閆慧敏， 楊 光， 楊 波， 王 禮

上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093

皮膚作為主要的外部防御系統(tǒng)，具有保護機體免受微生物感染的作用。每年都會有很多的病人因為各種事故導(dǎo)致表皮或皮膚出現(xiàn)不同程度的損傷［1］，因此敷料的選擇對損傷皮膚的修復(fù)至關(guān)重要。傳統(tǒng)敷料例如繃帶、藥棉和紗布等，都能不同程度的吸收傷口滲液，進行傷口管理［2］。同時傳統(tǒng)敷料也存在一些不可忽視的缺點，如紗布中的纖維容易脫落失去屏障保護功能，對傷口的愈合會產(chǎn)生一定影響；紗布無法有效吸收傷口滲出液，且換藥工作量大，換藥時由于傷口與紗布產(chǎn)生粘連，會引起疼痛和二次損傷。

近年來，越來越多的研究趨向于新型傷口敷料領(lǐng)域，新型傷口敷料能夠使受損皮膚表面含水量控制在合適的范圍內(nèi)，既不會因為水分過多造成傷口感染，也不會因為過于干燥而影響傷口愈合或引起傷口粘連。新型傷口敷料包括水凝膠、薄膜類、藻酸鹽類、泡沫類、水膠體類敷料［3］等，其中水凝膠敷料是一種高分子聚合物，是一種以水為分散介質(zhì)的凝膠［4］，具有在水中溶脹而不溶解并保持大量水分的特點，能夠為傷口提供濕潤的環(huán)境促進傷口愈合。此外，由于水凝膠特有的柔軟性能，使之能加工成各種形狀，從而與傷口更有效的接觸。因此，研究和開發(fā)水凝膠新型傷口敷料具有重要的商業(yè)價值［5］。

岳凌等人［6］采用冷凍-解凍法制備出一種加速傷口愈合水凝膠，在制作過程中摻入可局部應(yīng)用于創(chuàng)面的慶大霉素。但慶大霉素屬于一種抗生素，且存在全身毒性（腎毒性）和低血漿濃度的問題阻礙了它的廣泛應(yīng)用。PARK等人［7］采用水溶液澆鑄法以聚乙烯醇（PVA）為原料與戊二醛（GA）在鹽酸存在下進行化學交聯(lián)，制備了聚乙烯醇（PVA）水凝膠。但上述水凝膠均存在明顯的毒性，生物相容性差。目前，由于傷口愈合環(huán)境的特殊性，沒有一種單一的敷料能適用于所有的傷口管理，制備復(fù)合水凝膠是一種新的解決方法。

海藻酸鈉（Sodium alginate，SA）具有無毒、生物相容性好、能夠凝膠化和熱穩(wěn)定性強特點［8］。明膠（Gelatin，G）是膠原部分水解后的產(chǎn)物，在生物醫(yī)學、食品和化學工業(yè)中有廣泛應(yīng)用。沙蒿膠（Artemisia sphaerocephala Krasch gum，ASKG）是一種天然植物膠，呈交聯(lián)結(jié)構(gòu)［9］，具有良好的穩(wěn)定性、保水性和成膜性［10］，在組織工程方面具有潛在應(yīng)用價值［11］?？咕阅苁撬z作為傷口敷料的一項重要指標，細菌感染會引發(fā)炎癥，從而延緩傷口愈合，ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一種天然多肽抗菌劑［12］，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌等具有顯著的抑制效果，具有安全性能高，水溶性好，熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點［13］。本文采用共混-離子交聯(lián)法以海藻酸鈉、明膠、沙蒿膠為原料制備具有安全無毒復(fù)合水凝膠，并在此基礎(chǔ)上添加ε-聚賴氨酸進一步增強其抗菌性能，重點研究了ε-PL含量對復(fù)合水凝膠力學性能、溶脹性能、保濕性能、抗菌性能及溶血率的影響，進而評估該復(fù)合水凝膠在傷口敷料領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要材料：明膠，分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；海藻酸鈉，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；沙蒿膠；西安拉維亞生物科技有限公司；ε-聚賴氨酸：上海阿拉丁試劑有限公司；無水氯化鈣，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；大腸桿菌和金黃色葡萄球菌來源于上海大學實驗室自行分離保存。

