陳秀容 師怡 陳寧斌 吳暉 陳英 林耀發(fā)

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(福建省腫瘤醫(yī)院) 1淋巴瘤及頭頸腫瘤內(nèi)科，福建 福州 350014；2病理分子病理室)

鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤是一種發(fā)生于鼻部淋巴結(jié)外的非霍奇金淋巴瘤〔1〕。由于鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤缺乏特異性臨床特征，故常常被誤診為鼻腔炎癥〔2〕，因此，有必要尋找鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記物。miRNA是一類小的非編碼RNA，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可成為診斷腫瘤和評判預(yù)后的生物標(biāo)記物〔3〕。miR-542-3p在結(jié)直腸癌患者血清中低表達(dá)，并與TNM分期、淋巴血管間隙浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為診斷結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物〔4〕。但是miR-542-3p在鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)、功能和臨床意義尚不清楚。本研究通過收集鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者的組織標(biāo)本及臨床資料，旨在分析miR-542-3p在鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)和臨床意義，并通過體外實驗探究其對鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2020年12月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(福建省腫瘤醫(yī)院)診斷的56例初治鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者，另取同時期慢性鼻腔炎患者40例，男23例，女17例，60～78歲，平均(68.0±6.5)歲，分別制作病理石蠟標(biāo)本。結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者，年齡60～80歲，平均(72.2±4.6)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病理切片由醫(yī)院兩名及以上病理主治醫(yī)師確診；(2)臨床及病理學(xué)資料完整。符合以上全部標(biāo)準(zhǔn)的患者納入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往接受過其他放療、化療、免疫治療、靶向治療或中西醫(yī)結(jié)合治療；(2)合并其他腫瘤。

1.2細(xì)胞 SNK-6鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞于上海聯(lián)邁生物工程有限公司購買。

1.3試劑及儀器 RPMI1640液體培養(yǎng)基和胎牛血清均購于博士德生物工程有限公司；miR-542-3p抑制劑、miR-542-3p抑制劑陰性對照、miR-542-3p模擬物和miR-542-3p模擬物陰性對照均由上海吉滿生物科技有限公司合成；Trizol試劑和RevertAid RT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Thermo Fisher公司；MTT試劑盒購于美國Sigma-Aldrich公司；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光)、5-乙炔基-2-脫氧尿苷標(biāo)記法(EdU)細(xì)胞增殖檢測試劑盒和馬血清購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔單抗B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、兔多抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(Caspase3)和山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(H+L)均購于武漢愛博泰克生物技術(shù)有限公司。PR4100酶標(biāo)儀購于美國Bio-Rad公司，SDS-900C倒置顯微鏡購于上海蔡康光學(xué)儀器有限公司，BX63熒光顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.4方法

1.4.1實時熒光定量法(qRT-PCR)檢測標(biāo)本中miR-542-3p水平 取成對數(shù)期生長的各組細(xì)胞，使用Trizol試劑，提取細(xì)胞總RNA。引物序列如下。miR-542-3p上游引物：5′-UGUGACAGAUUGAUAA CUGAAA-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6作為內(nèi)參，上游引物：5′-AACGCTTCACGA ATTTGCGT-3′，下游引物：5′-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3′。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取1 μl的cDNA樣本，制備50 μl定量PCR體系，其中包含SYBRGreen熒光和miR-542-3p的引物，經(jīng)歷94℃預(yù)變性1 min，95℃變性25 s，62℃退火30 s，72℃延伸20 s，共35個循環(huán)。miR-542-3p的內(nèi)參基因為U6，相對表達(dá)量的計算采用2-ΔΔCt法。

1.4.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將SNK-6細(xì)胞株置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取成對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25% 胰蛋白酶消化后接種于6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞融合度至70%左右。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，分別將miR-542-3p模擬物、miR-542-3p模擬物陰性對照、miR-542-3p抑制劑和miR-542-3p抑制劑陰性對照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，并分別記為miR-542-3p組、miR-NC組、anti-miR-542-3p組和anti-miR-NC組，24 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4.3MTT檢測SNK-6細(xì)胞活力 取各組細(xì)胞，將細(xì)胞按5×103/ml接種于96孔板。另設(shè)空白對照組，僅加入細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)24、48、72 h后，分別加入5 mg/ml MTT 10 μl，繼續(xù)孵育4 h。吸凈上清液后加二甲基亞砜(DMSO)，于 37℃的條件下振蕩10 min。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔光密度OD值。

