孫洪玲，雷 培，劉 碩，劉佳琪，董 坤，董 暢，張亞茹，孟凡娟*

（1 東北林業(yè)大學生命學院，哈爾濱 150040；2 黑龍江省農業(yè)科學院園藝分院，哈爾濱 150030；3 西昌學院，四川西昌 615000）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta[Sieb.et Zucc.]Planch.ex Miq.）屬于獼猴桃科獼猴桃屬植物，為大型落葉藤本植物，分布廣闊，從我國北方的黑龍江至南方的廣西，廣大山區(qū)均有分布，生態(tài)類型多樣。其果實鮮美，表皮無毛，富含多種營養(yǎng)物質。不同的環(huán)境條件對其生長的影響較大。尤其黑龍江地區(qū)，溫度變化較大，直接導致栽培型軟棗獼猴桃的植株受害。因此，了解軟棗獼猴桃對溫度變化的應答機制較為重要，但此類研究卻較少。當前對軟棗獼猴桃的低溫脅迫研究主要集中在種質資源及新品種選育、果實、抗寒基因的篩選與鑒定，以及抗寒機制的研究等方面。國內對主要分布在遼寧、吉林、北京及黑龍江等地的軟棗獼猴桃進行低溫脅迫研究。同時，目前有關研究也主要集中于某一時間點或者某一固定溫度對軟棗獼猴桃生長的影響。但是室內外的條件不一致，通常室外的條件變化較大，然而在室內外不同時間、 不同溫度條件下研究軟棗獼猴桃對環(huán)境的響應機制更接近生產實際。鑒于此，本研究選擇我國東北地區(qū)哈爾濱軟棗獼猴桃的主要起源地，針對該地區(qū)11月溫度變化較為劇烈的現(xiàn)象展開研究。這個季節(jié)主要表現(xiàn)為氣候多變，降溫急劇，且溫度日變化劇烈；另外，此時還存在0 ℃左右波動的日變化特點，有利于我們對頻繁的溫度變化與軟棗獼猴桃植株生長之間關系的研究提供一些理論依據。

1 材料與方法

試驗于2020年11月在黑龍江省農業(yè)科學院軟棗獼猴桃試驗站進行，軟棗獼猴桃栽培品種為‘魁綠’‘龍城二號’‘豐綠’，均為人工培育的品種。栽培方式為溫室和露地，溫室選取‘魁綠’和‘龍城二號’，露地選取‘魁綠’和‘豐綠’，均選一年生枝條進行試驗。

1.1 測定項目與方法

1.1.1 溫度及濕度

將溫度計、 濕度計固定在溫室和露地可有效測定的地點，選取一天中的7:00、12:00、16:00 記錄溫度和濕度。

1.1.2 組織化學染色

染色方法參照雷培的方法并做部分修改。使用四唑氮藍（NBT）和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）對超氧陰離子（O）和過氧化氫（HO）進行組織化學染色。采集不同時期的軟棗獼猴桃莖段，分別浸在0.5 mg·mLNBT 溶液和0.5 mg·mLDAB 溶液中，并用錫箔紙包裹避光放置6 h，將染色好的莖段用95%乙醇80 ℃漂洗直至完全去除葉綠素，其間更換乙醇，最后用乳酸∶苯酚∶水（1∶1∶1，v/v）固定，觀察和拍照。

1.1.3 丙二醛（MDA）、可溶性糖、脯氨酸（Pro）含量和水勢的測定

丙二醛（MDA）測定方法采用硫代巴比妥酸法；可溶性糖含量測定采用硫酸蒽酮法；游離脯氨酸（Pro）含量的測定采用茚三酮比色法；水勢利用TPPW-Ⅱ植物水勢儀對軟棗獼猴桃枝條進行測定。

1.2 數(shù)據處理

采用Excel 2010 進行數(shù)據的整理，利用Graphpad Prism 6 制圖，采用SPSS 16.0 進行相關顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 溫、濕度的變化

