李凱玲，段 治

（青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司，山東 青島 266102）

青稞（Hordeum vulgare）是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，又稱裸元麥、米大麥、大麥。主要產(chǎn)自西藏等地，是藏族人民的重要糧食[1]。青稞具有含糖和脂肪低，但蛋白質(zhì)、維生素和可溶性纖維高的特點(diǎn)[2]，并且含有人體所必需的鈣、磷、鐵等有機(jī)元素和硒等微量元素及多酚、β-葡聚糖和母育酚等功能成分[3]。其中，值得關(guān)注的是β-葡聚糖在谷物中含量最高，是小麥平均含量的50倍左右[4]。已有大量研究表明，青稞具有排毒清腸、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降低膽固醇、調(diào)節(jié)血糖等生理功能[5-9]。其營(yíng)養(yǎng)成分全面且結(jié)構(gòu)合理，是藏族人民餐桌上非常重要的食物，加之“綠色健康”的特點(diǎn)，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。隨著人們對(duì)飲食健康要求的不斷加強(qiáng)，青稞產(chǎn)品深加工為人們提供了更多健康的選擇。

益生菌是一種活的微生物，已被證明具有多種健康益處，對(duì)宿主腸道菌群平衡和屏障有非常重要的作用[10-11]。其發(fā)酵所產(chǎn)生的乳酸是一種天然的防腐保鮮劑，保持活性益生菌產(chǎn)品穩(wěn)定性、安全性的同時(shí)能夠賦予產(chǎn)品酸爽的口感[12]。益生菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的各種有活性的代謝物具有降低膽固醇、降血糖、改善肝功能、提高免疫力等多種保健功能[13-16]。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）LcS是一種典型的益生菌，已被證明具有腸道粘附性，能夠緩解過(guò)敏、降低炎癥反應(yīng)、預(yù)防感染、增強(qiáng)免疫力和抑制腫瘤等功效[17-18]。其發(fā)酵的乳飲料活菌存活率高，能夠抵抗胃酸和膽汁酸等不良環(huán)境，進(jìn)入腸道后對(duì)維持腸道菌群平衡，抑制有害菌的增殖有良好的功效[19]。

目前，益生菌發(fā)酵的牛乳飲品無(wú)論是在風(fēng)味還是健康益處已廣泛得到大眾的認(rèn)可，但牛乳酸奶來(lái)源于動(dòng)物對(duì)牛奶蛋白過(guò)敏者以及素食主義者卻難以接受，因此，植物基的發(fā)酵飲品因其獨(dú)特的風(fēng)味以及區(qū)別于牛乳酸奶的多種優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。植物發(fā)酵飲料中反式脂肪酸和膽固醇含量幾乎為零，而優(yōu)質(zhì)的植物蛋白含量很高[20]。植物發(fā)酵飲料所選用的原料更加綠色健康[21]，適合乳糖不耐受的人群，還適合牛奶蛋白過(guò)敏者、素食主義者以及輕食主義者等食用，為消費(fèi)者提供了更多健康的選擇。

近年來(lái)，人們對(duì)于植物基發(fā)酵飲料研究主要集中在發(fā)酵燕麥奶、豆奶和椰子奶等[22-23]，對(duì)發(fā)酵青稞的飲品研究較少，且大多以青稞為輔料，添加到牛乳酸奶中，大大削減了青稞的特殊風(fēng)味和功效，以青稞為主要原料的純植物發(fā)酵飲品的研究還較少，干酪乳桿菌LcS發(fā)酵的青稞植物飲料更是少見(jiàn)。胡江校等[24]以青藏高原青稞、鮮牛乳為主要原料研制了青稞益生菌酸乳。本研究以干酪乳桿菌LcS菌粉為發(fā)酵劑，研究了其在發(fā)酵以青稞為主要原料的純植物基飲料過(guò)程中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)情況、pH變化以及代謝產(chǎn)物分析，并對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，為干酪乳酸桿菌LcS菌粉發(fā)酵青稞植物飲料的可行性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑青稞酶解液、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）LcS發(fā)酵菌粉：青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司；核桃粉：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國(guó)Fisher Scientific公司；L-2-氯苯丙氨酸（純度≥98%）：上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；甲酸（色譜純）：德國(guó)CNW公司；異丙醇（色譜純）：美國(guó)Merck公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯/瓊脂培養(yǎng)基：海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NewClassic MF MS105DU電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；Centrifuge 5430R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；SBL-10TD控溫超聲波清洗機(jī)-10 L：寧波新芝生物科技股份有限公司；Wonbio-96c多樣品冷凍研磨儀：上海萬(wàn)柏生物科技有限公司；LNG-T88臺(tái)式快速離心濃縮干燥器：太倉(cāng)市華美生化儀器廠；JXDC-20氮?dú)獯祾邇x：上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；Vanquish Horizon system超高效液相色譜儀（ultra high performance liquid chromatography，UHPLC）系統(tǒng)、Q-Exactive質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo Scientific公司；DSX滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HDPN培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；WB2000-M頂置攪拌器：德國(guó)Wiggens公司；APV-1000均質(zhì)機(jī)：德國(guó)SPX公司。

