殷曉霞，李 永，白 睿，劉 博，孫改霞

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科，河北 張家口 07500；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，河北 張家口 075000)

臨床中，胃癌為較常見的惡性腫瘤，雖然手術(shù)聯(lián)合放化療有助于改善早期胃癌患者預(yù)后，但部分患者預(yù)后仍較差[1]。因此，探尋胃癌的發(fā)病機(jī)制，明確其早期診療靶標(biāo)，對于胃癌臨床診療意義重大。溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(bromodomain protein 4，BRD4)為溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)家族成員，有研究顯示，BRD4參與腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等過程[2]。線粒體單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-stranded DNA binding protein，SSBP1)是線粒體DNA合成的重要因子，其可對線粒體生物功能產(chǎn)生一定影響[3]。既往研究顯示，SSBP1與肺腺癌、肝癌等腫瘤有關(guān)[4-5]。另有研究報(bào)道，腫瘤相關(guān)蛋白可對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征造成一定影響，致使腫瘤細(xì)胞的黏附能力發(fā)生變化[6]。原鈣黏蛋白17( proto-cadherin 17，PCDH17)是一種鈣依賴性跨膜蛋白，在多種腫瘤組織中表達(dá)異常[7]。因此，本研究探討了BRD4、SSBP1、PCDH17與胃癌的關(guān)系，旨在為胃癌的早期診療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月—2020年10月于我院接受手術(shù)切除、消化內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)或胃鏡活檢的150例患者納入研究，術(shù)前均未經(jīng)放化療治療。其中，胃癌組織組(50例)：均經(jīng)術(shù)后病理診斷為原發(fā)性胃癌，男性26例，女性24例；年齡31～73歲，平均(52.07±2.37)歲。癌前病變組織組(50例)：均經(jīng)病理診斷為低級別或高級別上皮內(nèi)瘤變，男性22例，女性28例；年齡33～74歲，平均(53.11±3.05)歲。正常胃黏膜組織組(50例)：均經(jīng)病理診斷為非萎縮性胃炎，男性25例，女性25例；年齡30～72歲，平均(52.69±2.91)歲。3組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1組織樣本中BRD4、SSBP1及PCDH17蛋白檢測 將收集的組織標(biāo)本用石蠟包埋，作連續(xù)切片(厚度4 mm左右)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法測定組織標(biāo)本中BRD4、SSBP1及PCDH17蛋白水平。石蠟切片經(jīng)脫蠟、醇化后，應(yīng)用檸檬酸鈉緩沖液高溫修復(fù)抗原，維持沸騰10 min后自然冷卻，滴加10%正常山羊血清封閉(37 ℃ 20 min)，加入一抗(BRD4抗體，1∶1 000稀釋，由Bethyl Laboratories公司提供；SSBP1抗體，1∶200稀釋，由Abcam公司提供；PCDH17，1∶500稀釋，由R&D Systems公司提供)，4 ℃過夜，次日加入對應(yīng)二抗，恒溫箱孵育(37 ℃ 30 min)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂膠固；以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照。

1.2.2相關(guān)血清指標(biāo)檢測 采集3組空腹靜脈血8 mL，經(jīng)離心處理(1 500 r/min，15 min)后分離血清。血清癌抗原199( carbohydrate antigen,CA199)應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法檢測，全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購自羅氏公司，型號為E602；血清胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)Ⅰ、PGⅡ、胃泌素17(gastrin-17,G-17)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定雙抗體夾心法檢測，試劑盒購自上海江萊生物科技公司；血清幽門螺桿菌(helicobacter pylori，HP)抗體應(yīng)用膠體金法定性檢測，試劑盒購自珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程公司。

1.3結(jié)果評價(jià) 由本院經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲法分析，在400倍光學(xué)顯微鏡下，選取10個(gè)高倍視野(每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞)，計(jì)算BRD4、SSBP1與PCDH17陽性細(xì)胞占同類細(xì)胞的比例。陰性(0分)：陽性細(xì)胞≤5% ，弱陽性(1分)：陽性細(xì)胞為5%～30%，中等陽性(2分)：陽性細(xì)胞為30%～60%，強(qiáng)陽性(3分)：陽性細(xì)胞>60% 。評分為1～3分均判定為陽性。BRD4陽性染色判斷標(biāo)準(zhǔn)：胞漿及細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。SSBP1陽性染色判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。PCDH17陽性染色判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)黃色、棕黃色或褐色顆粒。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；等級資料比較用秩和檢驗(yàn)；應(yīng)用ROC曲線分析BRD4、SSBP1及PCDH17診斷早期胃癌的價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1組織樣本中BRD4、SSBP1及PCDH17的表達(dá) 胃癌組織中BRD4和SSBP1呈高表達(dá)，而PCDH17呈低表達(dá)。3組組織樣本中BRD4、SSBP1及PCDH17的陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 組織樣本中BRD4、SSBP1及PCDH17的表達(dá)STable 1 Expression of BRD4, SSBP1 and PCDH17 in tissue samples (n=50，例數(shù))

2.2 3組血清指標(biāo)分析 3組血清CA199、PGⅠ、PGⅡ、G-17水平及HP陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；胃癌組織組患者血清CA199、PGⅠ、G-17水平及HP陽性率明顯高于癌前病變組織和正常胃黏膜組織組，而PGⅡ水平低于癌前病變組織和正常胃黏膜組織組(P<0.05)，見表2。

