朱帥 祖玲玲 徐嵩
有數(shù)據(jù)[1]表明,肺癌是全球第二最常見的癌癥,但是肺癌導(dǎo)致的死亡依然占據(jù)最大的比例。84%的肺癌是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),確診的肺癌中只有20%-30%可以通過根治性手術(shù)治療[2]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑,如程序性死亡受體-1(programmed cell death protein 1, PD-1)、程序性死亡配體-1(programmed cell death protein ligand 1, PD-L1)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4)抑制劑,已在黑色素瘤、腎癌、NSCLC和其他腫瘤中顯示出良好的療效[3-5]。盡管免疫檢查點(diǎn)抑制劑在肺腺癌患者中有顯著的臨床療效和持久的應(yīng)答,但抗PD-1/PD-L1治療在肺腺癌患者群體中的總有效率僅為20%-30%[6]。因此,迫切需要尋找其他有利于預(yù)測免疫治療對肺腺癌患者的生物標(biāo)記物以提高免疫治療有效率,包括腫瘤細(xì)胞相關(guān)生物標(biāo)記物、腫瘤免疫微環(huán)境(tumor microenviroment, TME)相關(guān)生物標(biāo)記物、液體活檢相關(guān)生物標(biāo)記物和宿主相關(guān)標(biāo)記物。
網(wǎng)狀體家族基因 1(Reticulon family gene 1,RTN1)(以前稱為“神經(jīng)內(nèi)分泌特異性蛋白”)是一種與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的網(wǎng)狀體編碼基因。網(wǎng)狀體在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的膜運(yùn)輸或神經(jīng)內(nèi)分泌分泌中起關(guān)鍵作用。RTN1編碼3個(gè)變體,即NSP-A、NSP-B和NSP-C,它們通過同源C末端區(qū)域中的2個(gè)假定跨膜結(jié)構(gòu)域連接到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[7-10]。
先前的研究[11,12]已將RTN1作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥的潛在診斷/治療標(biāo)志物引入。RTN1被認(rèn)為是具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的癌癥的潛在標(biāo)記物[8]。已有研究[11]表明,RTN1可降低BCL2樣蛋白1(BCL2L1)編碼的一種蛋白[即B細(xì)胞淋巴瘤-特大型(BCL-XL)]的抗凋亡活性。事實(shí)上,RTN1可以改變此蛋白的亞細(xì)胞定位,從線粒體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng),從而破壞其抗細(xì)胞凋亡的作用。
然而在肺腺癌患者中RTN1的表達(dá)情況及其對免疫微環(huán)境影響均未有報(bào)道。在本研究中,我們旨在使用公共數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)工具研究RTN1在肺癌中的表達(dá)及其與肺癌中免疫浸潤和存活的相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)或許將有助于確定肺癌預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物,并有助于個(gè)體化免疫治療。
1.1 The Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫 TCGA(https://www.cancer.gov/tcga)是一個(gè)公共資助的項(xiàng)目,旨在通過大規(guī)?;蚪M測序,在30多個(gè)人類腫瘤的大型隊(duì)列中編目和發(fā)現(xiàn)主要的致癌基因組變化[13]。TCGA包括RNA測序、miRNA測序、DNA測序、DNA甲基化測序和臨床信息。從TCGA下載肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)患者的轉(zhuǎn)錄組和臨床資料,通過整理獲得516例患者的表達(dá)矩陣和臨床信息。
1.2 GEPIA 2數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA 2(http://gepia2.cancerpku.cn/)是基因表達(dá)譜交互分析的更新版,用于分析來自TCGA和GTEx程序的9,736個(gè)腫瘤和8,587個(gè)正常樣本的RNA測序表達(dá)數(shù)據(jù)[14,15]。進(jìn)行腫瘤/正常組織差異表達(dá)分析、患者生存分析、相似基因檢測、相關(guān)分析和降維分析。用GEPIA2軟件分析LUAD患者RTN1表達(dá)與TCGA數(shù)據(jù)和GTEx數(shù)據(jù)匹配的差異,并分析RTN1的預(yù)后意義。
1.3 TIMER數(shù)據(jù)庫分析 TIMER是用于系統(tǒng)分析不同癌癥類型的免疫浸潤的綜合資源(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)TIMER應(yīng)用先前發(fā)表的統(tǒng)計(jì)方法來從基因表達(dá)譜推斷腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的豐度[16,17]。TIMER數(shù)據(jù)庫包括來自癌癥TCGA的32種癌癥類型的10,897個(gè)樣本,用于估計(jì)免疫浸潤的豐度[18]。我們通過基因模塊分析了不同類型癌癥中的RTN1表達(dá)以及RTN1表達(dá)與免疫浸潤豐度的相關(guān)性,包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。針對腫瘤純度的基因表達(dá)水平顯示在最左側(cè)的面板上。