1.3 方法

1.3.1 青稞植物飲料制備工藝與操作要點(diǎn)

青稞酶解液→添加核桃粉、水→攪拌混合→均質(zhì)→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→冷卻→成品

（1）攪拌混合：將56%的青稞酶解液，6%核桃粉和38%的水混合后，1 200 r/min攪拌5 min混合均勻。

（2）均質(zhì)：將混合均勻的青稞植物飲料發(fā)酵基倒入均質(zhì)機(jī)中20/2 MPa均質(zhì)。

（3）殺菌、冷卻：采用巴氏殺菌法，然后將青稞植物飲料發(fā)酵基冷卻至37 ℃。

（4）接種：將干酪乳桿菌LcS菌粉用上述青稞植物飲料發(fā)酵基稀釋后，按照106CFU/mL的接種量接種于青稞植物飲料發(fā)酵基中。

（5）發(fā)酵：將青稞植物飲料放到37 ℃恒溫箱中發(fā)酵至pH≤4.5。

（6）冷卻：發(fā)酵結(jié)束后冷卻至10 ℃以下，并在冰箱中4 ℃冷藏12 h，即得青稞植物飲料。

1.3.2 干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析

從接種開(kāi)始計(jì)為0 h，發(fā)酵過(guò)程中每隔2 h取樣，測(cè)定青稞植物飲料中干酪乳桿菌LcS活菌數(shù)，活菌數(shù)的檢測(cè)和計(jì)數(shù)參考GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》。

1.3.3 干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料pH變化曲線

將接種干酪乳桿菌LcS的青稞植物飲料裝入50 mL錐形瓶（裝45 mL青稞植物飲料）。pH探針?lè)胖迷阱F形瓶中以記錄pH數(shù)據(jù)。37 ℃靜置發(fā)酵30 h，每隔5 min自動(dòng)記錄一次pH值。

1.3.4 干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料感官評(píng)價(jià)

青稞植物飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考林小琴[25]的方法，并做適當(dāng)修改，使用100分制評(píng)分法，由10位評(píng)分員分別對(duì)植物飲料的色澤、風(fēng)味口感和組織狀態(tài)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，具體標(biāo)準(zhǔn)參照表1。

表1 青稞植物飲料感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of highland barley plant-based beverage

1.3.5 干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料非靶向代謝組學(xué)分析

（1）前處理

將干酪乳桿菌LcS發(fā)酵的青稞植物飲料離心15 min（10 000×g，4 ℃），取上清為測(cè)試樣品。精確移取200 μL樣品至1.5 mL離心管中；加入800 μL提取液（甲醇∶乙腈=1∶1（V/V）），含0.02 mg/mL的內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸）；渦旋混勻30 s后，低溫超聲提取30 min（5 ℃，40 kHz）；將樣品靜置于-20 ℃，30 min；離心15 min（13 000×g，4 ℃），移取上清液，氮?dú)獯蹈桑患尤?00 μL復(fù)溶液（乙腈∶水=1∶1）復(fù)溶；渦旋混勻30 s，低溫超聲萃取5 min（5 ℃，40 kHz）；離心10 min（13 000×g，4 ℃），移取上清液至帶內(nèi)插管的進(jìn)樣小瓶中上機(jī)分析；另外，每個(gè)樣本分別移取20 μL上清液混合后作為質(zhì)控樣本。

（2）液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)

色譜條件：色譜柱為ACQUITYUPLCHSST3（100mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為95%水+5%乙腈（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水（含0.1%甲酸）；流速為0.40 mL/min，進(jìn)樣量為2 μL，柱溫為40 ℃，流動(dòng)相洗脫梯度見(jiàn)表2。

表2 流動(dòng)相洗脫梯度Table 2 Mobile phase elution gradient

質(zhì)譜條件：樣品經(jīng)電噴霧電離，分別采用正、負(fù)離子掃描模式采集質(zhì)譜信號(hào)。掃描范圍70～1 050 m/z，鞘氣流速40 arb，輔助氣流速10 arb，加熱溫度400 ℃，毛細(xì)管溫度320 ℃，噴霧電壓（正模式）3 500 V，噴霧電壓（負(fù)模式）-2 800 V，碰撞能量40 eV，S-Lens電壓50 V，分辨率（Full MS）70 000，分辨率（MS2）17 500。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

