顧海龍，馮亞明，楊智景，王建國(guó)

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院泰州農(nóng)科所，江蘇 泰州 225300；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

魚類的生殖系統(tǒng)包括性腺和生殖導(dǎo)管，性腺分為精巢和卵巢；生殖導(dǎo)管可分為輸精管和輸卵管。開展魚類性腺發(fā)育的組織學(xué)研究，深入分析精巢和卵巢在不同發(fā)育階段的特征，對(duì)魚類的強(qiáng)化培育和人工繁殖具有重要意義。關(guān)于魚類性腺發(fā)育的組織學(xué)研究已取得了一系列的進(jìn)展[1-5]。除黃鱔[6]等少數(shù)種類外，魚類的精巢一般成對(duì)附于鰾的腹面兩側(cè)。對(duì)于精巢類型劃分，學(xué)術(shù)界多以精巢中精細(xì)胞的排列方式，將之分為小管型和小葉型[7,8]，大多數(shù)魚類都屬于小葉型。孟慶聞等[9]根據(jù)精小葉的排列情況，將精巢分為輻射型和壺腹型。包括鯉科魚類在內(nèi)的大多數(shù)魚類屬于壺腹型。而關(guān)于精巢發(fā)育時(shí)期的劃分，我國(guó)學(xué)者一般采用劉筠等[10]人的劃分標(biāo)準(zhǔn)，按生殖細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間，將精巢分為6 個(gè)時(shí)期，即Ⅰ～Ⅵ期。硬骨魚類的精巢體積一般較小，呈長(zhǎng)囊狀或細(xì)帶狀。關(guān)于魚類卵巢發(fā)育的研究要比精巢更加細(xì)致，研究?jī)?nèi)容包含卵巢的發(fā)育分期、卵母細(xì)胞的發(fā)育時(shí)相、原始生殖細(xì)胞的起源和遷移、卵黃物質(zhì)的來源及生成等多個(gè)方面[11]。關(guān)于卵巢的發(fā)育分期，我國(guó)學(xué)者多采用劉筠[10]、施瑔芳[12]等人的標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)卵巢內(nèi)不同時(shí)相的卵母細(xì)胞比例及其所占體積，將之分為Ⅰ-Ⅵ期的6 個(gè)時(shí)期。

長(zhǎng)春鳊（Parabramis pekinensis）廣泛分布于全國(guó)各主要水系。它營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，生長(zhǎng)迅速，適應(yīng)性強(qiáng)，市場(chǎng)需求量大，是我國(guó)的主要淡水養(yǎng)殖魚類之一[13]。然而目前市場(chǎng)上銷售的鳊仍主要為江河、湖泊、水庫(kù)等天然水域捕撈和自然進(jìn)入養(yǎng)殖水體生長(zhǎng)的個(gè)體，其產(chǎn)量十分有限。即便是養(yǎng)殖的鳊，其苗種也主要來源于天然野生苗的捕撈。另外，鳊養(yǎng)殖業(yè)大多還是千家萬戶，分散經(jīng)營(yíng)，規(guī)模小，技術(shù)水平低，操作不規(guī)范，抗風(fēng)險(xiǎn)能力差。隨著市場(chǎng)需求的逐漸增加，以及生境的破壞等外界因素的影響，鳊的野生資源已岌岌可危，被列入《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)經(jīng)濟(jì)水生動(dòng)植物資源名錄（第一批）》[14]，漢江襄陽(yáng)市已建立了長(zhǎng)春鳊國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)[15]。近年來長(zhǎng)春鳊逐漸進(jìn)入了學(xué)術(shù)界的視野，但與其他常見經(jīng)濟(jì)淡水魚相比，關(guān)于鳊的繁殖生物學(xué)研究仍然很少，其全人工繁育技術(shù)尚未成熟推廣開來，養(yǎng)殖親本培育技術(shù)不完善，人工繁殖苗種嚴(yán)重不足等因素嚴(yán)重制約了長(zhǎng)春鳊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，本研究采用石蠟切片法觀察了長(zhǎng)春鳊性腺發(fā)育全過程，填補(bǔ)了長(zhǎng)春鳊性腺發(fā)育特征相關(guān)研究的空白，并為長(zhǎng)春鳊的親本培育、規(guī)?；B(yǎng)殖及全人工繁殖技術(shù)的完善提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)魚取自江蘇省靖江市濱江水產(chǎn)良種場(chǎng)2018 年5 月15 日繁育的魚苗，在室內(nèi)培育至體長(zhǎng)約3 cm 后，移至室外池塘養(yǎng)殖。實(shí)驗(yàn)池塘位于長(zhǎng)江口（東經(jīng)120°07′21.27″，北緯31°57′32.75″），養(yǎng)殖用水為漲潮時(shí)引入的長(zhǎng)江水。全程投喂配合飼料（粗蛋白含量≥28%），搭配青飼料。2018 年8 月10 日開始，每月隨機(jī)取樣30 尾，測(cè)定體長(zhǎng)、體質(zhì)量等生物學(xué)指標(biāo)后，解剖取出性腺，固定于10%福爾馬林溶液中備用。

