汪舒穎， 馬俊飛， 季倩玉， 劉 箐

上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093

單增李斯特氏菌（L．monocytogenes）是一種革蘭氏陽性菌，兼性厭氧，具有胞內(nèi)寄生、胞間逃逸的生存特質(zhì)。它與大腸桿菌、沙門氏菌等是常見于腫瘤疫苗研究的細菌活載體［1，2］。利用減毒L．monocytogenes作為細菌活載體的優(yōu)勢在于不僅能通過MHCⅡ類途徑將抗原短肽遞呈給CD4＋T淋巴細胞，更重要的是由于其胞內(nèi)寄生的特質(zhì)，可以在宿主細胞內(nèi)將抗原通過MHCⅠ類分子遞呈給CD8＋T淋巴細胞［3，4］。CD4＋和CD8＋T淋巴細胞共同參與體內(nèi)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程，其中表達CD8的細胞毒性T淋巴細胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）在腫瘤免疫治療中起到重要的作用［5，6］。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)，重組減毒L．monocytogenes外源抗原表達水平較低，這可能是重組疫苗株未能表現(xiàn)出更好的免疫保護效果的原因［7，8］。因此提高在特定環(huán)境下外源蛋白在重組減毒L．monocytogenes中的表達量是推進工程單增李斯特氏菌研究發(fā)展中亟待解決的問題。

啟動子是在DNA鏈上通過與RNA聚合酶結(jié)合，從而啟動mRNA合成的一段序列，是基因表達調(diào)控中重要的組件之一［9］。在大腸桿菌和沙門氏菌活載體的研究中，為了穩(wěn)定細菌在腫瘤病灶的外源蛋白表達水平，已有報道通過挖掘在厭氧培養(yǎng)條件下穩(wěn)定的天然啟動子，或通過改造天然啟動子來優(yōu)化細菌的外源蛋白表達系統(tǒng)［10，11］。目前有關(guān)優(yōu)化啟動子的策略在微調(diào)代謝工程和合成生物學中的應(yīng)用已有廣泛的研究［12，13］。其中，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲得不同轉(zhuǎn)錄強度的天然啟動子已是一種較為成熟的啟動子建庫策略［14-16］。

在之前的研究中，已有通過轉(zhuǎn)錄組測序的方式，挖掘了在酸性條件下或28℃溫度中的L．monocytogenes組成型啟動子，但有關(guān)厭氧環(huán)境中L．monocytogenes強啟動子的挖掘鮮有報道［17，18］。因此，本研究通過對在厭氧和有氧條件下L．monocytogenes轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的系統(tǒng)分析，確定了一組天然啟動子。利用綠色熒光蛋白報告基因?qū)@些啟動子進行表征，篩選出活性最好的啟動子。為了探究篩選出的啟動子在不同外源蛋白轉(zhuǎn)錄過程中的適用性，我們選擇了用于腫瘤治療研究的天青蛋白和產(chǎn)氣莢膜梭菌θ毒素進行表達量的評估。L．monocytogenes厭氧啟動子的篩選豐富了L．monocytogenes的天然啟動子文庫，對其未來在腫瘤治療細菌活載體應(yīng)用研究方面具有一定的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株L．monocytogenes EGD-e由作者所在課題組前期保藏。EGD-eΔactA／inlB由課題組前期工作中構(gòu)建。質(zhì)粒pERL3由華中師范大學羅勤教授贈與。

1.1.2 實驗試劑

Bam HⅠ限制性內(nèi)切酶，大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，杭州博日科技股份有限公司；ClonExpress MultiS One-step Cloning kit多片段一步克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；其他試劑均為分析純級。

1.1.3 儀器和設(shè)備

PCR儀，美國Applied Biosystems；電轉(zhuǎn)儀，電泳儀，美國Bio-Rad；凝膠成像儀，美國Gene；Nano-Drop200C，美國Thermo Fisher；振蕩培養(yǎng)箱，天津萊玻特瑞；厭氧培養(yǎng)箱，英國Baker Ruskinn；離心機，德國Eppendorf公司；酶標儀，美國Molecular Devices。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基和BHI培養(yǎng)基購買自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序樣品制備

