為0.02×108孢子·cm-2，較優(yōu)化前孢子產(chǎn)量提高60 倍。 因此，進(jìn)一步佐證了基于正交試驗(yàn)優(yōu)化的培養(yǎng)基能夠大幅度增加產(chǎn)孢量，可為大批量生產(chǎn)該菌提供科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，最有利于莫勒菌產(chǎn)孢的碳源、氮源、金屬離子、維生素分別是7 g·L-1可溶性淀粉、10 g·L-1酵母浸粉、4×10-4mol·L-1Fe2＋、50 mg·L-1VC。 其中碳源對產(chǎn)孢量影響最大，其次是維生素、氮源對產(chǎn)孢量的影響，相對而言金屬離子對產(chǎn)孢量影響最??；優(yōu)化后的培養(yǎng)基能顯著提高莫勒菌產(chǎn)孢量。

據(jù)此，不同種類碳源對產(chǎn)孢量的影響最大是否關(guān)系到真菌的碳代謝，不同二價金屬離子對產(chǎn)孢量的影響較小是否與金屬價鍵有關(guān)，這些需要深入研究。 因此后期可開展該菌碳代謝及其與產(chǎn)孢關(guān)系的分子機(jī)理研究。 此外，真菌往往在不同發(fā)育階段對各種營養(yǎng)需求存在差異，該菌不同生長階段對營養(yǎng)需求如何還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

本試驗(yàn)為昆蟲病原真菌莫勒菌大量生產(chǎn)提供了一定的參考信息，但是該菌在靶標(biāo)害蟲體內(nèi)的營養(yǎng)需求情況尚待深入研究，便于揭示其昆蟲致病機(jī)理，進(jìn)而更好用于害蟲生物防治。 同時需對正交試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，應(yīng)用響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)更精準(zhǔn)優(yōu)化產(chǎn)孢營養(yǎng)需求。