1.2 方法

制片方法參照杜長(zhǎng)雷、徐鋼春等人的方法[16,17]。固定好的樣品經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后連續(xù)切片，切片厚度5 μm。恒溫箱烤片，二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，H·E 染色，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察，拍照。精巢和卵巢的發(fā)育分期按劉筠[10]和王吉橋[18]等提出的分期標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅰ～Ⅵ期；卵細(xì)胞的發(fā)育按樓允東[19]的劃分標(biāo)準(zhǔn)，分為5 個(gè)時(shí)相。

1.3 數(shù)據(jù)處理

成熟系數(shù)計(jì)算公式為：成熟系數(shù)=（性腺質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%。數(shù)據(jù)使用SPSS25.0 和Excel2013進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)春鳊的性腺發(fā)育周年變化

2018 年5 月15 日繁育的魚苗，在本養(yǎng)殖條件下，2018 年8 月性腺出現(xiàn)分化。2019 年3 月卵巢進(jìn)入Ⅱ期，2020 年2 月進(jìn)入Ⅲ期，2020 年5 月進(jìn)入Ⅳ期，2020 年6 月進(jìn)入Ⅴ期，2020 年8 月進(jìn)入Ⅵ期，2020 年9 月退回至Ⅱ期。2019 年2 月精巢進(jìn)入Ⅱ期，2019 年12 月進(jìn)入Ⅲ期，2020 年4 月進(jìn)入Ⅳ期，2020年5 月進(jìn)入Ⅴ期，2020 年8 月進(jìn)入Ⅵ期，2020 年9 月退回至Ⅱ期。實(shí)驗(yàn)魚的具體生物學(xué)數(shù)據(jù)見表1。

表1 長(zhǎng)春鳊的生物學(xué)數(shù)據(jù)Tab.1 Biological data of white bream Parabramis pekinensis

2.2 長(zhǎng)春鳊卵巢的形態(tài)及發(fā)育組織學(xué)特征

長(zhǎng)春鳊的卵巢發(fā)育較精巢略晚，卵母細(xì)胞的發(fā)育可分為5 個(gè)時(shí)相。第1 時(shí)相的卵細(xì)胞主要是卵原細(xì)胞，系由原始生殖細(xì)胞分裂增殖形成。卵原細(xì)胞分布于生殖上皮邊緣，呈橢圓形，細(xì)胞核很大，位于細(xì)胞中央。第2 時(shí)相為卵原細(xì)胞發(fā)育形成的早期初級(jí)卵母細(xì)胞階段。細(xì)胞呈不規(guī)則的圓形，中央大核仁逐漸消失，核膜內(nèi)緣出現(xiàn)數(shù)個(gè)大小不一的小核仁。細(xì)胞質(zhì)含量多，嗜堿性強(qiáng)。此時(shí)細(xì)胞處于小生長(zhǎng)期。第3 時(shí)相的細(xì)胞為大生長(zhǎng)期的初級(jí)卵母細(xì)胞，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，核膜凹凸，出現(xiàn)大小不一的油滴，卵黃開始沉積為小顆粒。第4 時(shí)相，隨著卵黃小顆粒的逐漸增加，卵黃大量積累，油滴數(shù)量增加，體積不斷變大，后期充滿細(xì)胞，細(xì)胞核逐漸不可見，核仁分布于核膜周圍。第5 時(shí)相為發(fā)育成熟的卵細(xì)胞，初級(jí)卵母細(xì)胞向次級(jí)卵母細(xì)胞過渡階段。細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，核膜、核仁消失，其內(nèi)充滿卵黃顆粒和油滴，后期卵黃顆粒融合為板塊，油滴相互融合成油球。根據(jù)卵細(xì)胞的發(fā)育時(shí)相及卵巢形態(tài)特征等，將卵巢發(fā)育分為6 個(gè)時(shí)期。