1.4 人類蛋白質(zhì)圖譜(Human Protein Atlas, HPA) 人類蛋白質(zhì)圖譜(https://www.proteinatlas.org/)于2003年啟動(dòng),利用多種組學(xué)技術(shù)繪制細(xì)胞、組織和器官中的所有人類蛋白質(zhì)圖譜,包括基于抗體的成像、基于質(zhì)譜儀的蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)。HPA由組織、單細(xì)胞類型、病理、血液、腦和細(xì)胞圖譜組成。計(jì)算機(jī)檢索HPA病理圖譜中的“RTN1”(“肺癌”為癌類型)。然后,我們檢查了每一幅圖像的細(xì)節(jié),并選擇了LUAD中具有代表性的癌癥和鄰近樣本的圖像。
1.5 基因集富集分析 從TCGA下載516例LUAD患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),并根據(jù)RTN1表達(dá)的中值將RTN1表達(dá)高或低分組。GSEA檢測到兩組中排名靠前的基因富集的通路。在每次分析中,基因組排列設(shè)置為1,000。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均通過在線網(wǎng)站TIMER 2.0(http://timer.comp-genomics.org/)完成。使用Wilcoxon檢驗(yàn)分析兩組樣本的差異。使用Pearson卡方檢驗(yàn)分析RTN1表達(dá)與臨床特征變量之間的關(guān)聯(lián)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型用于單變量和多變量分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異設(shè)定為P<0.05。
2.1 RTN1表達(dá)高低與患者臨床病理特征之間的關(guān)系 我們的分析發(fā)現(xiàn),RTN1的表達(dá)水平與肺腺癌患者的生命狀態(tài)、年齡、性別、吸煙史、腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移(Tumor Node Metastasis, TNM)分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理特征之間存在關(guān)聯(lián)。根據(jù)RTN1 mRNA水平的中值,258例患者被歸類為RTN1高表達(dá),258例患者被歸類為RTN1低表達(dá)。如表1所示,RTN1表達(dá)與肺腺癌患者的生命狀態(tài)(P=0.003)和性別(P<0.001)顯著相關(guān)。RTN1表達(dá)與其他臨床病理因素之間無顯著相關(guān)性,包括年齡(P=0.222)、吸煙史(P=0.068)、TNM分期(P=0.160)、腫瘤大?。≒=0.162)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.166)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.640)。
表1 RTN1高低表達(dá)肺腺癌患者臨床基本信息Tab 1 Analysis of clinical data of lung adenocarcinoma patients with high and low expression of RTN1
2.2 RTN1在肺腺癌中表達(dá)情況及預(yù)后分析 為了研究腫瘤和正常組織之間RTN1表達(dá)水平的差異,我們使用TIMER 2.0和GEPIA 2分析RNA-seq數(shù)據(jù)。TIMER 2.0,將TCGA腫瘤組織與正常組織匹配,GEPIA 2,將TCGA腫瘤組織與GTEx數(shù)據(jù)匹配。應(yīng)用TIMER 2.0分析正常組織樣本和LUAD組織樣本,結(jié)果(圖1A)顯示LUAD組織中RTN1的 mRNA 水平顯著低于正常組織。我們還發(fā)現(xiàn),RTN1在大多數(shù)實(shí)體癌中是較低的,包括結(jié)腸腺癌、肺鱗癌、大腸腺癌和甲狀腺癌。應(yīng)用GEPIA 2的分析結(jié)果也證實(shí)了RTN1在LUAD組織中低表達(dá)(圖1B)。這些數(shù)據(jù)表明,LUAD患者的RTN1表達(dá)降低。同時(shí)為了研究RTN1在LUAD中的預(yù)后價(jià)值,我們使用GEPIA 2中的Kaplan-Meier生存分析工具分析了TCGA的預(yù)后數(shù)據(jù)。其結(jié)果表明(圖1C),RTN1的高表達(dá)與患者更長的OS顯著相關(guān)(HR=0.6,P=0.000)。
圖1 RTN1在LUAD中表達(dá)與預(yù)后情況。A: TIMER數(shù)據(jù)庫預(yù)測RTN1在肺腺癌組織表達(dá)情況;B: GEPIA2數(shù)據(jù)庫預(yù)測RTN1在肺腺癌組織表達(dá)情況;C: RTN1表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。 Fig 1 The expression level and prognostic value of RTN1 in patients with lung adenocarcinoma. A: Increased or decreased expression of RTN1 in cancers compared with adjacent normal tissue in TIMER database; B: Decreased expression of RTN1 in cancers compared with adjacent normal tissue in GEPIA database; C: The relationship between RTN1 expression and prognosis of patients with lung adenocarcinoma; LUAD: lung adenocarcinoma.
