任蕓蕓，胡文杰，張 莎

(1.銅川職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 銅川 727031；2.橫河電機(jī)（中國(guó)）有限公司，陜西 西安 710075；3.陜西科技大學(xué)，陜西 西安 710021)

0 引言

我國(guó)工業(yè)發(fā)展迅猛，對(duì)于原材料及產(chǎn)品生產(chǎn)能力的需求日益增多，而由此產(chǎn)生的資源開采和后續(xù)產(chǎn)業(yè)排放引起的環(huán)境問(wèn)題也愈發(fā)嚴(yán)重，其中重金屬污染由于毒性強(qiáng)、存在期長(zhǎng)最引人擔(dān)憂[1]。Cu 作為典型的重金屬污染物，由于其使用范圍廣泛，成為了最嚴(yán)重的重金屬污染之一[2]。 雖然微量Cu 是生物體生長(zhǎng)發(fā)育的必須元素，但濃度過(guò)高時(shí)將會(huì)引起生物體代謝紊亂并進(jìn)而形成毒害作用[3]，并通過(guò)水流沖刷以及隨水流向下滲透等方式進(jìn)入地球的水循環(huán)，并最終通過(guò)生物鏈超量累積于生物體內(nèi)，對(duì)生物體造成長(zhǎng)期毒害作用[4]。 因此，近年來(lái)對(duì)Cu 污染水體的有效處理已經(jīng)逐漸引起關(guān)注。

重金屬污染水體的修復(fù)的方法主要有3 類：物理、化學(xué)及生物修復(fù)法。 其中，生物修復(fù)法由于修復(fù)成本低、 環(huán)境友好性強(qiáng)以及無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[5]。 CHOI Y S 等[6]研究利用蚯蚓處理含Cu 和Hg 的泥土，結(jié)果表明處理后污泥中的Cu 含量降低了23.86%。 楊世勇等[7]研究發(fā)現(xiàn)高山甘薯可以有效富集Cu，富集量可達(dá)12 300 mg/kg。 李影等[8]研究了蕨類草本植物對(duì)Cu 的富集作用，結(jié)果表明節(jié)節(jié)草和蜈蚣草分別具有耐性強(qiáng)和生物量大的優(yōu)點(diǎn)，是Cu 污染修復(fù)的理想植物。 近年來(lái)興起的重金屬藻類修復(fù)技術(shù)逐漸被寄予厚望[9-10]，其對(duì)比一般植物修復(fù)及微生物修復(fù)技術(shù)，更具有繁殖快、易回收及吸附量大等優(yōu)點(diǎn)。 馬艷等[11]利用藻菌生物膜處理鉛鋅尾礦渣中的重金屬，結(jié)果表明，藻菌生物膜可以通過(guò)胞外聚合物 （EPS） 與重金屬的絡(luò)合來(lái)吸附重金屬，其中對(duì)Pb2+的吸附能力最強(qiáng)。目前的研究已證明了藻類及藻菌生物膜對(duì)部分重金屬具有良好的去除效果。研究擬利用城市自然水體，通過(guò)富集培養(yǎng)及掛膜制備藻菌生物膜，并對(duì)含Cu2+模擬廢水進(jìn)行處理，以驗(yàn)證藻菌生物膜對(duì)Cu2+的吸附效果及其胞外聚合物的變化，可為Cu 污染水體的生物修復(fù)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藻菌富集培養(yǎng)及掛膜所使用原始水樣取自西安市長(zhǎng)樂(lè)公園芙蓉湖。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

過(guò)高濃度的重金屬將對(duì)微生物產(chǎn)生脅迫毒害作用，因此在研究中一般設(shè)計(jì)ρ（Cu2+）為0.5～30 mg/L[12-13]。 各因素對(duì)Cu2+吸附影響的實(shí)驗(yàn)設(shè)置如下：

（1）pH 值

模擬廢水ρ（Cu2+）為1 mg/L，室溫，pH 值分別為：3，4，5，6，7，8，9，共7 個(gè)梯度，處理第2 天取樣檢測(cè)Cu2+濃度；

（2）溫度

模擬廢水ρ （Cu2+） 為1 mg/L，溫度分別為：25，30，35，40，45 ℃，共5 個(gè)梯度，處理第2 天取樣檢測(cè)Cu2+濃度；

（3）初始濃度

模擬廢水ρ（Cu2+）初始分別為1，5，10，15，20 mg/L，共5 個(gè)梯度，室溫，處理第3 天取樣檢測(cè)Cu2+濃度、多聚糖及ATP 含量；

（4）吸附時(shí)間

模擬廢水ρ（Cu2+）為1mg/L，室溫，在運(yùn)行前取樣，并在之后每隔1 d 取樣檢測(cè)Cu2+濃度、多聚糖及ATP 含量。 并設(shè)置ρ（Cu2+）=0 mg/L 為空白對(duì)照組。