Ⅰ期卵巢外形與精巢相似，呈一對(duì)透明的條狀細(xì)絲包裹于脂肪中，分布于鰾的腹面兩側(cè)，末端相遇延伸形成輸卵管進(jìn)入泄殖竇。一般出現(xiàn)于3～10月齡的雌性長(zhǎng)春鳊（圖版Ⅰ-1）。切片顯示，主要為第1 時(shí)相的卵原細(xì)胞。

Ⅱ期卵巢體積增大，呈肉紅色，此時(shí)期經(jīng)歷的時(shí)間最長(zhǎng)，一般出現(xiàn)于11～21 月齡的長(zhǎng)春鳊，雌魚產(chǎn)后也退回至Ⅱ期（圖版Ⅰ-2）。切片顯示，卵巢中主要為第2 時(shí)相的卵原細(xì)胞，伴有少量第1 時(shí)相和第3 時(shí)相的卵細(xì)胞（圖版Ⅱ-1、圖版Ⅱ-2）。

圖版Ⅰ 長(zhǎng)春鳊性腺解剖圖Plate Ⅰ Anatomy of gonads in white bream Parabramis pekinensis

圖版Ⅱ 長(zhǎng)春鳊性腺的組織學(xué)切片Plate Ⅱ Histological character of gonadal development in white bream Parabramis pekinensis

Ⅲ期卵巢體積進(jìn)一步增大，一般22 月齡的雌長(zhǎng)春鳊進(jìn)入此期，性腺成熟度為（0.96±0.19）%。卵巢表面可見明顯的血管分布（圖版Ⅰ-4）。切片顯示，細(xì)胞已進(jìn)入初級(jí)卵母細(xì)胞的大生長(zhǎng)期，卵巢中主要為第3 時(shí)相的卵細(xì)胞（圖版Ⅱ-5、圖版Ⅱ-6）。

Ⅳ期卵巢開始出現(xiàn)于24 月齡的雌長(zhǎng)春鳊，性腺質(zhì)量（102.82±0.68）g，性腺成熟度（12.16±0.22）%。卵巢體積增大，顏色變淺為灰白色，表面血管明顯，肉眼可見其內(nèi)的顆粒狀卵子（圖版Ⅰ-6）。切片顯示，卵巢中主要為第4 時(shí)相的卵母細(xì)胞（圖版Ⅱ-9、圖版Ⅱ-10）。

Ⅴ期卵巢發(fā)育成熟。卵巢即為飽滿呈長(zhǎng)囊狀，淡黃色，血管清晰（圖版Ⅰ-8）。切片顯示，卵巢中主要為第5 時(shí)相的卵母細(xì)胞（圖版Ⅱ-13、圖版Ⅱ-14）。

Ⅵ期卵巢明顯萎縮松軟，略充血，呈絳紫色，略透明，肉眼可見少量殘余的卵子分布其中（圖版Ⅰ-10）。切片顯示，卵巢中以第2 時(shí)相的卵細(xì)胞為主（圖版Ⅱ-17、圖版Ⅱ-18）。

