李云琴 王毅 原曉龍 楊文忠

(云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(云南省林業(yè)和草原科學(xué)院)，昆明，650201)

食用菌是一類(lèi)營(yíng)養(yǎng)豐富、可供人們食用的大型真菌的總稱(chēng)，菌根食用菌是外生菌根真菌中具有食用價(jià)值的大型真菌的統(tǒng)稱(chēng)[1]。食用菌富含糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素，營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美、質(zhì)地脆嫩，正在發(fā)展成為動(dòng)物、植物性食物之外的第3類(lèi)食物[2]，備受人們的青睞；除了良好的營(yíng)養(yǎng)特性，真菌還具有多樣化的生理活性功能，其子實(shí)體，菌絲體和發(fā)酵液中均富含酚酸、萜類(lèi)、多糖、維生素類(lèi)、嘌呤類(lèi)和有機(jī)酸等多種活性物質(zhì)[3]，能抗氧化、抗腫瘤、抗菌和抗炎等。真菌含有結(jié)構(gòu)類(lèi)型豐富和生理活性多樣的次生代謝產(chǎn)物，為現(xiàn)代藥物獲取和保健食品、化妝品等的開(kāi)發(fā)提供了重要的新資源[4-5]。

萜類(lèi)化合物是天然產(chǎn)物中的最大家族，廣泛存在于真菌中[4]。目前報(bào)道的從真菌中分離得到的萜類(lèi)化合物種類(lèi)眾多，有單萜、倍半萜、二萜和三萜類(lèi)化合物，萜類(lèi)化合物以其豐富的生物活性，成為有機(jī)化學(xué)、藥物化學(xué)、生物學(xué)等多個(gè)學(xué)科和醫(yī)藥、香料、食品、農(nóng)業(yè)等多種產(chǎn)業(yè)極其重要的天然產(chǎn)物研究對(duì)象[4]。萜類(lèi)化合物的通用結(jié)構(gòu)單元是C5前體異戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。DMAPP與1個(gè)或多個(gè)IPP連續(xù)縮合產(chǎn)生各種鏈長(zhǎng)的線(xiàn)性二磷酸異戊烯化合物：香葉基二磷酸(C10，GPP)，法呢基焦磷酸(C15，F(xiàn)PP)，香葉基香葉基二磷酸(C20，GGPP)，這些前驅(qū)體由萜類(lèi)合成酶(TPS)催化生成單萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)，以及其他化合物[6]。因此，TPS被認(rèn)為是萜類(lèi)化合物生物合成的關(guān)鍵酶，由于其數(shù)量龐大，種類(lèi)繁多，構(gòu)成了TPS基因家族，萜類(lèi)合成酶種類(lèi)和功能也決定了萜類(lèi)化合物的多樣性，因而萜類(lèi)合成酶成了萜類(lèi)生物合成過(guò)程中研究最多和最深入的酶類(lèi)[7]。

紅汁乳菇(Lactariushatsudake)為擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)傘菌目(Agaricales)紅菇科(Russulaceae)乳菇屬(Lactarius)的菌根食用菌，在我國(guó)廣泛分布[8]。紅汁乳菇菌肉肥厚、味道鮮美、風(fēng)味獨(dú)特，富含氨基酸、礦物質(zhì)和維生素等人體所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，深受大眾喜愛(ài)[9]。不僅如此，紅汁乳菇還具有很好藥用功效，有研究表明其提取物對(duì)小白鼠肉瘤180和艾氏癌的抑制率分別達(dá)到100%和90%[10]；其乙醚和乙酸乙酯的提取物對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、啤酒酵母和枯草芽孢桿菌有抗菌作用[11]；多糖體對(duì)腫瘤有較高的抑制率[9]。另外，紅汁乳菇還可用于生產(chǎn)橡膠、營(yíng)林[9]等，開(kāi)發(fā)利用前景廣闊。但是目前為止，未見(jiàn)關(guān)于紅汁乳菇萜類(lèi)活性成分及TPS基因的報(bào)道，本研究從紅汁乳菇基因組中分離出TPS基因，通過(guò)生物信息學(xué)及基因功能分析，以及在不同碳氮源培養(yǎng)基上的相對(duì)表達(dá)量的分析，基因簇分析等，為后續(xù)對(duì)紅汁乳菇中萜類(lèi)活性物質(zhì)的研究和開(kāi)發(fā)提供一些思路與參考，也為了產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)紅汁乳菇資源提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