2.3 GO及KEGG富集分析RTN1調(diào)節(jié)相關(guān)通路 對TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者的測序數(shù)據(jù)分析,取logFC<1及FDR<0.05做差異分析,我們發(fā)現(xiàn)共有245個(gè)基因上調(diào),23個(gè)基因下調(diào)。對這些差異表達(dá)基因通過GO及KEGG富集分析后,我們發(fā)現(xiàn)其可能參與吞噬體的形成、造血細(xì)胞形成和細(xì)胞黏附的過程,且在GO富集分析中可以發(fā)現(xiàn)RTN1在T細(xì)胞活化起著重要作用,這提示我們該基因可能可以參與免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)(圖2A,圖2B)。
圖2 RTN1高表達(dá)患者基因通路富集分析。A:火山圖;B:KEGG及GO富集分析。Fig 2 GSEA pathways enriched in samples with high RTU1 expression. A: Volcanic map; B: KEGG and GO analysis.
2.4 LUAD中與RTN1共表達(dá)的基因分析 為了進(jìn)一步研究RTN1在LUAD中的抑癌作用,我們使用cBioPortal與TCGA數(shù)據(jù)來分析與RTN1共表達(dá)正相關(guān)的基因。我們選擇了與RTN1最顯著相關(guān)的6個(gè)基因(圖3A-圖3F)。我們使用TIMER進(jìn)一步驗(yàn)證了RTN1與這些基因之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示,RTN1與BTK、CD4、ECSF1R、MNDA、NCKAP1L和SNX20顯著相關(guān)(圖3G-圖3L)。
圖3 LUAD中RTN1的共表達(dá)基因。A-F: cBioPortal數(shù)據(jù)庫肺腺癌隊(duì)列鑒定與RTN1共表達(dá)的基因;G-L:TIMER數(shù)據(jù)庫肺腺癌隊(duì)列鑒定與RTN1共表達(dá)的基因。Fig 3 Co-expressed genes of RTN1 in LUAD. A-F: The genes co-expressed with RTN1 in LUAD were assessed in cBioPortal database; G-L: The genes co-expressed with RTN1 in LUAD were assessed in the TIMER database.
2.5RTN1及其共表達(dá)基因?qū)Ψ伟┙M織免疫相關(guān)細(xì)胞浸潤水平的影響分析 我們使用TISCH數(shù)據(jù)集在單細(xì)胞水平上(EMTAB6149和GSE131907)研究了LUAD腫瘤微環(huán)境中RTN1的表達(dá)。在EMTAB6149中,RTN1主要在免疫細(xì)胞中表達(dá),包括B細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8 T ex細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、CD4 Tconv細(xì)胞、單/巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。RTN1在惡性細(xì)胞中輕度表達(dá);然而,它幾乎不在內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肺泡細(xì)胞中表達(dá)。在GSE131907中,RTN1主要在B細(xì)胞、CD4 Tconv細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、CD8 Tex細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單/巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞中表達(dá),而在內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。此外,我們使用TIMER數(shù)據(jù)庫來探索RTN1表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系。TIMER顯示RTN1表達(dá)與幾種類型的浸潤免疫細(xì)胞呈正相關(guān),包括B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(圖 4)。
我們發(fā)現(xiàn)RTN1與幾種免疫細(xì)胞之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(圖5)。CIBERSORT結(jié)果顯示,RTN1高表達(dá)組CD4+T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、髓樣樹突狀細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞顯著上調(diào)(圖5),提示LRMP可能與免疫檢查點(diǎn)有關(guān)。為進(jìn)一步研究RTN1與免疫檢查點(diǎn)之間的關(guān)系,我們將12例LUAD患者分為兩組,比較兩組免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)水平。G1組RTN1高表達(dá),而G2組RTN1低表達(dá)。
圖5 RTN1不同表達(dá)分組間的肺腺癌患者免疫微環(huán)境差異(續(xù)圖)。G1:高表達(dá); G2:低表達(dá)。Fig 5 Changes of immune microenvironment in lung adenocarcinoma patients with different expression of RTN1 (continued). G1: high expression of RTN1; G2: low expression of RTN1.