從表1可以看出，在11月這幾個時間段，7:00露地和溫室的最低溫度均出現(xiàn)在11月10日，分別為-10°C 和1.6°C； 露地和溫室的最高濕度均出現(xiàn)在11月13日，分別為82%和81%。12:00，露地和溫室的最低溫度均出現(xiàn)在11月10日，分別為1°C 和11°C；露地的最高濕度出現(xiàn)在11月15日，為46%，溫室的最高濕度出現(xiàn)在11月10日，為72%。16:00，露地的最低溫度出現(xiàn)在11月2日，為-3°C，溫室的最低溫度出現(xiàn)在11月2日和11月10日，均為9°C；露地最高濕度出現(xiàn)在11月2日，為58%，溫室最高濕度出現(xiàn)在11月10日，為82%。綜上所述，11月10日，露地和溫室的溫度最低。除11月13日7:00 外，露地濕度均低于溫室濕度，且顯著差異。11月，溫室的最低溫度均在0°C 以上，最高溫度可達33.1°C，且溫室的濕度和露地濕度差異明顯。因此，本試驗設置兩個不同種植地點對軟棗獼猴桃枝條的影響特點進行測定分析。

表1 11月的溫、濕度變化

2.2 氧化程度

圖1中DAB染色結果顯示，11月7日各品種的染色程度明顯比后面3個時間淺；11月10日和11月13日的12:00，每個品種較7:00和16:00的染色效果明顯，且11月10日的染色程度更深；11月15日的7:00和16:00，每個品種的DAB染色程度明顯比前3個時間深；11月15日露地‘魁綠’的染色程度低于溫室‘魁綠’。

圖1中NBT 染色結果顯示，11月15日，各品種的NBT 染色程度高于前3 個時間，與DAB 染色結果一致。而露地‘魁綠’的NBT 染色程度均高于溫室‘魁綠’，說明露地溫濕度導致植株產生更多的活性氧（ROS）。從NBT 染色可以看出，枝條已經出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，露地‘魁綠’的褐變現(xiàn)象比溫室嚴重，且11月15日最為嚴重。

圖1 枝條DAB 和NBT 的染色

2.3 MDA 的變化

由圖2可知，11月2日，MDA 含量達到最高值，此時的最低溫度為-2°C。露地‘豐綠’MDA 含量最高，為4.54 μmol·gFW，且露地‘魁綠’MDA 含量高于溫室，溫室中MDA 含量變化不明顯。11月7日，各品種MDA含量均呈現(xiàn)先下降后上升趨勢。7:00，溫室溫、濕度分別為4.4°C 和73%，其中‘龍城二號’MDA 含量具有最大值，為2.26 μmol·gFW，且溫室‘魁綠’MDA 含量高于露地‘魁綠’。12:00 和16:00，露地‘豐綠’MDA 含量具有最大值，分別為2.197 μmol·gFW 和2.18 μmol·gFW，且露地‘魁綠’MDA 含量高于溫室‘魁綠’。

圖2 枝條MDA 含量變化

11月10日，溫、濕度差異顯著，露地‘魁綠’、溫室‘魁綠’‘龍城二號’均呈現(xiàn)上升趨勢，露地‘豐綠’呈現(xiàn)先下降后上升趨勢。16:00，露地‘豐綠’MDA 含量較高，為2.26 μmol·gFW；溫室出現(xiàn)最低溫度9°C，其中‘龍城二號’MDA 含量較高，為2.13 μmol·gFW。11月13日7:00，露地‘魁綠’和溫室‘龍城二號’均出現(xiàn)最大值，分別為1.8、2.0 μmol·gFW，此時濕度差異不顯著。11月15日，露地‘魁綠’、溫室‘魁綠’‘龍城二號’MDA 含量最大值均出現(xiàn)在16:00，分別為1.83、1.93、2.25 μmol·gFW。7:00 露地‘豐綠’出現(xiàn)最大值，為1.83 μmol·gFW。綜上所述，11月7—15日，露地‘魁綠’MDA 含量低于‘豐綠’，溫室‘魁綠’MDA 含量低于‘龍城二號’。