上述實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)組；

（5）連續(xù)吸附實(shí)驗(yàn)

模擬廢水ρ（Cu2+）為16 mg/L，反應(yīng)器有效容積為16 L，其中含有6 串掛好膜的填料，利用蠕動(dòng)泵連續(xù)進(jìn)水及出水，流速為50 mL/h，室溫，每隔1 d 取樣檢測(cè)Cu2+濃度，實(shí)驗(yàn)裝置見圖1。

圖1 含Cu2+廢水連續(xù)處理裝置示意

1.3 實(shí)驗(yàn)流程

（1）藻菌富集培養(yǎng)及掛膜

取回一定量水樣后，在容積為20 L 的有機(jī)玻璃圓桶中進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)條件為：自然光照下室溫（夏季）培養(yǎng)，用空壓機(jī)進(jìn)行曝氣，同時(shí)加入16 L 滅菌后的液體培養(yǎng)基供培養(yǎng)生物膜用（培養(yǎng)基成分：每升培養(yǎng)基包含滅菌米湯水100 mL，Ca(NO3)2·4H2O 0.25 g；NaCl 0.3 g； MgSO4·7H2O 0.05 g；KH2PO40.05 g；ZnSO4·7H2O 0.05 g；NaHCO30.02 g；FeCL3，MnCl2，Na2MoO·H2O，CuSO4·5H2O 痕量），之后每10 d 加1次培養(yǎng)基至原水位線。 培養(yǎng)1 個(gè)月后用半軟性填料掛膜15 d，得到藻菌生物膜備用。

（2）藻類鑒別

用壓滴法[14]制作藻類的標(biāo)本片，通過(guò)顯微鏡（CX41RF，奧林帕斯有限公司）放大1 000 倍觀察。為便于采集生物膜樣品，每片填料上平行懸置2 片載玻片。 載玻片使用前經(jīng)洗滌劑浸泡24 h 后用去離子水清洗再放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的硝酸溶液中浸泡24 h，重復(fù)2 次后用去離子水洗凈。

（3）Cu2+濃度設(shè)置

使用CuSO4·5H2O（分析純）配置質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的濃縮液，然后在500 mL 培養(yǎng)所得菌液中加入相應(yīng)量的濃縮液得到不同初始濃度的溶液。使用NaOH（分析純）和HCl（分析純）調(diào)節(jié)pH 值，采用pH 計(jì)（PHS-3C,北京普析通用儀器有限公司）測(cè)定pH 值，使用水浴加熱鍋調(diào)節(jié)運(yùn)行溫度。 開始運(yùn)行時(shí)各處理組加入1 片掛好膜且長(zhǎng)勢(shì)相似的藻菌生物膜；

（4）Cu2+濃度及胞外聚合物含量測(cè)定

從反應(yīng)器中取100 mL 水樣，用鑷子刮取載玻片上約2 cm3生物膜，一同放入離心機(jī)中在6 000 r/min轉(zhuǎn)速，20 ℃條件下離心10 min，取上清液測(cè)水樣中Cu2+濃度，并將離心后的生物膜分成2 份，分別稱量重量并測(cè)定生物膜中多聚糖和ATP 含量。

1.4 檢測(cè)方法

（1）Cu2+濃度測(cè)定采用火焰法[15]。取100 mL 水樣放入150 mL 錐形燒杯中，加入硝酸5 mL，在電熱板上加熱消解（不要沸騰），蒸至10 mL 左右，再加入5 mL HNO3，2 mL HClO4，繼續(xù)消解至1 mL 左右，取下冷卻，并加水稀釋至100 mL，過(guò)濾后用原子吸收光譜儀（AnaLyst 800，Perkin ELmer）測(cè)定其濃度。 同時(shí)做空白樣；