從云南省宜良縣采集大小適中且完好的紅汁乳菇新鮮子實(shí)體帶回實(shí)驗(yàn)室編號(hào)，并用75%酒精消毒，用食用菌組織分離法在無(wú)菌條件下切碎子實(shí)體后接種在MY(malt yeast extract,BD)斜面培養(yǎng)基上，避光28 ℃培養(yǎng)15 d，將菌落直徑為1 cm左右無(wú)污染的菌絲轉(zhuǎn)接到新的MY平板培養(yǎng)基上。經(jīng)過(guò)ITS鑒定為紅汁乳菇(Lactariushatsudake)，菌株號(hào)：YAF0304。

1.2 培養(yǎng)基

不同碳源培養(yǎng)基的配制，以3.0 g·L-1的酵母提取物和6.0 g·L-1的麥芽浸粉為基礎(chǔ)，分別添加10.0和2.0 g·L-12種質(zhì)量濃度的山梨醇、肌醇、甘露糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉；不同氮源培養(yǎng)基的配制，以6.0 g·L-1的葡萄糖和1.8 g·L-1的麥芽糖為基礎(chǔ)，分別添加6.0 g·L-1的馬鈴薯浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉浸粉和番茄浸粉；均在28 ℃條件下固體培養(yǎng)，檢測(cè)紅汁乳菇萜類(lèi)合成酶基因的表達(dá)情況。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

將菌絲接種于上述培養(yǎng)基，28 ℃固體培養(yǎng)30 d后，菌絲體分裝為小份樣品(每份菌絲量50 mg)，在液氮中粉碎，參照康為世紀(jì)的RNA提取試劑盒提取總RNA，使用微量分光光度計(jì)Thermo NanoDrop 2000和1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度以及完整性。參照北京全式金生物公司的試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。

1.4 紅汁乳菇全基因組中TPS基因的搜索與預(yù)測(cè)

我們以牛樟芝中的TPS為模板，采用本地BLAST在線(xiàn)軟件對(duì)紅汁乳菇的基因組進(jìn)行比對(duì)分析，獲得候選基因序列后，并將候選基因序列與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行確定。

1.5 蛋白理化性質(zhì)分析

用ExPASy protparam tool、NetPhos 3.1 service、DictyOGlyc 1.1 service、signaIP-5.0、Euk-mPLoc 2.0 server、Prabi在線(xiàn)軟件(NPS@:SOPMA secondary structure prediction)分別分析蛋白理化性質(zhì)、氨基酸序列磷酸化修飾情況、O-糖基化修飾情況、蛋白的信號(hào)肽，蛋白亞細(xì)胞定位，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.6 TPS蛋白序列多重比對(duì)、保守元件、進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將TPS蛋白序列導(dǎo)入到DNAMAN中，進(jìn)行多重序列比對(duì)，利用MEME(http://meme.nbcr.net/meme/tools/meme)對(duì)TPS蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；將LhTPS蛋白序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇同源性較高的蛋白，再根據(jù)參考文獻(xiàn)選擇一些有功能性的真菌TPS蛋白，將這些蛋白放在利MEGA 6.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.7 基因表達(dá)分析

使用DNAMAN在線(xiàn)程序primer設(shè)計(jì)紅汁乳菇TPS檢測(cè)引物，并由上海生工合成引物。以不同培養(yǎng)條件的紅汁乳菇cDNA作為模板，并以紅汁乳菇TPS檢測(cè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)以?xún)?nèi)參Tubulin引物作為對(duì)照。結(jié)束后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。利用Azure Biosystems成像系統(tǒng)軟件，將圖像信息轉(zhuǎn)化為基因表達(dá)量數(shù)據(jù)，以此數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用在線(xiàn)程序派森諾基因云(https://www.genescloud.cn/chart/)將相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)做成熱圖。

1.8 基因簇分析

使用在線(xiàn)程序antiSMASH(https://fungismash.secondarymetabolites.org)對(duì)16個(gè)紅汁乳菇TPS基因所在重疊群(contig)進(jìn)行基因簇預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅汁乳菇中萜類(lèi)合成酶蛋白的預(yù)測(cè)