1.4.4EdU實驗檢測SNK-6細(xì)胞增殖能力 將轉(zhuǎn)染后各組SNK-6細(xì)胞以2.5×105細(xì)胞/孔的密度接種于24孔板上，24 h后，加入50 μmol/L的EdU，于37℃孵育2 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定0.5 h，隨后用Aollo熒光染色反應(yīng)液避光孵育0.5 h，甲醇洗滌3次，1×Hoechst33342反應(yīng)液孵育30 min，PBS洗滌,熒光顯微鏡下隨機拍照計數(shù),并計算EdU陽性細(xì)胞百分率。

1.4.5Transwell小室檢測SNK-6細(xì)胞侵襲能力 將0.05 g/L的基質(zhì)膠按1∶8的比例稀釋，鋪于Transwell上室底，置于室溫風(fēng)干。上室加入50 μl無血清培養(yǎng)基。將SNK-6細(xì)胞以1×105個/ml的細(xì)胞密度接種于Transwell上室內(nèi)；下室內(nèi)加入500 μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)液，并置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；用棉簽擦去PVPF膜靠近小室內(nèi)面的細(xì)胞后，用95%的乙醇固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，清水沖洗3遍，放于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.6TUNEL法檢測SNK-6細(xì)胞凋亡率 取各組對數(shù)期生長細(xì)胞，去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次。加入0.1% Triton X-100通透2 min，PBS洗滌2次，加入TUNEL反應(yīng)液，避光孵育1 h。隨后PBS洗滌3次，加入DAPI，用抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下拍照。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.7Western印跡檢測SNK-6細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組SNK-6細(xì)胞，提取蛋白樣品。取50 μl總蛋白上樣于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜。室溫下，采用5%脫脂牛奶封閉1 h。洗膜后，加入一抗在4℃下孵育過夜，洗膜，加入二抗在室溫下孵育1.5 h。洗膜后，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，采用圖像分析軟件Image J對Western印跡實驗所得結(jié)果圖像進(jìn)行灰度分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗、配對樣本t檢驗、秩和檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-542-3p在鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)下調(diào) 通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，56例鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤標(biāo)本中miR-542-3p表達(dá)量(1.16±0.13)顯著低于慢性鼻腔炎患者石蠟標(biāo)本(2.24±0.19；t=8.13，P<0.01)。

2.2miR-542-3p表達(dá)水平與鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤臨床病理特征的關(guān)系 按miR-542-3p在鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤石蠟標(biāo)本中表達(dá)量的平均值為界限，將56例鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者石蠟組織標(biāo)本分為高表達(dá)組(n=37)和低表達(dá)組(n=19)。結(jié)果顯示，miR-542-3p在鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤石蠟標(biāo)本中的表達(dá)量與患者臨床分期有關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、LDH水平、β2-MG和B癥狀無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤石蠟標(biāo)本中 miR-542-3p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3miR-542-3p對SNK-6細(xì)胞活力的影響 與miR-NC組相比，miR-542-3p 組SNK-6細(xì)胞24、48、72 h 的OD值顯著降低；與anti-miR-NC組相比較，anti-miR-542-3p組SNK-6細(xì)胞24、48、72 h的OD值顯著升高(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 miR-542-3p對SNK-6細(xì)胞活力的影響

2.4miR-542-3p對SNK-6細(xì)胞侵襲的影響 通過Transwell法可知，與miR-NC組〔(83.41±7.51)個〕相比較，miR-542-3p組〔(67.37±6.02)個,t=2.87,P=0.04〕細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著降低；與anti-miR-NC組〔(77.12±7.41)個〕相比，anti-miR-542-3p組〔(96.78±8.89)個，t=2.94，P=0.04〕細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著增高。見圖1。