（2）多聚糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法測(cè)定[16]。 將離心后的1 份生物膜放入10 mL 試管中加入1 mL去離子水并充分混合，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1 mL，搖勻后迅速加入5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的H2SO4在黑暗環(huán)境中反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后，再震蕩10 s，最后將試管置于30 ℃水浴中10 min 后，使用紫外分光光度計(jì)（Tu-1901，肇慶市高能達(dá)化工有限公司）在490 nm 處比色測(cè)定吸光度，并根據(jù)標(biāo)曲得出多聚糖濃度；

（3）ATP 的測(cè)定采用間接測(cè)定法[17]。 將離心后的1 份生物膜加入裝有1 mL 去離子水的試管中，完全混合后加入2.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的H2SO4，然后用紗布蓋上、封嚴(yán)，置于溫度128 ℃高壓鍋加壓15 min 后取出，室溫下冷卻后，加1～2 滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2溶液，搖勻，用2 mL 去離子水稀釋，然后再給各管加定磷試劑3 mL，置于45 ℃水浴25 min，取出冷卻至室溫，在紫外分光光度計(jì)660 nm 處比色測(cè)定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出ATP 濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用DPS 7.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；Origin Pro 8.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻菌生物膜的培養(yǎng)及鑒別

藻菌微生物的富集過(guò)程及后續(xù)掛膜過(guò)程見圖2。

圖2 藻菌生物膜圖像

由圖2（a）可以看出，藻菌微生物在富集30 d 后培養(yǎng)液顏色明顯加深，說(shuō)明微生物富集濃度顯著提升，并通過(guò)軟性填料成功掛膜，得到長(zhǎng)勢(shì)良好的藻菌微生物掛膜片。由圖2（b）可以看出，通過(guò)1 000 倍放大顯微鏡對(duì)培養(yǎng)液中的微生物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)此類微生物細(xì)胞呈現(xiàn)為橢圓形或球形，顏色表現(xiàn)為淡綠色，整體為無(wú)一定數(shù)目的群體或單細(xì)胞。 與《微生物的鑒別與圖譜》 進(jìn)行對(duì)比確認(rèn)此類微生物符合綠藻門小球藻屬微生物的典型特征。

2.2 不同處理參數(shù)對(duì)生物膜處理含Cu2+廢水效果的影響

不同處理參數(shù)下藻菌微生物對(duì)含Cu2+模擬廢水的處理效果見圖3。

圖3 各處理參數(shù)對(duì)生物膜處理含Cu2+廢水效果的影響

由圖3（a）可以看出，在Cu2+初始濃度為1 mg/L、溫度為35 ℃條件下處理1 d，藻菌微生物對(duì)Cu2+的吸附效率隨pH 值增加先升高后降低，在pH 值為5時(shí)達(dá)到最佳，吸附量為0.183 7 mg，去除率為36.73%，后續(xù)逐漸降低。 整體而言，酸性環(huán)境下的處理效果優(yōu)于堿性條件；

由圖3（b）可以看出，pH 值為7，微生物在35 ℃時(shí)具有最佳的處理效果，Cu2+吸附量為0.175 0 mg，去除率為34.99%； 當(dāng)溫度超過(guò)40 ℃后，微生物對(duì)Cu2+的吸附效率較低溫時(shí)明顯下降；

由圖3（c）可以看出，當(dāng)初始質(zhì)量濃度不超過(guò)15 mg/L 時(shí)，微生物對(duì)Cu2+的吸附效率隨初始質(zhì)量濃度的升高而升高，在15 mg/L 時(shí)，吸附量達(dá)到最高，為2.565 8 mg；但當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)15 mg/L 時(shí)，吸附效率明顯下降；

由圖3（d）可以看出，吸附效果隨時(shí)間增加而升高，處理1 d 時(shí)Cu2+吸附最快，Cu2+濃度明顯降低，Cu2+吸附量和去除率分別為2.303 mg 和57.59%，之后吸附量增速減緩，6 d 后分別為2.877 2 mg 和71.93%，此時(shí)模擬廢液中ρ（Cu2+）為0.280 7 mg/L。

2.3 生物膜處理含Cu2+廢水的動(dòng)力學(xué)及擬合

對(duì)含Cu2+廢水的動(dòng)態(tài)處理過(guò)程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)擬合，所采用的動(dòng)力學(xué)模型方程及擬合參數(shù)見表1，擬合結(jié)果見圖4。 一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型都能較好的驗(yàn)證數(shù)據(jù)，表明藻菌微生物膜可在3 d內(nèi)較高效的處理含Cu2+廢水。