利用本地BLAST對(duì)紅汁乳菇基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比對(duì)，最終預(yù)測(cè)出16個(gè)LhTPS基因，分別命名為：LhTPS1、LhTPS2、LhTPS3、LhTPS4、LhTPS5、LhTPS6、LhTPS7、LhTPS8、LhTPS9、LhTPS10、LhTPS11、LhTPS12、LhTPS13、LhTPS14、LhTPS15、LhTPS16。

2.2 蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析(表1)結(jié)果表明除了紅汁乳菇LhTPS4的理論等點(diǎn)大于7外，其他15個(gè)蛋白的理論等電點(diǎn)均小于7，說(shuō)明其蛋白質(zhì)分子中富含酸性氨基酸且酸性氨基酸數(shù)量多于堿性氨基酸；除LhTPS1、LhTPS2、LhTPS5、LhTPS9蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)小于40外，其余11個(gè)蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，說(shuō)明紅汁乳菇LhTPS大多數(shù)為不穩(wěn)定蛋白。氨基酸親水性分析預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，16個(gè)紅汁乳菇LhTPS的親水性平均系數(shù)(GRAVY)均為負(fù)值，表明均為親水性蛋白。磷酸與糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果顯示LhTPS蛋白均具有酸磷酸化位點(diǎn)，然而16個(gè)蛋白的糖基化位點(diǎn)數(shù)均較少甚至沒(méi)有。

信號(hào)肽預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，所有蛋白序列均無(wú)N-端信號(hào)肽存在。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，16個(gè)紅汁乳L(zhǎng)hTPS中有10個(gè)LhTPS定位于細(xì)胞質(zhì)。

表1 紅汁乳菇TPS蛋白理化性質(zhì)分析

2.3 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、β折疊、延伸鏈等一系列多肽鏈本身的折疊盤(pán)繞方式。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(表1)，LhTPS二級(jí)結(jié)構(gòu)包含了α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、β折疊、延伸鏈。除了LhTPS4以無(wú)規(guī)則卷曲占比最大外，其余15個(gè)蛋白均以α螺旋占比最大，β折疊、延伸鏈占比均較小。

2.4 蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域比對(duì)

利用MEME對(duì)紅汁乳菇16個(gè)LhTPS蛋白進(jìn)行保守元件分析(圖1a)。motif2和motif4為紅汁乳菇LhTPS蛋白最顯著的保守結(jié)構(gòu)域：DXXD基序和NSE結(jié)構(gòu)域。LhTPS10蛋白只含有motif3；LhTPS13和LhTPS14包含3個(gè)motif，不包含motif4，僅具有萜烯合酶保守的DXXD基序；其余的蛋白均含有4個(gè)motif，均具有DXXD基序和NSE結(jié)構(gòu)域。DNAMAN比對(duì)分析(圖1b)也發(fā)現(xiàn)，LhTPS10、LhTPS13、LhTPS14僅具有萜烯合酶的DXXD保守結(jié)構(gòu)域，其余的蛋白均具有DXXD和NSE保守結(jié)構(gòu)域。因此可以把16個(gè)萜類(lèi)合成酶分成兩類(lèi)，LhTPS10、LhTPS13、LhTPS14為一類(lèi)，其余13個(gè)蛋白分為一類(lèi)。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建分析