將L．monocytogenes EGD-e以1×104CFU涂布在BHI固體平板上，分別放在厭氧培養(yǎng)箱和普通恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)24 h。用細胞刮刀將菌落刮下，用BHI培養(yǎng)基重懸，調(diào)菌液濃度到OD600＝1.0。取5 mL菌液，加入1 mL苯酚乙醇混合溶液（苯酚∶乙醇＝1∶9）后，在冰上放置30 min。將混合物在4℃下以6 000 r／min離心5 min，棄掉上清，收集菌體。將菌體重懸于50μL變?nèi)菥睾?0μL溶菌酶溶液中，并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，在37℃條件下孵育30 min。在離心管中加入1 mL Trizol破碎細菌細胞，離心后取樣品上清，并在其中加入200μL三氯甲烷進行抽提。接著用異丙醇沉淀離心后樣品水相層中的總RNA，并用75%乙醇清洗沉淀。隨后待離心管中多余的乙醇晾干后，加入30μL DEPC水，并用NanoDrop 200C檢測RNA濃度。最后將提取的RNA樣本用液氮凍存后寄送至上海生工生物工程有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序及分析。其中厭氧條件處理的樣本命名為EGDeAN組，有氧條件下處理的樣本命名為EGDe組。

1.2.2 厭氧啟動子的篩選及克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，將featureCounts［19］計算得到的FPKM（每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)）作為評估樣本轉(zhuǎn)錄水平的依據(jù)，篩選厭氧培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)錄水平較高的基因。設(shè)定的篩選條件為EGDeAN組的FPKM值需顯著高于EGDe組，且EGDeAN組的FPKM值需大于1 000，EGDe組的FPKM值需小于3 000。通過與NCBI數(shù)據(jù)庫中EGDe全基因組進行比對，將篩選出的基因（見表1）上游非編碼區(qū)作為其啟動子序列。以提取的EGDe全基因組為模板，設(shè)計引物獲取啟動子片段。

表1 基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果選取的啟動子信息統(tǒng)計

1.2.3 重組菌株的構(gòu)建方法及鑒定

綠色熒光蛋白EGFP基因序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后，由上海生工生物工程有限公司合成后，設(shè)計相應(yīng)的引物egfp F／R獲得egfp基因片段。用Bam HⅠ限制性內(nèi)切酶對單增李斯特氏菌穿梭質(zhì)粒pERL3進行單酶切后，用膠回收試劑盒獲得純化的線性化載體。使用多片段一步克隆試劑盒分別將不同的啟動子片段、egfp基因片段和線性化載體片段利用同源重組原理進行連接，獲得不同的pERL3-Promoteregfp重組質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，并在含有卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。用引物pERL3 F／R對陽性克隆進行PCR鑒定，將目標序列長度正確的質(zhì)粒送至華大基因公司測序。將測序正確的含有不同啟動子的綠色熒光蛋白基因報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EGD-eΔactA／inlB感受態(tài)細胞，并在含有紅霉素的BHI瓊脂培養(yǎng)基上篩選，用引物pERL3 F／R對陽性克隆進行PCR鑒定，序列長度正確的為表達綠色熒光蛋白的重組單增李斯特氏菌。成功構(gòu)建的啟動子、egfp基因以及鑒定重組質(zhì)粒的引物均展示在表2中。

表2 重組菌株所用啟動子、pERL3質(zhì)粒以及egfp基因的引物列表

1.2.4 重組菌株熒光強度的測定

將表達綠色熒光蛋白的重組L．monocytogenes在含有紅霉素的BHI平板上進行活化，挑取平板上的單菌落接種到20 mL含有紅霉素的BHI培養(yǎng)液中，放置在厭氧培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日，5 000 r／min離心5 min收集菌體，并用無菌PBS溶液洗滌菌體一次，調(diào)整菌液濃度為OD600＝1.0后，取200 μL菌液至黑色96孔板，用酶標儀檢測在激發(fā)光485 nm和發(fā)射光525 nm處的熒光強度。每株菌設(shè)置3個生物學重復，結(jié)果均采用GraphPad Prism軟件進行分析，通過單因素方差分析比較組間差異。p＜0．05被認為具有統(tǒng)計學意義（*p＜0．05，**p＜0．01，****p＜0.000 1）。

