王彥云，王濟(jì)世，劉曉夏，趙璐瑤，楊曙明

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081）

中國有4 000 多年的養(yǎng)鯉歷史，是鯉生產(chǎn)與消費(fèi)大國。目前，我國養(yǎng)殖的鯉品種主要為“3 大系列1 個(gè)品系6 個(gè)新品種”，分別為德國鏡鯉選育系、荷包紅鯉抗寒品系、豫選黃河鯉新品系，豫選黃河鯉、松浦鏡鯉、松荷鯉和福瑞鯉，六個(gè)品種占了我國鯉主產(chǎn)區(qū)80%的鯉養(yǎng)殖品種。黃河鯉是目前市場(chǎng)上主要的鯉養(yǎng)殖品種之一，主要是黃河流域省份養(yǎng)殖和食用。黃河鯉價(jià)格高，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，部分養(yǎng)殖者引進(jìn)其他鯉假冒黃河鯉，以謀求較高的經(jīng)濟(jì)回報(bào)。這種做法，既侵犯了消費(fèi)者合法權(quán)益、損害了黃河鯉的名聲，也使得相關(guān)產(chǎn)業(yè)經(jīng)營受損，黃河鯉從業(yè)者的生產(chǎn)積極性嚴(yán)重受挫，黃河鯉真實(shí)性問題亟待解決。

當(dāng)下，主要基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法鑒別鯉。由于鯉生物多樣性下降、鯉品質(zhì)降低、種質(zhì)退化和魚肉加工升級(jí)等的影響，依靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法鑒定黃河鯉品種存在諸多困難，給養(yǎng)殖者和消費(fèi)者造成極大的困擾[1-7]，利用SNP 標(biāo)記技術(shù)則可克服以上缺點(diǎn)。

SNP（Single Ncleotide Polymorphism）又名單核苷酸多態(tài)性，是基因組水平上單個(gè)堿基的變異所引起的DNA 序列的多態(tài)性，屬于第三代遺傳標(biāo)記技術(shù)。由于SNP 標(biāo)記具有存在廣泛、富有代表性、遺傳穩(wěn)定性以及易實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定、產(chǎn)品溯源等[8-16]。

1 材料與方法

1.1 DNA 樣品的準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)樣品共6 個(gè)品種320 個(gè)樣品，包括黃河鯉（Cyprinus carpio）（n=70）、荷包紅鯉（Cyprinus carpio Red var wuyuanensis）（n=50）、福瑞鯉（福瑞鯉2 號(hào)，n=50）、松浦鏡鯉（Cyprinus carpio songpu mirror carp）（n=50）、建鯉（Cyprinus carpio var）（n=50）和豐鯉（Cyprinus carpio）（n=50）。這6 個(gè)品種包含了黃河鯉主產(chǎn)區(qū)常見鯉品種。黃河鯉樣品包括豫選黃河鯉和野生黃河鯉，其中河南省水產(chǎn)研究院豫選黃河鯉原種36 尾，農(nóng)業(yè)部黃河鄭州段野生黃河鯉34 尾；荷包紅鯉樣品采自國家級(jí)婺源荷包紅鯉良種場(chǎng)；福瑞鯉為最新福瑞鯉二號(hào)品種，采自國家新品種福瑞鯉河北繁育基地（唐山市豐南區(qū)豐越泥鰍養(yǎng)殖有限公司）；松浦鏡鯉、建鯉和豐鯉樣品采自養(yǎng)殖戶。所有樣品均使用國標(biāo)方法進(jìn)行了鑒定[17-20]，所有樣品品種無誤。引物由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司合成。

驗(yàn)證樣本從遼寧、山東、河南、四川等鯉養(yǎng)殖大省收集，共有40 個(gè)不同鯉樣本。以黃河鯉之名銷售的樣本20，包括鄭州鯉（n=5）、泰安鯉（n=5）、北京鯉（n=5），河北鯉（n=5）。其他鯉樣本20 個(gè)。

利用GeneJET Genomic DNA 純化試劑盒（Thermo Scientific,#k0721）提取采集的魚肉組織基因組DNA。提取后的樣品，首先用NanoDrop 2 000 c 分光光度計(jì)（Thermo Scientific,USA）檢測(cè)，考察其濃度及純度。然后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓120 V，30～40 min，電泳結(jié)束后凝膠成像系統(tǒng)觀察提取片段的完整性。符合標(biāo)準(zhǔn)的樣品于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 SNP 的挑選

本研究采用兩種方法挑選SNP，一是基于Carpbase 數(shù)據(jù)庫（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心），對(duì)已有SNP 標(biāo)記進(jìn)行挑選，群體驗(yàn)證后選擇位點(diǎn)；二是基于數(shù)量性狀基因，從已報(bào)道的與鯉體色、生長性狀相關(guān)的基因上搜索位點(diǎn)。