表2 3組血清指標(biāo)分析Table 1 Analysis of serum indicators in three groups

2.3BRD4、SSBP1及PCDH17的表達(dá)與胃癌臨床特征的關(guān)系 不同性別、年齡、腫瘤直徑及分化程度的胃癌組織中BRD4、SSBP1、PCDH17的陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；臨床分期為Ⅲ期～Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中BRD4、SSBP1、PCDH17的陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 BRD4、SSBP1及PCDH17的表達(dá)與胃癌臨床特征的關(guān)系Table 3 Relationship between BRD4, SSBP1 and PCDH17 expression and clinical features of gastric cancer (n=50,例數(shù)，%)

表3 (續(xù))

2.4ROC曲線分析 由ROC曲線分析可知，BRD4診斷胃癌的AUC為0.806(95%CI:0.811～0.913,P<0.05),診斷敏感度為85.62%，特異度為82.49%%；SSBP1診斷胃癌的AUC為0.759(95%CI:0.745～0.883,P<0.05),診斷敏感度為81.77%，特異度為76.83%；PCDH17診斷胃癌的AUC為0.703(95%CI:0.694～0.823,P<0.05),診斷敏感度為78.49%，特異度為72.62%；BRD4+SSBP1+PCDH17診斷胃癌的AUC為0.895(95%CI:0.867～0.998,P<0.05),診斷敏感度為89.46%，特異度為86.31%；結(jié)果提示，與單一指標(biāo)比較，BRD4+SSBP1+PCDH17診斷的敏感度和特異度均較高，見圖1。

圖1 ROC曲線分析Figure 1 ROS curve analysis

3 討 論

胃癌為臨床常見的惡性腫瘤，盡管治療方式不斷改善，但患者預(yù)后仍不理想[8]。因此，探究胃癌發(fā)病機(jī)制，明確其早期診療靶標(biāo)，對于胃癌的臨床診治意義重大。BRD4為BET家族成員之一，其與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)[9]。張華鵬[10]研究報(bào)道，BRD4在肝癌細(xì)胞中呈高表達(dá),且其表達(dá)量隨疾病進(jìn)展而升高，敲低BRD4可抑制肝癌細(xì)胞增殖。吳小秦等[11]學(xué)者研究報(bào)道，BRD4在喉鱗狀細(xì)胞癌腫瘤組織中呈高表達(dá)，可促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。SSBP1為一種同源四聚體，可參與線粒體DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄[12]。楊丹平等[13]學(xué)者提出，SSBP1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào)，參與食管鱗癌的發(fā)生進(jìn)展。PCDH17為一種單鏈跨膜蛋白，可介導(dǎo)細(xì)胞間黏附作用[14]。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，PCDH17在多種腫瘤組織中呈低表達(dá)，其參與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展[15]。由以上研究可知，BRD4、SSBP1及PCDH17與惡性腫瘤有關(guān)，因此，本研究進(jìn)一步探究了三者聯(lián)合診斷胃癌的臨床價(jià)值。

本研究顯示，3組組織樣本中BRD4、SSBP1及PCDH17的陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，胃癌組織中BRD4和SSBP1呈高表達(dá)，而PCDH17呈低表達(dá)。結(jié)果提示，BRD4和SSBP1可能對胃癌的發(fā)生起促進(jìn)作用，PCDH17可能是潛在的抑癌基因。張竹等[16]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，BRD4和SSBP1在早期胃癌組織中的陽性表達(dá)率較高，與胃癌前病變進(jìn)展有關(guān)。朱春霞等[17]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，PCDH17基因甲基化診斷胃癌的特異度較高，可用于胃癌早期篩查。本研究探究了胃癌與患者臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)臨床分期為Ⅲ期～Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中BRD4、SSBP1、PCDH17的陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，BRD4、SSBP1、PCDH17的表達(dá)與胃癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。究其原因可能為：①BRD4可能通過調(diào)控信號通路促進(jìn)胃癌進(jìn)展[18]；②SSBP1突變可誘導(dǎo)腫瘤組織中mtDNA的突變，當(dāng)該突變積累到某種程度時(shí)，可引起腫瘤病變[19]；③PCDH17表達(dá)下調(diào)對組織的浸潤能力造成一定影響，還可對淋巴結(jié)黏附分子的運(yùn)動(dòng)造成一定影響，進(jìn)而促使疾病進(jìn)展[20]。本研究進(jìn)一步采用ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，BRD4+SSBP1+PCDH17聯(lián)合診斷的敏感度和特異度均高于單一指標(biāo)。結(jié)果提示，BRD4、SSBP1與PCDH17可作為胃癌早期診斷標(biāo)志物。

本研究顯示，3組血清CA199、PGⅠ、PGⅡ、G-17水平及HP陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；胃癌組織組患者血清CA199、PGⅠ、G-17水平及HP陽性率明顯高于癌前病變組織和正常胃黏膜組織組，而PGⅡ水平低于癌前病變組織和正常胃黏膜組織組。CA199為糖類抗原，其是結(jié)直腸癌、胃癌等消化系統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物[21]。PG為胃黏膜分泌的產(chǎn)物，其在臨床胃癌的篩查中具有一定價(jià)值[22]。G-17可反映胃竇分泌功能，其在胃癌診斷和篩查中發(fā)揮重要作用[23]。HP是誘發(fā)胃癌的主要病原體，HP的毒力因子(CagA和VacA等)可促進(jìn)胃癌的發(fā)生[24]。因此，檢測相關(guān)血清指標(biāo)有利于臨床胃癌的輔助診斷。

綜上所述，聯(lián)合檢測BRD4、SSBP1與PCDH17，輔以相關(guān)血清指標(biāo)，有利于臨床胃癌的鑒別診斷。