通過(guò)文獻(xiàn)收集和BLAST在線(xiàn)軟件同源比對(duì)，獲得了一些植物及真菌的萜類(lèi)合成酶基因的蛋白序列，在MEGA6.0軟件上與16個(gè)紅汁乳菇LhTPS蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。結(jié)果顯示，16個(gè)LhTPS可分為4個(gè)大分支，其中LhTPS6、LhTPS8、LhTPS11、LhTPS16、LhTPS7為第Ⅰ分支；LhTPS4、LhTPS2、LhTPS12、LhTPS3、LhTPS5、LhTPS15為第Ⅱ分支；LhTPS14、LhTPS10、LhTPS13為第Ⅲ分支；LhTPS1和LhTPS9為第Ⅳ分支。按已有文獻(xiàn)分析，第Ⅰ、Ⅱ分支為倍半萜合成酶，第Ⅲ分支為倍半萜及二萜合成酶，第Ⅳ分支為倍半萜和三萜合成酶。第Ⅰ分支中LhTPS6、LhTPS8、LhTPS11、LhTPS16與發(fā)光類(lèi)臍菇(OmphalotusoleariusMUStwsD_GLEAN_10000831，Δ-6 protoilludene)[12]和高盧蜜環(huán)菌(ArmillariagallicaP0DL13.1，Δ-6 protoilludene)[13]的倍半萜合酶聚在一起，由此推測(cè)LhTPS6、LhTPS8、LhTPS11、LhTPS16主要生成Δ-6 protoilludene的相似物或者衍生物；LhTPS7與發(fā)光類(lèi)臍菇(OmphalotusoleariusMUStwsD_GLEAN_10000810/MUStwsD_GLEAN_10000811，γ-cadinene)[12]聚在一起，由此推測(cè)LhTPS7主要生成γ-cadinene的相似物或者衍生物。第Ⅱ分支中的LhTPS4、LhTPS2、LhTPS12、LhTPS3、LhTPS5、LhTPS15與虎乳靈芝(LignosusrhinocerusKX281944/ASK39768，δ-cadinol)[14]、發(fā)光類(lèi)臍菇(OmphalotusoleariusMUStwsD_GLEAN_10001317，α-muurolene)[12]、牛樟芝(AntrodiacinnamomeaEIW57365，1-epi-cubenol)[15]的倍半萜合成酶聚在一起，由此初步推測(cè)第Ⅱ分支的紅汁乳菇LhTPS主要生成δ-cadinol、α-muurolene、1-epi-cubenol的相似物或者衍生物。LhTPS14、LhTPS10、LhTPS13聚為第Ⅲ分支，與保守基序分析結(jié)果一樣。LhTPS14與巨冷杉(AbiesgrandisAAC05728，γ-Humulene synthase)[16]聚在一起，初步推測(cè)LhTPS14為二萜合成酶γ-Humulene synthase；LhTPS10與毛韌革菌(StereumhirsutumXP_007299839，δ-cadinene)[17]倍半萜合成酶聚在一起，且可信度較高，由此推測(cè)LhTPS10為倍半萜合成酶，且主要生成δ-cadinene的類(lèi)似物或者衍生物；LhTPS13與牛樟芝(AntrodiacinnamomeaEIW53985，nerolidol)[15]的倍半萜合成酶聚集在一起。第Ⅳ分支的可信度偏低，LhTPS1與灰蓋鬼傘(CoprinuscinereusXP_001836556，germacrene A)[18]的倍半萜合成酶聚在一起，LhTPS9與香菇(LentinulaedodesGAW09328)的三萜鯊烯合酶squalene synthase聚為一起。

圖1 LhTPS蛋白基序分析和保守結(jié)構(gòu)域多重序列比對(duì)

圖2 紅汁乳菇LhTPS蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.6 不同培養(yǎng)條件下紅汁乳菇LhTPS表達(dá)驗(yàn)證及分析