非靶向代謝組學(xué)分析篩選出的顯著性代謝差異物根據(jù)其質(zhì)荷比、保留時(shí)間（retention time，RT）和二級(jí)碎片信息通過(guò)Progenesis QI軟件在人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（human metabolome database，HMDB）（http：//www.hmdb.ca/）和京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）（http：//www.kegg.jp/）等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，確定其結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析

從接種開(kāi)始計(jì)為0 h，發(fā)酵過(guò)程中每隔2 h取樣，測(cè)定青稞植物飲料中干酪乳桿菌LcS活菌數(shù)。發(fā)酵過(guò)程中干酪乳桿菌LcS生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)情況見(jiàn)圖1。

圖1 干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)擬合曲線Fig.1 Growth fitted curve of highland barley plant yoghurt fermented by Lactobacillus casei LcS

由圖1可知，干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)測(cè)量結(jié)果與擬合模型基本吻合。發(fā)酵前5 h菌株LcS處于遲滯期，它的活菌數(shù)基本保持不變。微生物進(jìn)入到新的生長(zhǎng)環(huán)境，需要一個(gè)適應(yīng)期，體內(nèi)的分子組成重新調(diào)整。此時(shí)，代謝物質(zhì)顯著增加，菌體體積增大，生長(zhǎng)速度逐漸增快。但菌體對(duì)外界不良環(huán)境較為敏感，控制不當(dāng)極易死亡。延遲期的長(zhǎng)短與菌的種屬，傳代次數(shù)和培養(yǎng)條件等密切相關(guān)[26]。

5 h后，菌株LcS進(jìn)入快速繁殖的對(duì)數(shù)期，從圖1可以得出，5～18 h活菌數(shù)生長(zhǎng)都是處于對(duì)數(shù)期。在這個(gè)階段，菌株LcS生長(zhǎng)繁殖的速度明顯加快，從6.92 lg（CFU/mL）增加到9.52 lg（CFU/mL）。

隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗和有生理毒性的代謝物在發(fā)酵基中積累，以及pH值的降低，菌株LcS繁殖速度逐漸下降，在18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，直至30 h活菌數(shù)基本保持穩(wěn)定趨勢(shì)，最終活菌數(shù)為9.50 lg（CFU/mL）。

2.2 干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料pH變化曲線

青稞植物飲料發(fā)酵過(guò)程pH值的變化曲線見(jiàn)圖2。

圖2 干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料pH變化曲線Fig.2 pH curve of highland barley plant-based beverage fermented by Lactobacillus casei LcS

由圖2可知，接種后，干酪乳桿菌LcS利用青稞酶解液中的可發(fā)酵糖，將其轉(zhuǎn)化為乳酸。隨著發(fā)酵過(guò)程中乳酸的不斷生成，pH值下降。在前5 h pH值只是稍微下降，這是由于干酪乳桿菌LcS仍處于延遲期，生長(zhǎng)緩慢，仍處在適應(yīng)期。5～14 h為對(duì)數(shù)期，pH值呈快速下降的趨勢(shì)，從5.5下降至3.5。這階段pH值的快速下降主要由于干酪乳桿菌LcS快速增殖，生成乳酸速度加快。14 h pH下降減緩，直至30 h pH變化不明顯。

2.3 干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料感官評(píng)價(jià)

圖3 干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料感官評(píng)分Fig.3 Sensory evaluation results of highland barley plant-based beverage fermented by Lactobacillus casei LcS

由圖3可知，干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料在色澤、風(fēng)味口感和組織狀態(tài)都具有較好的評(píng)分，色澤均勻一致，呈黑青稞特有的棕褐色，有一定的光潔度；香氣自然醇厚，具有青稞和核桃特殊的發(fā)酵風(fēng)味，無(wú)不良風(fēng)味，口感酸甜適中，順滑細(xì)膩；組織狀態(tài)均勻一致，無(wú)明顯絮狀或分層現(xiàn)象。且相同感官特征不同評(píng)分員評(píng)分之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料代謝組學(xué)分析

干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料的代謝組學(xué)分析結(jié)果見(jiàn)圖4和表3。

圖4 干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料的代謝組學(xué)分析結(jié)果Fig.4 Metabonomics results of highland barley plant-based beverage fermented by Lactobacillus casei LcS

表3 干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料發(fā)酵前后的差異代謝物Table 3 Different metabolites of highland barley plant-based beverage before and after fermentation with Lactobacillus casei LcS

注：FC表示代謝物在發(fā)酵前與代謝物在發(fā)酵后的差異表達(dá)倍數(shù)；X：該代謝物在發(fā)酵前的表達(dá)量，Y：該代謝物在發(fā)酵后的表達(dá)量。