2.3 長(zhǎng)春鳊精巢的形態(tài)及發(fā)育組織學(xué)特征

長(zhǎng)春鳊的精巢與大多數(shù)鯉科魚類一樣，屬于小葉型。精巢由小葉間質(zhì)分隔成多個(gè)精小葉，縱橫交錯(cuò)于精巢內(nèi)。精小葉內(nèi)包含多個(gè)精小囊，小囊內(nèi)充斥發(fā)育分化的生殖細(xì)胞。隨著精子的發(fā)生和體積變大，精小囊相繼破裂，成熟的精子釋放入小葉腔，后經(jīng)輸出管進(jìn)入貯精囊，最后從輸精管排出。按照發(fā)育階段的形態(tài)、色澤及生殖細(xì)胞的發(fā)育時(shí)相等，將精巢分為6 個(gè)時(shí)期。

Ⅰ期精巢被脂肪塊包裹，透明，呈細(xì)線狀緊貼與鰾的腹面兩側(cè)，很難分離，肉眼無法直接判斷雌雄，一般出現(xiàn)于3～9 月齡的雄長(zhǎng)春鳊中（圖版Ⅰ-1）。切片顯示，精原細(xì)胞分布于精小葉邊緣，分散于間質(zhì)細(xì)胞之間，呈卵圓形，為精小葉中個(gè)體最大的細(xì)胞。

Ⅱ期精巢體積增大，變粗，顏色加深，逐漸呈不透明的乳白色，血管不清晰。貯精囊仍很小，周圍附有脂肪，一般出現(xiàn)于10～19 月齡的雄長(zhǎng)春鳊中（圖版Ⅰ-3），后期基本可以通過肉眼分辨雌性，15 月齡的雄長(zhǎng)春鳊性腺成熟度約0.03%。切片顯示，精原細(xì)胞直徑變小，嗜堿性，數(shù)量增加，排列成束。結(jié)締組織向內(nèi)部延伸，精小葉形成（圖版Ⅱ-3、圖版Ⅱ-4）。

Ⅲ期精巢明顯增大，呈扁帶狀，乳白色，血管較清晰。貯精囊增大呈一段一段的囊狀，略帶粉紅色，一般出現(xiàn)于20～22 月齡的雄長(zhǎng)春鳊中（圖版Ⅰ-5）。20 月齡的雄長(zhǎng)春鳊性腺重（0.72±0.07）g，成熟度（0.14±0.04）%。切片顯示，精小葉增大，大量的初級(jí)精母細(xì)胞分裂為次級(jí)精母細(xì)胞，并伴有少量的次級(jí)精母細(xì)胞發(fā)育為精細(xì)胞（圖版Ⅱ-7、圖版Ⅱ-8）。生精細(xì)胞同步發(fā)育。

Ⅳ期精巢比較發(fā)達(dá)，貯精囊呈囊狀，較Ⅲ期明顯飽滿，性腺成熟度（1.66±0.12）%，一般出現(xiàn)于23月齡的雄長(zhǎng)春鳊中（圖版Ⅰ-7），后期用力擠壓魚體腹部，有少量白色精液流出。切片顯示，生殖細(xì)胞主要為次級(jí)精母細(xì)胞，小葉腔內(nèi)已有大量的精子（圖版Ⅱ-11、圖版Ⅱ-12）。

Ⅴ期精巢發(fā)育成熟，一般為24 月齡，輕輕擠壓魚體腹部即有白色精液流出。貯精囊極度飽滿呈長(zhǎng)囊狀，乳白色，肥厚。性腺成熟度達(dá)到最高，為（1.87±0.13）%（圖版Ⅰ-9）。切片顯示，部分精小囊破裂，大量成熟的精子充滿于精小葉空腔中（圖版Ⅱ-15、圖版Ⅱ-16）。

Ⅵ期精巢為成熟并排精后的精巢，該期精巢萎縮、松弛，表面充血呈紅色斑塊，其內(nèi)殘留有少量精子（圖版Ⅰ-11）。切片顯示，精小囊中存在各個(gè)時(shí)期的精細(xì)胞（圖版Ⅱ-19、圖版Ⅱ-20）。