1.2.5 外源蛋白表達菌株的構(gòu)建及表達水平的鑒定

外源蛋白天青蛋白和產(chǎn)氣莢膜梭菌θ毒素蛋白的氨基酸序列從Uniprot網(wǎng)站獲得并倒推出cDNA序列，經(jīng)密碼子優(yōu)化，并在3’端連上了6×His標簽基因序列后，交由上海生工生物工程有限公司合成。將在厭氧培養(yǎng)條件下啟動綠色熒光蛋白表達水平最高的啟動子序列Pan4、天青蛋白的基因序列azu或產(chǎn)氣莢膜梭菌θ毒素蛋白的基因序列pfo以及Bam HⅠ單酶切后的pERL3線性化載體片段利用同源重組原理進行連接，獲得pERL3-Pan4-azu和pERL3-Pan4-pfo重組質(zhì)粒。將測序正確的兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至EGD-eΔactA／inlB中。

將重組菌株EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Pan4-azu和EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Pan4-pfo以1×104CFU涂布在含有紅霉素的BHI平板上，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用細胞刮刀刮取全部菌落，接種到200 mL含有紅霉素的BHI培養(yǎng)基中，在37℃的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h。離心收集菌體，將菌體重懸在含有10 mmol／L Tris-HCl（pH7.5）、10 mmol／L PMSF、5 mmol／L Na2-EDTA的裂解緩沖液中。將菌體以60%功率超聲破碎，超聲2 s，間隔3 s，總時長為30 min。將超聲后的混合物在4℃條件下以12 000 r／min離心20 min，收集上清。將上清蛋白用孔徑為3 kDa的超濾管濃縮后，通過Western-blot檢測樣本中天青蛋白（～16.83 kD）和θ毒素蛋白（～55.88 kD）的表達。檢測一抗為抗His標簽的鼠單抗（Absin，上海，中國），二抗為Alexa Fluor Plus 800修飾的羊抗鼠IgG（Invitrogen，美國）。

2 結(jié)果與討論

2.1 厭氧水平下EGD-e高轉(zhuǎn)錄水平啟動子篩選

通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對厭氧條件下（EGDeAN）和有氧條件下（EGDe）培養(yǎng)的EGDe基因組中2 825個基因的轉(zhuǎn)錄圖譜進行分析。如圖1所示，共表達韋恩圖顯示EGDeAN組和EGDe組共表達基因共有2 580個，EGDeAN組特有表達基因數(shù)為186個，EGDe組特有表達基因數(shù)為59個。

圖1 EGDeAN組和EGDe組基因共表達韋恩圖

對EGDeAN組和EGDe組的基因表達進行顯著性差異分析，如圖2所示，EGDeAN組的基因相對于EGDe組共有546個基因顯著上調(diào)，共有621個基因顯著下調(diào)。因為FPKM值的計算考慮了測序深度和基因長度對讀數(shù)計數(shù)的影響，是評估基因表達水平的常用方法［20］。因此從顯著上調(diào)的546個基因中，根據(jù)EGDeAN組的FPKM值大于1 000，EGDe組的FPKM值小于3 000的篩選條件，從高到低排列進行篩選，最終篩選出26個基因，如表1所示。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中EGD-e全基因組找到每個基因的對應(yīng)上游非編碼序列，以此作為該基因的啟動子區(qū)域。

圖2 EGDeAN組和EGDe組基因表達差異火山圖

2.2 熒光報告菌株的構(gòu)建

為了直觀地表征篩選出的啟動子在厭氧培養(yǎng)條件下啟動下游基因轉(zhuǎn)錄表達的水平，如圖3所示，將篩選出的啟動子連接綠色熒光蛋白報告基因egfp構(gòu)建重組熒光報告菌株EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Promoter-egfp。雖然根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共篩選出了26個基因，但其中8個啟動子未能成功構(gòu)建，最終成功構(gòu)建了18個攜帶不同的pERL3-Promoter-egfp質(zhì)粒的重組菌株，PCR鑒定結(jié)果如圖4所示。