表1 生物膜處理含Cu2+廢水動(dòng)力學(xué)擬合及參數(shù)

圖4 生物膜處理含Cu2+廢水的動(dòng)力學(xué)擬合

2.4 含Cu2+廢水對(duì)生物膜胞外聚合物的影響

處理含Cu2+廢水的過(guò)程中，藻菌生物膜的胞外聚合物的變化見圖5。

圖5 藻菌生物膜的胞外聚合物的變化

由圖5（a）可以看出，含Cu2+廢水中的藻菌生物膜所具有的多聚糖含量相較空白水樣明顯增加，且隨著處理時(shí)間增加，前者升高的幅度明顯大于后者，在含Cu2+廢水中處理至第4 天時(shí)，藻菌生物膜多聚糖含量達(dá)到最高，為1.915 mg/（mL·g），之后有所下降。

由圖5（b）可以看出，藻菌微生物ATP 含量變化與多聚糖有所不同，含Cu2+廢水中的藻菌微生物ATP 含量明顯低于空白水樣中。 且與空白水樣中ATP 含量持續(xù)上升不同的是，含Cu2+廢水中的藻菌微生物ATP 先降后升再下降，并在第4 天達(dá)到最高，為7.02 mg/（mL·g）。

由圖5（c）可以看出，Cu2+初始濃度的增加將導(dǎo)致藻菌微生物多聚糖和ATP 含量持續(xù)下降。 分別由ρ（Cu2+）為1 mg/L 時(shí)的1.632 mg/（mL·g）和5.21 mg/（mL·g），下降至ρ（Cu2+）為20 mg/L 時(shí)的1.029 mg/（mL·g）和1.75 mg/（mL·g）。

綜上所述，藻菌生物膜的胞外聚合物含量隨處理時(shí)間增加而整體呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，但隨著Cu2+初始濃度的增加而表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。

2.5 連續(xù)吸附含Cu2+廢水試驗(yàn)

藻菌生物對(duì)含Cu2+廢水進(jìn)行連續(xù)吸附處理的出水效果見圖6。

圖6 連續(xù)吸附處理過(guò)程中出水Cu2+濃度變化

由圖6 可以看出，在前10 d 內(nèi)，出水Cu2+濃度受培養(yǎng)液稀釋明顯，出水濃度上升明顯且波動(dòng)較大，出水質(zhì)量濃度從第1 天的0.205 mg/L 逐漸上升至第9 天的0.561 mg/L。 處理20 d 后，液體置換過(guò)程幾乎完成，稀釋效果降低，出水Cu2+濃度上升變緩慢且更穩(wěn)定，ρ（Cu2+）從第20 天的0.523 mg/L 逐漸上升至第42 天的0.689 mg/L，并維持在該水平，此時(shí)Cu2+去除率約為95%。

3 討論

微生物對(duì)重金屬的去除效果受處理?xiàng)l件及參數(shù)的影響十分明顯，處理參數(shù)及條件不僅影響微生物自身的代謝過(guò)程[18]，也影響著微生物重金屬與重金屬的結(jié)合過(guò)程[19]。 已經(jīng)有研究證明，藻類對(duì)于重金屬的吸附依賴于其細(xì)胞表面的自由位點(diǎn)數(shù)目，而自由位點(diǎn)數(shù)目受pH 值影響明顯[20]。 當(dāng)pH 值為5 時(shí)，藻菌微生物對(duì)Cu2+的去除率達(dá)到最高，當(dāng)pH 值＞8時(shí)，其去除率迅速下降。 這是由于在低pH 值的情況下，pH 值的上升會(huì)引起細(xì)胞壁上的胺基、 ?；泛土u基等表面官能團(tuán)質(zhì)子化減少，溶液中正電荷與Cu2+的競(jìng)爭(zhēng)減弱，吸附量得以提升。但較高pH 值下，溶液中的金屬離子又多以氫氧化物的形式存在，剩余Cu2+由于具有較強(qiáng)的電子結(jié)合能力而容易被周圍陰離子包圍，形成帶負(fù)電的基團(tuán)，從而顯著降低藻類對(duì)水中銅離子的去除效果；另一方面，過(guò)高或過(guò)低的pH 值對(duì)微生物自身代謝的不利影響也決定了其不佳的吸附性能[21]。