主要儀器：Scientz-25T真空凍干機，寧波新芝生物科技股份有限公司；JJ-1電動攪拌器，常州恩培精密儀器有限公司；SMS質(zhì)構(gòu)儀TA.XT PLUS，TA Instruments-Waters LLC；TM2101-T5型微電腦式拉力試驗機，濟南泰欽電氣有限公司；DHG-9240A型電熱鼓風干燥，上海一恒科學儀器有限公司；Nicolet is 10型傅里葉紅外光譜儀，美國產(chǎn)；FEI Quanta 450場發(fā)射掃描電子顯微鏡，美國FEI公司。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)合水凝膠的制備

稱取一定質(zhì)量的明膠于去離子水中，在50℃恒溫水浴鍋中攪拌40 min直至均勻，再向其中加入一定質(zhì)量的沙蒿膠粉，攪拌均勻后制備混合液，之后加入一定量的ε-PL溶液攪拌均勻，pH調(diào)節(jié)為中性，制備混合液Ⅰ。稱取一定質(zhì)量的海藻酸鈉放入去離子水中，在50℃恒溫水浴鍋中攪拌50 min，靜置均勻，制備混合液Ⅱ。之后將兩種等體積混合攪拌1 h，倒入模具中放入4℃冰箱過夜去除氣泡，然后向其中滴入等體積的2%氯化鈣溶液交聯(lián)8 h，最后用去離子水洗滌三次，即得復(fù)合水凝膠［11］。最終G質(zhì)量濃度為2.5%、SA添加量為1.5%，ε-PL添加量分別為0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%，五組樣品依次命名為SGAP-0、SGAP-1、SGAP-2、SGAP-3、SGAP-4。

1.2.2 復(fù)合水凝膠力學性能的測定

（1）壓縮強度

在室溫條件下，用十二孔板制備直徑20 mm，高5 mm圓柱形水凝膠，用物性分析儀（TA.XT PLUS）對水凝膠試樣進行壓縮試驗直至壓破，壓縮速率設(shè)為0.5 mm／s。每組試樣重復(fù)五次壓縮試驗，以減少實驗誤差［14］。

（2）拉伸性能和斷裂伸長率

將制備好的水凝膠用裁刀切成啞鈴型，樣品總長度為75 cm，測試部位長度為40 mm，寬度為4 mm，用游標卡尺測量樣品厚度，將試樣的上下兩端夾緊到拉力試驗機上，以100 mm／min的拉伸速度拉伸并測定拉斷時的拉伸強度（KPa）和斷裂伸長率（%），每個樣品測試三次取平均值［15］。

1.2.3 復(fù)合水凝膠溶脹性能測試

將水凝膠于真空凍干機干燥至恒重，取大小、質(zhì)量相近的干燥凝膠圓片，質(zhì)量記為M0，將干燥后的凝膠圓片浸泡于去離子水中，每隔一段時間取出擦干表面水分后稱重，此時的質(zhì)量記為Mt，根據(jù)公式（1）計算水凝膠的溶脹比SR（%）［16］，計算公式如下：

其中M0和Mt分別為干凝膠和t時刻水凝膠的質(zhì)量g。

1.2.4 復(fù)合水凝膠的保濕性能測試

將冷凍干燥后的樣品質(zhì)量記為m0，浸入去離子水中，充分溶脹后稱重，質(zhì)量記為m1，將充分溶脹后的樣品放入37℃恒溫干燥箱中，間隔不同時間測量水凝膠的重量，記為mt。根據(jù)公式（2）計算各個時間點的保濕率［17］。保濕率計算方式如下：