1.2.1 基于數(shù)據(jù)庫的挑選

通過Carpbase 數(shù)據(jù)庫檢索，依據(jù)以下三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)挑選位點(diǎn)：（1）從鯉50 條染色體中挑選，根據(jù)每條染色體長度挑選1～4 個(gè)位點(diǎn)，且位點(diǎn)間距離大于8 Mb；（2）所選位點(diǎn)位于染色體非編碼區(qū)；（3）最小等位基因頻率（MAF）大于30%。共獲得候選位點(diǎn)54個(gè)。針對(duì)挑選的54 個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)多重引物，利用多重PCR 反應(yīng)擴(kuò)增模板，產(chǎn)物純化后利用二代測(cè)序平臺(tái)（Illumina X-10 高通量基因分型平臺(tái)）進(jìn)行測(cè)定。二代測(cè)序由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司提供技術(shù)支持（http://www.biowing.com.cn/）。用于數(shù)據(jù)庫位點(diǎn)驗(yàn)證的鯉樣本共計(jì)6 個(gè)品種、170 個(gè)樣本，包括黃河鯉（n=70）、荷包紅鯉（n=20）、福瑞鯉（n=20）、松浦鏡鯉（n=20）、建鯉（n=20）和豐鯉（n=20）。54 個(gè)位點(diǎn)多重測(cè)序引物見表1。PCR 擴(kuò)增體系共12 μL，其中：ddH2O 2 μL，Mix 6 μL，1 μM Primer 2 μL，DNA Sample 1.8 μL，ROS 0.24 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃160 min，然后94℃30 sec，60℃30 sec，72℃30 sec，共35 個(gè)循環(huán)，最后4℃∞。

表1 54 個(gè)SNP 位點(diǎn)測(cè)序引物Tab.1 Primer information of the 54 SNP markers

多重PCR 產(chǎn)物純化后，使用Agilent 2100 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)控。

1.2.2 基于性狀基因的挑選

通過NCBI 和Carpbase 數(shù)據(jù)庫檢索及文獻(xiàn)報(bào)道，選擇了與鯉體色、生長性狀、肉質(zhì)性狀相關(guān)的53個(gè)基因[21-23]（表2）。上述53 個(gè)性狀基因，每個(gè)基因選取1～5 個(gè)基因片段，考察各基因片段同源性，去除高同源，最終得到111 個(gè)可用待測(cè)片段。目標(biāo)區(qū)域重測(cè)序結(jié)合多重PCR 技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)待測(cè)片段設(shè)計(jì)多重PCR 引物。PCR 擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序同1.2.1。用于測(cè)序的樣本共計(jì)130 個(gè)，包括黃河鯉（n=30）、荷包紅鯉（n=20）、福瑞鯉（n=20）、鏡鯉（n=20）、建鯉（n=20）和豐鯉（n=20）。高通量測(cè)序由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司提供技術(shù)支持。測(cè)序結(jié)果通過SepMAN 軟件比對(duì)多樣本相同擴(kuò)增序列，獲得目標(biāo)樣本候選多態(tài)性位點(diǎn)，圖1 為某個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)高通量測(cè)序散點(diǎn)圖。由圖1 可知，該位點(diǎn)在鯉測(cè)試群體中基本不發(fā)生突變，主要以“T”的純合子形式存在。

圖1 高通量測(cè)序結(jié)果Fig.1 High-throughput sequencing results

表2 性狀基因所在染色體及其他相關(guān)信息Tab.2 Chromosome location of trait genes and other relevant information

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

通過直接計(jì)數(shù)方式獲得各位點(diǎn)在樣品群體中的等位基因頻率、基因型頻率[24]。根據(jù)公式計(jì)算耦合概率（matching probability,MP）[25]。

式中，m-位點(diǎn)數(shù)；n-位點(diǎn)k 等位基因數(shù)；Pki(j)-位點(diǎn)k 等位基因i、j 等位基因頻率。

2 結(jié)果與討論

2.1 位點(diǎn)篩選結(jié)果

通過兩種方式獲得的多態(tài)性位點(diǎn)，還需進(jìn)一步挑選以滿足黃河鯉鑒定的需要。挑選標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）位點(diǎn)在黃河鯉（或普通鯉）中多態(tài)性較高，兼具兩種純合子和一種雜合子，位點(diǎn)在普通鯉（或黃河鯉）中多態(tài)性低，只具有一種純合子；（2）位點(diǎn)在多態(tài)性較高的鯉品種中MAF 大于0.3，在多態(tài)性較低的品種中MAF 小于0.05。