紅汁乳菇16個(gè)LhTPS基因中，有些基因較小，因此沒(méi)有做不同碳氮源情況的表達(dá)分析，僅對(duì)10個(gè)基因(LhTPS2、LhTPS3、LhTPS4、LhTPS5、LhTPS6、LhTPS7、LhTPS8、LhTPS12、LhTPS15、LhTPS16)進(jìn)行分析，并制作成表達(dá)熱圖(圖3)，其結(jié)果顯示10個(gè)LhTPS基因在不同碳氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下均有表達(dá)，總體情況來(lái)看，紅汁乳菇10個(gè)LhTPS基因分別依次在2.0 g·L-1山梨醇培養(yǎng)基、10.0 g·L-1肌醇培養(yǎng)基、番茄浸粉培養(yǎng)基、牛肉浸粉培養(yǎng)基、番茄浸粉培養(yǎng)基、胰蛋白胨培養(yǎng)基、番茄浸粉培養(yǎng)基、番茄浸粉培養(yǎng)基、10.0 g·L-1山梨醇培養(yǎng)基、番茄浸粉培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲體中表達(dá)量最高；不同氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的表達(dá)情況整體上要優(yōu)于不同碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的表達(dá)情況。在不同碳源及不同質(zhì)量濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，紅汁乳菇10個(gè)LhTPS基因分別在2.0 g·L-1山梨醇、10.0 g·L-1肌醇、10.0 g·L-1山梨醇、2.0 g·L-1山梨醇、10.0 g·L-1肌醇、10.0 g·L-1麥芽糖、10.0 g·L-1山梨醇、2.0 g·L-1甘露醇、10.0 g·L-1山梨醇、10.0 g·L-1山梨醇培養(yǎng)基上表達(dá)量最高；因此，在不同碳源及質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中，以10.0 g·L-1山梨醇培養(yǎng)基為最優(yōu)，然后依次是10.0 g·L-1肌醇培養(yǎng)基，2.0 g·L-1山梨醇培養(yǎng)基。在不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，紅汁乳菇10個(gè)LhTPS基因分別在番茄浸粉、番茄浸粉、番茄浸粉、番茄浸粉、牛肉浸粉、胰蛋白胨、番茄浸粉、番茄浸粉、番茄浸粉、番茄浸粉培養(yǎng)基中表達(dá)量最高；因此，在不同氮源培養(yǎng)基中以番茄培養(yǎng)基為最優(yōu)培養(yǎng)基。

mal-1為2.0 g·L-1麥芽糖；mal-2為10.0 g·L-1麥芽糖；man-1為2.0 g·L-1甘露醇；man-2為10.0 g·L-1甘露醇；fru-1為2.0 g·L-1果糖；fru-2為10.0 g·L-1果糖；suc-1為2.0 g·L-1蔗糖；suc-2為10.0 g·L-1蔗糖；sor-1為2.0 g·L-1山梨醇；sor-2為10.0 g·L-1山梨醇；glu-1為2.0 g·L-1葡萄糖；glu-2為10.0 g·L-1葡萄糖；ino-1為2.0 g·L-1肌醇；ino-2為10.0 g·L-1肌醇；sta-1為2.0 g·L-1可溶性淀粉；sta-2為10.0 g·L-1可溶性淀粉；S為大豆蛋白胨；P為馬鈴薯浸粉；B為牛肉浸粉；T1為胰蛋白胨；T為番茄浸粉。

2.7 基因簇預(yù)測(cè)分析

對(duì)16個(gè)紅汁乳菇LhTPS蛋白編碼基因所在重疊群進(jìn)行基因簇分析后發(fā)現(xiàn)，LhTPS2、LhTPS3、LhTPS6、LhTPS8、LhTPS9、LhTPS10、LhTPS15編碼基因所在重疊群有基因簇的存在。其中，LhTPS9、LhTPS15的編碼基因所在重疊群有細(xì)胞色素P450氧化還原酶基因存在，可能為T(mén)PS與P450組成的基因簇(圖4)。

圖4 5個(gè)紅汁乳菇TPS基因簇預(yù)測(cè)

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)代藥學(xué)對(duì)于新化合物的需求不斷增加，而微生物資源的開(kāi)發(fā)與利用為藥物研發(fā)帶來(lái)了新的機(jī)遇，從微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中獲得天然產(chǎn)物是新的前體化合物的重要來(lái)源[19]。研究發(fā)現(xiàn)具有新的結(jié)構(gòu)與活性的次生代謝產(chǎn)物超過(guò)50%來(lái)源于真菌[20]，因此深度挖掘真菌中天然活性化合物對(duì)藥物研發(fā)具有重要的意義。

紅汁乳菇不僅是人們最喜歡的野生食用菌之一，它還具有多種活性成分，開(kāi)發(fā)利用前景廣闊，但是目前，對(duì)紅汁乳菇TPS基因的分析研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究從紅汁乳菇全基因組中分離獲得16個(gè)萜類(lèi)合成酶基因，基序分析將16個(gè)LhTPS分成兩類(lèi)，僅有DXXD基序的分為一類(lèi)，有DXXD基序和NSE結(jié)構(gòu)域歸為另一類(lèi)；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建將16個(gè)LhTPS分為4個(gè)大分支，僅有DXXD基序的聚集為一個(gè)分支。推測(cè)第Ⅰ、Ⅱ分支為倍半萜合成酶，第Ⅲ分支為倍半萜及二萜合成酶，第Ⅳ分支為倍半萜和三萜合成酶。其中第Ⅰ分支中的LhTPS6、LhTPS8、LhTPS11、LhTPS16主要生成Δ-6 protoilludene的相似物或者衍生物，LhTPS7主要生成γ-cadinene的相似物或者衍生物；第Ⅲ分支中的LhTPS10為倍半萜合成酶，且主要生成δ-cadinene的類(lèi)似物或者衍生物。