圖3 熒光蛋白表達質(zhì)粒構(gòu)建圖

圖4 熒光表達菌株P(guān)CR鑒定圖

2.3 重組菌株熒光強度的測定

為了比較不同重組熒光報告菌株的熒光強度，并以此作為評估啟動子強度的標準，將菌液濃度統(tǒng)一調(diào)整到OD600＝1.0，并對數(shù)據(jù)進行歸一化處理，即將測得的熒光值除以O(shè)D600作為結(jié)果。如圖5所示，以EGD-eΔactA／inlB為對照組，比較了基于轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果篩選后成功構(gòu)建的18個候選強啟動子和EGD-e hly基因的啟動子調(diào)控下熒光蛋白的表達水平。hly基因的啟動子是減毒L．monocytogenes活載體應(yīng)用中常用的啟動子［21，22］。結(jié)果顯示，含有Pan4，Pan10，Pan12，Pan14啟動子的熒光報告菌株的熒光強度不僅均顯著高于對照組，也均高于含有Phly啟動子的重組菌株，它們的熒光值分別為Phly組的7.8倍，1.9倍，2.0倍和1.8倍。其中Pan4啟動子調(diào)控下的熒光蛋白表達水平最高，因此選擇Pan4啟動子進一步評估其應(yīng)用潛力。

圖5 重組菌株EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Promoter-egfp熒光強度測定結(jié)果

2.4 Pan4啟動外源蛋白表達能力的評估

減毒L．monocytogenes可作為疫苗或藥物活載體應(yīng)用于腫瘤治療中，因此在腫瘤微環(huán)境的缺氧條件下表達外源蛋白的能力十分重要。為了評估厭氧啟動子Pan4的應(yīng)用潛力，利用天青蛋白和產(chǎn)氣莢膜梭菌θ毒素作為外源蛋白，以不表達外源蛋白的EGD-eΔactA／inlB為對照，檢測兩種蛋白在Pan4啟動子控制下的表達水平。天青蛋白和θ毒素均為兩種細菌毒素蛋白，且已在之前的研究中證明具有一定的抗腫瘤作用，是兩種可用于減毒L．monocytogenes活載體遞送的候選靶向治療蛋白［23，24］。如圖6所示，EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Pan4-pfo胞內(nèi)蛋白樣本在55 kD左右有明顯的條帶，說明在Pan4啟動子調(diào)控下θ蛋白可在胞內(nèi)表達。EGD-eΔactA／inlBpERL3-Pan4-azu胞內(nèi)蛋白樣本在靠近17 kD左右有明顯的條帶，說明Pan4啟動子可調(diào)控天青蛋白在EGD-eΔactA／inlB中表達。由此可見，篩選出的厭氧啟動子Pan4調(diào)控外源蛋白表達的能力不僅局限于一種蛋白，具有一定的廣泛適用性。

圖6 重組菌株EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Pan4-pfo和EGD-eΔactA／inlB-pERL3-Pan4-azu外源蛋白表達鑒定圖

3 結(jié)論

本文通過對在厭氧和有氧環(huán)境下培養(yǎng)的L．monocytogenes總RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，利用綠色熒光蛋白作為報告系統(tǒng)，從中篩選出在厭氧條件下表達水平有顯著性增加的啟動子Pan4、Pan10、Pan12和Pan14。其中Pan4啟動子調(diào)控下的綠色熒光蛋白表達水平最高。之后以天青蛋白和產(chǎn)氣莢膜梭菌θ毒素為外源蛋白，評估了該啟動子在不同外源蛋白表達調(diào)控中的作用。我們發(fā)現(xiàn)Pan4啟動子可以成功啟動天青蛋白和產(chǎn)氣莢膜梭菌θ毒素在EGD-e ΔactA／inlB中表達，這說明在厭氧環(huán)境下Pan4啟動子可調(diào)控EGD-eΔactA／inlB表達不同的外源蛋白，具有一定的廣泛適用性，可促進減毒L．monocytogenes活載體在腫瘤藥物或疫苗載體方面的應(yīng)用研發(fā)。雖然Pan4啟動子是個有潛力的L．monocytogenes厭氧啟動子，但僅有一個啟動子還不足以完善減毒L．monocytogenes腫瘤藥物或疫苗活載體的外源蛋白表達系統(tǒng)，因此基于Pan4啟動子進行進一步人工改造是未來豐富L．monocytogenes厭氧啟動子庫的發(fā)展方向。