其中m0、m1和mt分別為干凝膠、充分溶脹后的水凝膠和t時刻水凝膠的質(zhì)量g。

1.2.5 紅外光譜測定

將制備好的水凝膠樣品于-45℃預(yù)凍4 h，置于真空冷凍干燥機中冷凍48 h后粉碎，利用KBr壓片法制得樣品進行測試，掃描范圍為4 000 cm-1～500 cm-1。

1.2.6 復(fù)合水凝膠的SEM測試

將水凝膠經(jīng)真空冷凍干燥后的樣品切片貼在導(dǎo)電膠上，待測樣品固定好后對其進行噴金處理，最后將噴金的樣品和載樣臺一同放入掃描電鏡的樣品室進行形態(tài)觀察。

1.2.7 復(fù)合水凝膠的抗菌性能測試

采用抑菌圈法和OD值法對樣品的抗菌性能進行測試。

抑菌圈法：先對細菌進行活化，然后用接種環(huán)取一環(huán)活化后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別于10 mL生理鹽水中制備菌體濃度為108CFU／mL的菌懸液，然后取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌100μL菌懸液均勻涂布于高溫滅菌處理過的瓊脂培養(yǎng)基上，將滅菌過的直徑為1 cm圓柱形樣品置于培養(yǎng)基上，在37℃溫度下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的大小。

OD值法：用接種環(huán)取一環(huán)活化后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速220 r／min，溫度37℃，培養(yǎng)時間12 h，測量培養(yǎng)后的菌液在600 nm處的OD值，與LB液體培養(yǎng)基混合，稀釋至OD600為0.6左右，然后按1∶1 000比例繼續(xù)稀釋，稀釋至濃度約為105CFU／mL，將滅菌后的樣品加入到3 mL菌液中，使樣品完全浸沒在菌液中，設(shè)置不添加樣品的為空白對照，在220 r／min，37℃光照條件下培養(yǎng)24 h，測定此時600 nm處的OD值。按照公式（3）計算抑菌率。

其中，ODcontrastivegroups為對照組，ODexperimentalgroups為實驗組。

1.2.8 復(fù)合水凝膠的溶血率測試

按照抗凝兔血：0.9%生理鹽水4∶5制備稀釋新鮮抗凝兔血，取含有樣品的生理鹽水混懸液各10 mL于離心管中，在陰性對照中加入10 mL生理鹽水，陽性對照中加入10 mL去離子水。將全部離心管放于37℃水浴鍋中保溫半小時后，在各離心管中加入200μL稀釋過的新鮮抗凝兔血，保溫1 h，并以3 000 r／min速度離心5 min，取上清液用紫外分光光度計在545 nm處測其吸光度（OD），重復(fù)實驗三次。溶血率通過OD值按照公式4計算得出：

其中：ODt、ODpc、ODnc分別對照樣品組、陽性對照組和陰性對照組。

2 結(jié)果分析

2.1 ε-PL對復(fù)合水凝膠力學性能的影響

力學性能是水凝膠作為醫(yī)用敷料的一個重要指標，良好的力學性能能使敷料在使用過程中保持完整性，復(fù)合水凝膠的力學性能結(jié)果如圖1所示。

圖1（a）為應(yīng)力-應(yīng)變曲線，（b）為最大壓縮強度，可以看出，SGAP-1復(fù)合水凝膠壓縮強度達到最大值為477.6 kPa，隨著ε-PL質(zhì)量濃度的增加，壓縮強度呈先增加后降低的趨勢。（c）、（d）分別為復(fù)合水凝膠的拉伸強度和斷裂伸長率，隨著ε-PL質(zhì)量分數(shù)的增加，拉伸強度和斷裂伸長率均出現(xiàn)先增加后下降的趨勢，這與壓縮強度一致。原因可能是隨著ε-PL的加入，ε-PL中的-NH2與SA和ASKG中的-OH分子間相互作用形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［18］，使體系結(jié)合更加緊密，但隨著ε-PL的增加，使分子間-OH的距離增加，破壞了分子間作用力，導(dǎo)致力學性能下降。