圖5 RTN1不同表達(dá)分組間的肺腺癌患者免疫微環(huán)境差異。G1:高表達(dá); G2:低表達(dá)。 Fig 5 Changes of immune microenvironment in lung adenocarcinoma patients with different expression of RTN1. G1: high expression of RTN1; G2: low expression of RTN1.
2.6 RTN1表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)密切相關(guān) 高低表達(dá)患者并將其分別G1(高表達(dá))組及G2(低表達(dá))組,使用TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),RTN1表達(dá)與常見免疫檢查點(diǎn)CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1LG2、TIGIT、SIGLEC15等的表達(dá)顯著相關(guān)(圖6),提示我們RTN1可能與免疫檢查點(diǎn)密切相關(guān),且有望在免疫治療中發(fā)揮作用。
圖6 RTN1表達(dá)量對免疫檢查點(diǎn)表達(dá)的影響Fig 6 The influence of RTN1 on the expressions of immune checkpoints
基因表達(dá)異常與肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),并預(yù)示著肺腺癌患者的預(yù)后。然而,肺腺癌和其腫瘤微環(huán)境相互作用的分子機(jī)制尚不清楚。在本研究中,我們證明RTN1在LUAD組織中的表達(dá)顯著降低,并且與LUAD患者的生命狀態(tài)、性別等有關(guān)。此外,RTN1的低表達(dá)與預(yù)后和總存活率有關(guān)。這些結(jié)果提示RTN1可能是一種腫瘤抑制基因,參與了肺腺癌的進(jìn)展。
RTN1是一種與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的網(wǎng)狀體編碼基因。RTN1在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的膜運(yùn)輸或神經(jīng)內(nèi)分泌分泌中起關(guān)鍵作用,同時(shí)RTN1作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥的潛在診斷/治療標(biāo)志物。然而在肺腺癌患者中RTN1的表達(dá)情況及其對免疫微環(huán)境影響均未有報(bào)道。本研究旨在使用公共數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)工具研究 RTN1在肺癌中的表達(dá)及其與肺癌中免疫浸潤和存活的相關(guān)性。在本項(xiàng)研究中,我們發(fā)現(xiàn)RTN1在多種癌癥中異常表達(dá),表明它可能在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用。在LUAD中,我們發(fā)現(xiàn)RTN1在腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于在正常組織中的表達(dá),提示RTN1可能參與了LUAD的腫瘤抑制作用。此外,本研究還驗(yàn)證了RTN1在LUAD細(xì)胞系和腫瘤組織中的表達(dá)降低。
為了進(jìn)一步探討RTN1在LUAD腫瘤發(fā)生中的分子功能和可能的機(jī)制,我們進(jìn)行了GSEA分析,以探索在RTN1高表達(dá)的樣本中豐富的途徑。共選擇了15條與細(xì)胞黏附、免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路。在KEGG富集分析中發(fā)現(xiàn)其與“Hematopoietic cell lineage”信號通路可能有密切關(guān)系,同時(shí)GO富集分析發(fā)現(xiàn)其與T細(xì)胞的活化可能有密切關(guān)系。
我們通過TCGA和TIMER數(shù)據(jù)庫雙重驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)RTN1與BTK、CD4、ECSF1R、MNDA、NCKAP1L和SNX20顯著相關(guān)。進(jìn)一步對其共表達(dá)相關(guān)基因進(jìn)行分析后,我們發(fā)現(xiàn)RTN1表達(dá)改變時(shí)也會(huì)引起免疫效應(yīng)細(xì)胞如CD4+T細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞比例的升高[19,20]。免疫微環(huán)境中效應(yīng)細(xì)胞比例的升高往往提示著患者的較好預(yù)后。最后我們發(fā)現(xiàn)RTN1表達(dá)與常見免疫檢查點(diǎn)CD274、CTLA4、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PDCD1LG2、TIGIT、SIGLEC15等的表達(dá)顯著相關(guān)。
盡管我們的研究結(jié)果表明RTN1與免疫浸潤相關(guān)并可作為LUAD的預(yù)后生物標(biāo)志物,但該研究仍有一些局限性。首先,我們的研究基于有限的數(shù)據(jù)樣本,可能存在一定的偏差。其次,該發(fā)現(xiàn)是否適用于所有具有不同分子改變的LUAD患者仍有待證實(shí)。綜上所述,RTN1可能作為一種腫瘤抑制基因并表明更好的預(yù)后。此外,RTN1與可能參與LUAD中免疫治療反應(yīng)的免疫浸潤有關(guān)。需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)。
Author contributions
Zhu S wrote the article. Zu LL completed the figures and tables. Xu S conceived, organized and edited the text. All authors contributed to the article and approved the submitted version.