微生物對(duì)環(huán)境溫度較為敏感，合適的溫度有利于其自身的代謝過(guò)程，并進(jìn)一步影響其對(duì)重金屬的吸附[22]。 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，藻菌生物膜處理含Cu2+廢水的最佳溫度為30～40 ℃，在此溫度區(qū)間內(nèi)，微生物可以維持較高的活性，有利于吸附的進(jìn)行。 一方面，當(dāng)溫度過(guò)高，微生物體內(nèi)代謝物質(zhì)發(fā)生不可逆的損傷，因此使其吸附Cu2+能力降低；另一方面，Cu2+在生物膜表面的吸附屬于放熱反應(yīng)[23]，這也是溫度升高，吸附量增加的原因之一。 但整體來(lái)看，微生物代謝對(duì)溫度的敏感性才是影響其重金屬吸附的主要因素。

藻菌生物膜對(duì)Cu2+的吸附量及去除率與溶液初始Cu2+濃度強(qiáng)烈相關(guān)。 在多數(shù)以微生物作為吸附劑的研究中[24]，都表現(xiàn)為隨著溶液初始重金屬濃度升高，吸附量先升高后下降，而去除率則持續(xù)下降。 這是由于在微生物對(duì)重金屬的容忍范圍內(nèi)，重金屬的濃度增加將提升結(jié)合位點(diǎn)吸附重金屬的概率。 但當(dāng)初始初始濃度超過(guò)微生物的容忍范圍，微生物受到強(qiáng)烈的毒害作用而消亡，而作為抗脅迫作用而分泌的胞外聚合物也將急劇減少[25]。 同時(shí)，DLVO 理論[26]也提出，在合適的重金屬濃度范圍內(nèi)，絮凝能力也會(huì)隨離子強(qiáng)度的增加而加強(qiáng)，有利于重金屬吸附，而在過(guò)高的濃度下則會(huì)產(chǎn)生重金屬抗凝作用，減弱重金屬的吸附。

對(duì)藻菌生物膜處理含Cu2+廢水不同時(shí)間的研究表明了生物膜在24 h 內(nèi)即可快速吸附Cu2+，并在后續(xù)6 d 內(nèi)繼續(xù)緩慢吸附。 同時(shí)，生物膜在Cu2+脅迫下得響應(yīng)機(jī)制也可以從其胞外聚合物的變化趨勢(shì)中觀察到。 與無(wú)脅迫下對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Cu2+脅迫下得生物膜多聚糖含量明顯較高，而ATP 含量則明顯較低，且脅迫下得多聚糖和ATP 含量都在4 d 內(nèi)上升到最高點(diǎn)，后續(xù)緩慢下降。 這說(shuō)明了Cu2+脅迫下，藻菌生物膜的受重金屬毒性而生理活性較低，ATP 含量減少，此時(shí)，生物膜啟動(dòng)自身響應(yīng)機(jī)制，分泌更多的多聚糖來(lái)抵抗重金屬的毒性脅迫。 后續(xù)隨著生物膜自身響應(yīng)抵抗脅迫過(guò)程的進(jìn)行，4 d 后ATP 含量逐漸回歸正常水平范圍，多聚糖的分泌活動(dòng)也由頂峰逐漸減弱。有諸多研究已經(jīng)證明，大多數(shù)植物及微生物都具有類似的協(xié)調(diào)響應(yīng)抗脅迫機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)生存環(huán)境中的不利因素[27]。

4 結(jié)論

生物修復(fù)法由于其成本低廉、 環(huán)境友好性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已成為當(dāng)下重金屬處理領(lǐng)域的熱點(diǎn)。 本研究探究了通過(guò)城市湖水中藻類富集掛膜得到藻菌生物膜對(duì)含銅廢水的處理效果，發(fā)現(xiàn)在溫度為35 ℃，pH 值為5 時(shí)生物膜對(duì)含Cu2+廢水處理效果最佳，生物膜最大Cu2+耐受質(zhì)量濃度為15 mg/L，并在24 h 時(shí)可近似達(dá)到吸附平衡。 探究了生物膜連續(xù)處理含Cu2+廢水，發(fā)現(xiàn)其具有良好的穩(wěn)定性，處理50 d 時(shí)對(duì)Cu2+的去除率仍可達(dá)95%，，藻菌生物膜在含銅廢水處理中具有良好的應(yīng)用前景。