2.4 水勢的變化

由圖3可以看出，隨著脅迫時間增加，各品種的水勢7:00 呈現(xiàn)先降低后升高趨勢，說明水勢與溫、濕度具有較大相關性。11月7日7:00，各品種出現(xiàn)水勢最低值，但差異不顯著。露地‘魁綠’‘豐綠’、溫室‘魁綠’‘龍城二號’的水勢值分別為-3.30、-3.57、-3.64、-3.81 MPa。從11月2—13日，各品種的水勢值差異不顯著。僅11月15日，各品種的水勢值差異顯著，此時的水勢值分別為-2.70、-2.93、-2.21、-3.44 MPa。16:00，各品種的水勢值逐漸降低，與溫度密切相關。從11月10日開始，水勢下降明顯，水勢值均在-3.5 MPa 左右波動，此時露地和溫室溫度分別為0°C 和9°C，濕度分別為38%和82%。11月2—7日，露地‘魁綠’的水勢值高于溫室‘魁綠’；而11月10—15日，露地‘魁綠’的水勢值低于溫室‘魁綠’。由此看出，11月10日之后的溫濕度變化對植株水勢影響明顯。

圖3 枝條水勢變化趨勢

2.5 可溶性糖和脯氨酸的變化

由圖4可知，隨著脅迫時間增加，可溶性糖含量呈現(xiàn)先降低后上升再下降趨勢，這與溫度密切相關。除11月2日外，露地‘魁綠’的可溶性糖含量均高于溫室‘魁綠’。11月10日，各品種呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，露地‘魁綠’和溫室‘龍城二號’16:00 出現(xiàn)最大值，分別為19.29、13.68 mg·g；露地‘豐綠’和溫室‘魁綠’7:00 出現(xiàn)最大值，分別為18.16 、14.41 mg·g。經過11月10日的最低溫度和最高濕度脅迫后，各品種的可溶性糖含量在11月13日7:00 出現(xiàn)最大值，分別為30.06、26.71、20.76、25.36 mg·g。與11月13日數(shù)據相比，11月15日露地軟棗獼猴桃的可溶性糖含量降低，此時的溫度相對較低、濕度相對較高。

圖4 枝條可溶性糖含量變化

由圖5可以看出，隨著脅迫時間增加，溫室‘魁綠’脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，露地‘魁綠’脯氨酸含量變化不明顯。11月7日，露地‘魁綠’‘豐綠’脯氨酸含量無明顯差異；溫室‘魁綠’‘龍城二號’脯氨酸含量達到最大值，分別為0.90、0.80 μg·gFW。11月10日，各品種的脯氨酸含量差異不顯著，露地‘魁綠’脯氨酸含量均高于溫室‘魁綠’。其中12:00，露地‘豐綠’含量最低，為0.06 μg·gFW，此時露地和溫室最低溫度分別為-10°C 和1.6°C，最高濕度均為82%。11月7日后，各品種的脯氨酸含量差異不顯著。

圖5 枝條脯氨酸含量變化

3 討論

本文選取溫度在0 ℃上下波動的日期，通過不同環(huán)境對不同軟棗獼猴桃品種的影響，記錄其DAB 和NBT 染色情況，以及MDA、水勢、可溶性糖及脯氨酸含量的變化，為探究溫、濕度變化對不同軟棗獼猴桃品種的影響，以及是否主要受溫度影響提供理論依據。