圖1 ε-PL對復(fù)合水凝膠力學性能的影響

2.2 ε-PL對復(fù)合水凝膠溶脹性能的影響

水凝膠的溶脹是一個復(fù)雜的過程，首先水凝膠基質(zhì)的極性親水基團被水化，水以一級結(jié)合水的形式出現(xiàn)，水也與暴露的疏水基團相互作用，疏水基團以二次結(jié)合水的形式出現(xiàn)。一次結(jié)合水和二次結(jié)合水都構(gòu)成總結(jié)合水，之后網(wǎng)絡(luò)向無限稀釋方向的滲透驅(qū)動力受到物理或化學交聯(lián)的抵制，因此可以吸收額外的水充滿網(wǎng)狀或鏈狀空隙和較大孔隙的中心。良好的溶脹性能可以吸收傷口滲出液，有利于傷口的修復(fù)和愈合。ε-PL對復(fù)合水凝膠溶脹性能的影響見圖2。

圖2 ε-PL對復(fù)合水凝膠溶脹性能的影響

由圖2可知，加入ε-PL后，復(fù)合水凝膠的溶脹性能呈先降低后增加的趨勢，SGAP-0的溶脹率最大，隨著ε-PL的加入，溶脹度有所降低，原因可能是ε-PL的加入，使交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的密度增加，復(fù)合水凝膠體系較為致密，不利于水分子的進入，溶脹性能有所下降［19］，隨著ε-PL的繼續(xù)增加，SGAP-4的溶脹率有所增加，可能的原因是隨著ε-PL增加分子內(nèi)氫鍵的距離增加，網(wǎng)絡(luò)孔隙變大，水分子能快速進入，使SPAP-4的溶脹性能有所增加。所制備的水凝膠溶脹度均在500%以上，具有較好的溶脹性能。

2.2 ε-PL對復(fù)合水凝膠保濕性能的影響

具有一定的保濕性能傷口敷料，可以為傷口的愈合提供一個濕潤的環(huán)境，進而加速傷口的愈合，ε-PL對復(fù)合水凝保濕性能的影響見圖3。由圖3可知，隨著ε-PL的增加，保濕率呈先增加后降低的趨勢，但整體變化趨勢不大，180 min后，復(fù)合水凝膠保濕率仍在35%以上，復(fù)合水凝膠中由于含有大量的親水基團，增加了水凝膠的潤濕性和親水性特征，容易與水結(jié)合，從而防止水分的蒸發(fā)，能夠為傷口愈合過程中提供一個良好的濕潤環(huán)境。

圖3 ε-PL對復(fù)合水凝膠溶脹性能的影響

2.3 紅外光譜分析

原料SA、G、ASKG和SGAP-0、SGAP-3的紅外光譜如圖4所示。由圖可知，海藻酸鈉光譜中在3 415 cm-1處有一寬峰是—OH的伸縮振動峰，在2 929 cm-1處出現(xiàn)的C—H的伸縮振動峰是海藻酸鈉的特征峰。在1 616 cm-1和1 413 cm-1處的吸收峰是羧酸鹽（COO—）對稱伸縮振動吸收峰［20］。明膠光譜中在1 618 cm-1和1 420 cm-1處出現(xiàn)的峰屬于酰胺I和酰胺II［21］，在沙蒿膠光譜中，在3 415 cm-1處出現(xiàn)—OH的寬峰是由于沙蒿膠內(nèi)含有大量的羥基引起的［22］。在SGAP-0中，海藻酸鈉的羧基峰和明膠的氨基峰都明顯減弱，這是由于明膠中的氨基和海藻酸鈉中的羧基與鈣離子之間發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)［23］，3 300 cm-1～3 600 cm-1范圍羥基峰形變的尖銳，其原因在于沙蒿膠中大量的羥基在體系中自身形成氫鍵使復(fù)合水凝膠體系間氫鍵作用力增強，ε-PL引入后，COO—在1 413 cm-1處的吸收峰明顯減弱，原因可能是ε-PL上的氨基與海藻酸鈉中的羧基在體系中發(fā)生了離子相互作用導(dǎo)致COO—的吸收峰有所減弱［24］。