按照以上挑選標(biāo)準(zhǔn)，共得到候選位點(diǎn)27 個(gè)。27個(gè)位點(diǎn)所在染色體及基因等信息見表3，位點(diǎn)在各鯉群體中的等位基因頻率見表4。

表3 27個(gè)SNP 位點(diǎn)所在染色體位置信息Tab.3 Chromosomal location information of 27 SNP sites

2.2 黃河鯉的鑒定效果評(píng)估

27 個(gè)位點(diǎn)對(duì)黃河鯉與不同品種普通鯉的區(qū)分能力存在差異（表4）。為提高標(biāo)記組特異性,提高鑒別效率，按照區(qū)分能力對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行排序，選擇區(qū)分能力較好的12 個(gè)標(biāo)記，用于黃河鯉與普通鯉品種的鑒別（表5）。黃河鯉被錯(cuò)誤鑒定為普通鯉的概率用MP 值表示（圖2）。

表4 27 個(gè)SNP 標(biāo)記在各品種中等位基因頻率Tab.4 The allele frequencie of 27 SNPs in each variety

由表5 和圖2 可知，只需1～3 個(gè)標(biāo)記就可實(shí)現(xiàn)黃河鯉與其中一個(gè)普通鯉品種的鑒別，而豐鯉與黃河鯉的鑒別只需1 個(gè)特異性標(biāo)記即可。使用12 個(gè)SNP 位點(diǎn)組合，黃河鯉與各品種普通鯉鑒別效果較好，MP 值均小于6×10-5。其中，黃河鯉與松浦鏡鯉、豐產(chǎn)鯉的鑒別效果最好，MP 值均接近于0；黃河鯉與荷包紅鯉、福瑞鯉、建鯉的鑒別效果較好，MP 值在1×10-5～6×10-4之間。12 個(gè)SNP 位點(diǎn)組合特異性較高，理論上可以滿足黃河鯉在80%鯉主產(chǎn)區(qū)的鑒別要求。進(jìn)一步利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)40 個(gè)驗(yàn)證樣本12 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行分型，依據(jù)分型結(jié)果對(duì)樣本進(jìn)行鑒別（表6）。

表5 12 個(gè)SNP 標(biāo)記位點(diǎn)信息Tab.5 Information of the twelve SNP loci

表6 40 個(gè)樣本鑒別結(jié)果Tab.6 Identification results of 40 samples

圖2 黃河鯉與普通鯉MP 值Fig.2 MP values of Yellow River carp and common carp

由表6 可知，鄭州鯉全部鑒別為黃河鯉；泰安鯉、北京鯉以及河北鯉有少部分樣本并非黃河鯉，而是福瑞鯉和建鯉；其他鯉樣本僅有一個(gè)為黃河鯉，其余樣本均為福瑞鯉。值得注意的是，40 個(gè)驗(yàn)證樣本有一半為福瑞鯉，黃河鯉銷售市場(chǎng)存在大量福瑞鯉的主要原因有以下兩點(diǎn)：（1）福瑞鯉為野生黃河鯉和建鯉雜交選育的新品種，具有黃河鯉部分優(yōu)良性狀，與黃河鯉極為相似，深受養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的喜愛；（2）福瑞鯉為我國鯉主產(chǎn)區(qū)六大鯉養(yǎng)殖品種之一，具有養(yǎng)殖范圍廣、產(chǎn)量大的特點(diǎn)。

3 結(jié)論

本研究通過數(shù)據(jù)庫挑選和性狀基因搜索，共得到27 個(gè)SNP 候選位點(diǎn)。理論上只需12 個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)組合，就可滿足黃河鯉在我國80%以上鯉主產(chǎn)區(qū)的鑒定，黃河鯉鑒定錯(cuò)誤率小于6×10-5。利用標(biāo)記組合對(duì)40 個(gè)驗(yàn)證樣本進(jìn)行鑒定，以黃河鯉之名銷售的20 個(gè)樣本，只有鄭州鯉全部為黃河鯉，其他20個(gè)鯉樣本多為福瑞鯉。在實(shí)際應(yīng)用中，還可根據(jù)所處省份的不同，按照當(dāng)?shù)鼐唧w情況對(duì)位點(diǎn)進(jìn)行選擇，這樣可大幅降低標(biāo)記的數(shù)量，提高鑒別效率。在應(yīng)用方面，可以考慮將等位特異性PCR 分型與毛細(xì)管電泳結(jié)合[26]，實(shí)現(xiàn)SNP 位點(diǎn)快速分型，這有助于在中小企業(yè)應(yīng)用推廣黃河鯉SNP 溯源，有利于黃河鯉的市場(chǎng)銷售，保障消費(fèi)者的合法權(quán)益[27]。