2.5miR-542-3p對SNK-6細(xì)胞增殖的影響 與miR-NC組〔(39.22±3.91)%〕相比較，miR-542-3p組EdU陽性細(xì)胞率〔(28.81±2.81)%，t=3.74，P<0.05〕顯著降低；與anti-miR-NC組〔(37.49±3.68)%〕相比較，anti-miR-542-3p組EdU陽性細(xì)胞率〔(47.16±4.65)%,t=2.82，P<0.05〕顯著升高。見圖2。

圖1 miR-542-3p對SNK-6細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

2.6miR-542-3p對SNK-6細(xì)胞凋亡的影響 通過TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組〔(8.72±0.83)%〕相比較，miR-542-3p組〔(20.63±1.91)%，t=9.91,P<0.01〕細(xì)胞凋亡率顯著增高，與anti-miR-NC組〔(8.19±0.77)%〕相比較，anti-miR-542-3p組〔(3.61±0.32)%，t=9.51，P<0.01〕細(xì)胞凋亡率顯著降低。見圖3。

圖2 miR-542-3p對SNK-6細(xì)胞增殖的影響(×100)

圖3 miR-542-3p對SNK-6細(xì)胞凋亡的影響(×200)

2.7miR-542-3p對凋亡相關(guān)蛋白的影響 通過Western印跡實驗發(fā)現(xiàn)，miR-NC組、miR-542-3p組、anti-miR-NC組和anti-miR-542-3p組Bcl-2蛋白表達(dá)量分別為(1.17±0.11)、(0.84±0.08)、(1.24±0.12)和(1.97±0.15)；Caspase3蛋白表達(dá)量分別為(1.06±0.1)、(1.97±0.16)、(0.97±0.09)和(0.38±0.05)，與miR-NC組相比較，miR-542-3p組Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低，Caspase3蛋白表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比較，anti-miR-542-3p組Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高，Caspase3蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見圖4。

1～4:miR-NC組、miR-542-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-542-3p組圖4 miR-542-3p對凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤是一種局部破壞性和高度侵襲性的成熟淋巴樣腫瘤，該病起病隱匿，許多患者在確診時就已經(jīng)累及多個淋巴結(jié)區(qū)，侵犯多個臟器〔5〕。因此尋找鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤診斷和治療的生物標(biāo)記物，對改善患者預(yù)后是具有重要作用的。

miRNA主要通過與mRNA的3′-URT相互作用，抑制其翻譯或誘導(dǎo)其降解，是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子〔6〕。miRNA在多種癌癥中表達(dá)異常，可以作為癌癥診斷、治療和預(yù)后評估的工具〔7〕。miR-542-3p作為miRNA家族中的一員，作為抑癌基因參與多種腫瘤進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)miR-542-3p在肝細(xì)胞癌中顯著下調(diào)，且與肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及不良預(yù)后有關(guān)，可作為肝細(xì)胞癌診斷及評估的潛在生物標(biāo)志物〔8〕。miR-542-3p在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)下調(diào)，且過表達(dá)miR-542-3p能誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡并抑制其增殖〔9〕。在乳腺癌中，miR-542-3p表達(dá)下調(diào)，miR-542-3p通過與S1PR1的結(jié)合能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力〔10〕。本研究提示miR-542-3p可能與鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤侵襲程度相關(guān)。進(jìn)一步，細(xì)胞實驗證實過表達(dá)miR-542-3p可抑制鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上，miR-542-3p在鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤顯著降低，且與患者臨床分期密切相關(guān)，另外miR-542-3p可抑制細(xì)胞增殖、侵襲能力并促進(jìn)凋亡。本研究提示miR-542-3p可能是鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者診斷和治療的新靶點。然而，本研究仍存在以下不足：首先，僅在細(xì)胞水平證實miR-542-3p在鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中的作用；其次，未識別miR-542-3p在鼻型結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中的作用機制。今后將開展小鼠實驗進(jìn)一步證實本研究結(jié)論并識別miR-542-3p的下游靶基因。