圖4 復(fù)合水凝膠紅外光譜圖

2.4 掃描電鏡分析

通過掃描電鏡觀復(fù)合水凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將SGAP-0、SGAP-3和SGAP-4經(jīng)過真空冷凍干燥后切片、噴金后進行電鏡掃描，分別放大100倍和200倍進行觀察，結(jié)果見圖5。由圖可知，所制備的樣品均具有互相連接的孔狀結(jié)構(gòu)且多孔結(jié)構(gòu)之間的連通性較好，這是由于體系內(nèi)的羥基形成大量氫鍵，增強了復(fù)合水凝膠中的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以為小分子提供良好的通路，使之能夠在網(wǎng)絡(luò)中得到良好的存儲，這為復(fù)合水凝膠的吸水和保濕提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［25］。ε-PL引入后可適當增加復(fù)合水凝膠的網(wǎng)狀孔結(jié)構(gòu)，但隨著ε-PL的增加，水凝膠體系分子間距離增大，導(dǎo)致孔隙變大，使復(fù)合水凝膠的力學性能變差，與上文一致。

圖5 水凝膠掃描電鏡圖

2.5 抗菌效果評價

ε-PL的抗菌結(jié)果如圖6所示，由圖（a）可知，SGAP-0沒有抑菌圈出現(xiàn)，說明不具有抗菌性能，當加入ε-PL后，開始有抑菌圈的出現(xiàn)，且隨著ε-PL的增加抑菌圈越來越明顯，抑菌圈直徑越來越大。抑菌圈大小如圖（b）所示，從圖中可以看出，所制備的復(fù)合水凝膠具有優(yōu)異的抗菌性能。ε-PL對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率如圖（c）所示，隨著ε-PL的增加，抗菌效果越來越好，SGAP-3和SGAP-4均具有較好的抗菌效果，其中SGAP-3對大腸桿菌（E．coli）和金黃色葡萄球菌（S．a(chǎn)ureus）抗菌率分別達到了90.12%和88.35%。ε-PL是一種陽離子多肽，與細菌的細胞膜接觸可以增加細胞膜的通透性，并進一步導(dǎo)致細胞質(zhì)泄露，進而殺死細菌。因此，添加ε-PL可以明顯增強水凝膠的抗菌能力。

圖6 ε-PL對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌

2.6 溶血率

對于醫(yī)用材料，一般用溶血率是否大于5%來判斷，如果大于5%，說明材料會引發(fā)溶血現(xiàn)象，導(dǎo)致機體受到一定傷害，不可以用作醫(yī)用材料，如果溶血率小于5%，說明材料對溶血的影響很小，不會發(fā)生溶血，可以用作醫(yī)用材料。由圖7可知，隨著ε-PL的加入，溶血率逐漸增大，原因可能是ε-PL是一種陽離子多肽，陽離子增多會破壞紅細胞的細胞膜，導(dǎo)致溶血率增大，但均小于5%，是一種非溶血性材料。

圖7 ε-PL對水凝膠溶血率的影響

3 結(jié)論

本文采用共混-離子交聯(lián)法制備水凝膠，并在此基礎(chǔ)上引入ε-PL增強其抗菌性能，研究了ε-PL對復(fù)合水凝膠力學性能、溶脹性能、保濕性能、抗菌性能和溶血率的影響，結(jié)果表明，當ε-PL添加量為0.5%時，制備的復(fù)合水凝膠出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，對大腸桿菌（E．coli）和金黃色葡萄球菌（S．a(chǎn)ureus）

抗菌率分別達到了90.12%和88.35%，證明其優(yōu)秀的抗菌性能。溶血率均低于5%，具有良好的力學性能可用作醫(yī)用材料。實驗證明本文采用的共混-離子交聯(lián)法制備的抗菌復(fù)合水凝膠在傷口敷料領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。