圖4A左側(cè)為代謝物聚類樹狀圖，顏色表示該代謝物在該組樣本中相對(duì)表達(dá)量的大?。挥覀?cè)為代謝物差異權(quán)重貢獻(xiàn)值（variable importance in projection，VIP）條形圖，值越大表明代謝物在兩組間差異越大。圖4A表明發(fā)酵前后對(duì)同一代謝產(chǎn)物的表達(dá)量有明顯的差異；圖4B中每個(gè)格子表示兩個(gè)樣品之間的相關(guān)性，不同顏色代表樣本間相關(guān)系數(shù)的相對(duì)大小，聚類樹枝的長(zhǎng)度表示樣本間相對(duì)距離的遠(yuǎn)近，同一枝上的樣本中比較相似。分析表明平行組之間代謝組成和相似度高；圖4C顯示在HMDB層級(jí)有10類188種代謝產(chǎn)物，其中包括脂類和類脂分子59種，占比31.38%，包括法尼焦磷酸、蓖麻油酸和甘油磷酰膽堿；有機(jī)酸及其衍生物42種，占比22.34%，包括谷氨酰胺酰谷氨酸、精氨酸-脯氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酰胺等。其中，氨基酸能夠縮短發(fā)酵時(shí)間，且能夠賦予發(fā)酵飲料更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。雖然氨基酸不是發(fā)酵飲料的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，但可作為揮發(fā)性物質(zhì)的前體物質(zhì)，能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為醇類和酯類等能夠提升發(fā)酵飲料風(fēng)味的物質(zhì)。

采用代謝組學(xué)軟件Progenesis QI進(jìn)行代謝物鑒定。在正離子和負(fù)離子模式下分別檢測(cè)到2 380和2 053個(gè)代謝物，根據(jù)VIP值＞1、差異倍數(shù)＞2和P≤0.05的篩選原則，共篩選出313個(gè)（正離子141個(gè)和負(fù)離子172個(gè)）差異代謝產(chǎn)物。隨后，通過(guò)相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，部分結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，青稞植物飲料經(jīng)干酪乳桿菌LcS發(fā)酵后，大豆皂苷A3、大豆皂苷A1、奎寧酸、尿苷、麥芽十二糖、綠原酸和橙皮苷等物質(zhì)含量明顯高于發(fā)酵前。其中，大豆皂苷具有抗氧化、抗血栓、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗脂質(zhì)氧化和調(diào)節(jié)心腦血管等功能[27-29]；奎寧酸是飲食的正常成分，能夠通過(guò)胃腸道菌群轉(zhuǎn)化色氨酸和煙酰胺，為人類必不可少的代謝成份提供了原位生理源；尿苷具有潛在的增強(qiáng)認(rèn)知的特性，并與魚油具有協(xié)同作用，可用于治療巨型紅血球貧血，對(duì)肝、腦血管及心血管等疾患與其他核苷、堿基合用于也有治療作用[30-31]；麥芽十二糖是多糖的一種，具有調(diào)節(jié)免疫，抗衰老、抗病毒、抗癌、抗氧化、降血糖等多種功效[32]；綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗肌肉骨骼老化，降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用[33]；橙皮苷是一種類黃酮，有抗氧化特性，還有抗炎和抗癌的作用[34]，可以保護(hù)血管，降低毛細(xì)血管的通透性，增強(qiáng)毛細(xì)血管的韌性[35]。同時(shí)可通過(guò)升高過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activated receptor α，PPARα）的表達(dá)調(diào)節(jié)血脂，保護(hù)肝臟[36]。

綜上結(jié)果表明，干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料可以產(chǎn)生大量具有抗氧化、抗衰老、抗癌、降血壓的代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)可以提升發(fā)酵飲料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并具有參與改善機(jī)體健康的潛力，有作為功能性植物發(fā)酵飲品開(kāi)發(fā)的前景。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)情況、pH變化、感官評(píng)定及發(fā)酵產(chǎn)物的代謝組學(xué)分析。結(jié)果表明，干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料延滯期為0～5 h，5 h后就進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，在發(fā)酵11 h時(shí)pH降到4.5，活菌量達(dá)8.79 lg CFU/mL，此時(shí)發(fā)酵的青稞植物飲料酸甜適中，口感細(xì)膩，具有青稞和核桃發(fā)酵的特殊風(fēng)味。在色澤、風(fēng)味口感和組織狀態(tài)都具有較高的感官評(píng)分。發(fā)酵前后共篩選出313個(gè)差異代謝產(chǎn)物，包括大豆皂苷、奎寧酸、尿苷、麥芽十二糖、綠原酸和橙皮苷等具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗衰老、降血壓和抗炎等作用的功能性代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)可提升植物基飲料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。綜上表明，干酪乳桿菌LcS發(fā)酵青稞植物飲料具有可行性，但發(fā)酵的具體工藝參數(shù)還需要進(jìn)一步研究。