植物在受到低溫脅迫后，最直觀的表現(xiàn)就是形態(tài)變化，生理生化方面的改變。在本試驗中溫濕度對植物的生理指標影響較大，且溫度較低時更加明顯。當植株遭受最初的低溫脅迫時，植物體內開始生成大量的有害物質MDA，利用可溶性糖和脯氨酸等起保護作用的物質來抵御低溫脅迫；之后其生成的MDA、可溶性糖和脯氨酸含量均有所下降。說明溫濕度對植株進行冷馴化，使其具有耐受性。林苗苗指出，軟棗獼猴桃在低溫脅迫過程中，MDA 出現(xiàn)累積現(xiàn)象，但是可溶性糖和脯氨酸等滲透調節(jié)物質會起到不同程度的保護作用。軟棗獼猴桃在越冬過程中滲透調節(jié)物質 （其中包括可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸）含量升高，但抗寒性不同的軟棗獼猴桃，其滲透調節(jié)物質含量也存在明顯差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫時間的增加，16:00 軟棗獼猴桃各品種的染色程度普遍濃于7:00 和12:00，說明16:00 較7:00 和12:00 對軟棗獼猴桃枝條傷害大。露地‘魁綠’NBT 染色程度都要高于溫室，說明露地溫、濕度對植物的脅迫傷害高于溫室，主要受溫度影響較大。低溫脅迫條件下，植物枝條的皮層、韌皮部、木質部和形成層會失水，導致枝條內部發(fā)生褐變現(xiàn)象。因此，可以根據枝條的褐變程度判斷植物的抗寒性強弱。鐘海霞指出，多年生枝條的抗寒性強于一年生枝條，但在低溫脅迫嚴重時多年生枝條也會出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。從NBT 染色中可以看出，枝條已經出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，說明枝條遭受低溫脅迫，但露地‘魁綠’的褐變現(xiàn)象比溫室‘魁綠’的嚴重，說明露地的低溫脅迫更嚴重，且在11月15日尤為嚴重。

MDA 為過氧化反應產物，可用來表現(xiàn)植物的損傷程度。11月2日的MDA 含量達到最高值，溫室‘魁綠’和‘龍城二號’的MDA 含量變化不明顯，說明溫室溫、濕度對品種的影響不顯著。11月7—15日，露地‘魁綠’的MDA 含量低于‘豐綠’，溫室‘魁綠’的MDA 含量低于‘龍城二號’，表明‘魁綠’具有較強的耐寒性。7:00和16:00，每個品種的MDA 含量升高，此時對軟棗獼猴桃的傷害最大，說明MDA 含量與溫度呈負相關。

經過11月10日的最低溫和最高濕度脅迫后，水勢具有明顯的下降趨勢，脯氨酸含量變化不明顯，MDA和可溶性糖含量從11月13日開始呈上升趨勢。嚴岳華指出，當溫度降低時，會直接或者間接地對植物造成水分脅迫，使細胞脫水，膜系統(tǒng)受害，透性加大，滲透勢降低，水勢也降低。該結論與本試驗結果相近。當植株受到逆境脅迫時，通過可溶性糖的滲透調節(jié)作用來抵抗逆境脅迫。在本研究中，隨著脅迫時間增加，可溶性糖含量呈現(xiàn)上升趨勢，說明溫、濕度對軟棗獼猴桃影響較大。脯氨酸在植物抗逆境脅迫中起著多重作用，可作為滲透調節(jié)劑、蛋白質和細胞膜的穩(wěn)定劑。植物受脅迫后合成親水的脯氨酸，以維持細胞膨脹狀態(tài)。脯氨酸含量逐漸增加。在本研究中，11月7日，溫室 ‘魁綠’和‘龍城二號’脯氨酸含量達到最大值，說明在一定的溫、濕度范圍內，溫、濕度有利于溫室品種的脯氨酸積累。

4 結論

露地條件下，適當?shù)牡蜏卦谝欢ǔ潭壬峡梢蕴岣哕洍棲J猴桃的耐寒性。隨著低溫脅迫的增加，DAB 和NBT 染色程度加深，MDA（丙二醛）、可溶性糖和脯氨酸呈現(xiàn)上升趨勢，水勢呈下降趨勢。在本研究中，露地的溫、濕度對軟棗獼猴桃生長影響較大，可溶性糖和脯氨酸在不同程度上起到保護作用，導致露地軟棗獼猴桃在一定程度上對低溫的抵御性更強。