由于實(shí)驗(yàn)條件和取樣所限，未獲得Ⅰ期性腺合適的切片照片。

3 討論

3.1 長(zhǎng)春鳊的生殖

關(guān)于魚類性腺發(fā)育的研究很多[20-23]，長(zhǎng)春鳊通常以Ⅲ期性腺越冬，精巢發(fā)育略早于卵巢，性腺發(fā)育期間以Ⅱ期經(jīng)歷的時(shí)間最長(zhǎng)。性腺發(fā)育自Ⅲ期之后需要流水刺激。人工養(yǎng)殖的長(zhǎng)春鳊的性腺只能發(fā)育至Ⅳ期末，必須經(jīng)人工催產(chǎn)誘導(dǎo)其產(chǎn)卵。與大多數(shù)鯉科魚類[4]一樣，長(zhǎng)春鳊的性腺成對(duì)緊貼于鰾的腹面兩側(cè)，在末端匯合后延伸。長(zhǎng)春鳊的精巢呈小葉型或壺腹型。長(zhǎng)春鳊的性成熟年齡與流水環(huán)境和氣候條件有關(guān)。東北地區(qū)的長(zhǎng)春鳊產(chǎn)卵季節(jié)較晚，延續(xù)時(shí)間也較短[13,24]。本研究地點(diǎn)位于長(zhǎng)江下游地區(qū)，性腺的成熟期都在25 月齡前后，這與青菱湖[25]中的長(zhǎng)春鳊生殖期較為接近。

3.2 長(zhǎng)春鳊的產(chǎn)卵類型

硬骨魚類的產(chǎn)卵類型分為兩種[26,27]，即根據(jù)組織學(xué)特征及產(chǎn)卵習(xí)性，分為一次性產(chǎn)卵魚類和多次型產(chǎn)卵魚類。一次性產(chǎn)卵魚類性腺發(fā)育基本同步，在一個(gè)性周期內(nèi)僅產(chǎn)卵一次，對(duì)外界自然條件的依賴性較強(qiáng)，如黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[28,29]、鰣（Alosa sapidissima）[30]等；多次性產(chǎn)卵魚類受外界環(huán)境的影響較小，性腺發(fā)育主要由自身調(diào)節(jié)，如尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[31]等。另一種劃分方式是依據(jù)卵母細(xì)胞的發(fā)育形態(tài)，分為完全同步型、分批同步型和分批非同步型。完全同步型通常一生中僅產(chǎn)卵一次，且產(chǎn)后即死亡，如日本鰻鱺（Anguilla japonica）[32]等；分批同步型的魚類卵巢中一般存在兩個(gè)以上的發(fā)育階段的卵母細(xì)胞，一年產(chǎn)卵一次，產(chǎn)卵期不長(zhǎng)，四大家魚[33]即為此類；分批非同步型的卵巢在生殖期間內(nèi)含有所有發(fā)育階段的卵母細(xì)胞，生殖季節(jié)較長(zhǎng)，一年內(nèi)可以多次產(chǎn)卵，如鯽（Carassius auratus）等。本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)春鳊的卵母細(xì)胞發(fā)育同步性較好，Ⅳ期卵巢內(nèi)主要為第4 時(shí)相的卵母細(xì)胞，Ⅴ期卵巢內(nèi)主要為第5 時(shí)相的卵母細(xì)胞，Ⅵ期卵巢內(nèi)除少量殘余的第5 時(shí)相的卵母細(xì)胞外，主要為第2 時(shí)相的卵細(xì)胞，同一批次的性腺發(fā)育基本處于同一時(shí)期。長(zhǎng)春鳊的產(chǎn)卵類型為分批同步型，這與報(bào)道的長(zhǎng)江流域長(zhǎng)春鳊的繁殖習(xí)性一致。實(shí)際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖的長(zhǎng)春鳊親魚經(jīng)人工誘導(dǎo)產(chǎn)卵后，也不能二次成熟。