真菌基因組蘊(yùn)含著大量次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇[20-21]，大部分基因簇在常規(guī)的培養(yǎng)條件下是“沉默”的，在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，只有10%～20%次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇能從其發(fā)酵粗提物中檢測(cè)到相應(yīng)的產(chǎn)物[22]，說(shuō)明還有大量結(jié)構(gòu)新穎的潛在活性化合物未從“沉默”基因簇中鑒定出來(lái)[22]。因此，挖掘真菌的潛在新化合物正成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究者使用Helge等提出的單菌多產(chǎn)物(One Strain-Many Compounds,OSMAC)策略[23]，從真菌中分離鑒定了一系列結(jié)構(gòu)新穎、具有多種活性的化合物，通過(guò)培養(yǎng)基篩選，從毛韌革菌(Stereumhirsutum)發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了4個(gè)倍半萜，還有氨基酸雜合的季銨鹽Stereumamides A-D，具有一定的抗菌活性[24]；通過(guò)改變培養(yǎng)水，使用自來(lái)水和蒸餾水培養(yǎng)植物伴生真菌Paraphaeosphaeriaquadriseptata，主代謝產(chǎn)物發(fā)生了變化，得到的其中2個(gè)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞株NCI-H460，MCF-7和SF-268有較為顯著的細(xì)胞毒活性[25]；通過(guò)海洋真菌Libertellasp．與細(xì)菌α-proteobacterium聯(lián)合培養(yǎng)，得到了分別培養(yǎng)所沒(méi)有得到的化合物對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性[26]。本研究通過(guò)僅改變碳源添加物及質(zhì)量濃度和氮源添加物來(lái)探究不同培養(yǎng)基對(duì)紅汁乳菇萜類(lèi)合成酶基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示在加有不同氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的表達(dá)情況整體上要優(yōu)于不同碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的表達(dá)情況，且以10.0 g·L-1山梨醇、10.0 g·L-1肌醇為碳源的培養(yǎng)基和番茄浸粉為氮源的培養(yǎng)基上表達(dá)量相對(duì)較高，與原曉龍等[27]研究紅汁乳菇Lhpks1基因表達(dá)情況一致。對(duì)紅汁乳菇LhTPS基因簇分析發(fā)現(xiàn)LhTPS2、LhTPS3、LhTPS6、LhTPS8、LhTPS9、LhTPS10、LhTPS15編碼基因所在重疊群有基因簇的存在，但僅LhTPS6、LhTPS8、LhTPS10初步推斷出其功能，后續(xù)研究可以在對(duì)推測(cè)出的功能基因和基因簇進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)OSMAC策略以及一些激活沉默基因和基因簇的方法如強(qiáng)啟動(dòng)子替換[28]、基因的過(guò)表達(dá)、異源表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、重構(gòu)生物合成基因簇[24-25]等等來(lái)刺激不同的基因或基因簇，以得到目標(biāo)化合物或獲取一些新的活性物質(zhì)，以此挖掘紅汁乳菇中可能蘊(yùn)藏的潛在化合物。

真菌次生代謝產(chǎn)物合成途徑中往往包括多樣化的氧化過(guò)程，細(xì)胞色素P450能夠催化不同類(lèi)型的氧化反應(yīng)而參與到真菌次生代謝產(chǎn)物的合成途徑中[29]，參與次生代謝產(chǎn)物合成途徑的細(xì)胞色素P450往往會(huì)出現(xiàn)在次生代謝產(chǎn)物合成酶基因簇區(qū)域[30]?；虼胤治霭l(fā)現(xiàn)LhTPS9、LhTPS15的編碼基因所在重疊群有細(xì)胞色素P450氧化還原酶基因存在。下一步研究可開(kāi)展對(duì)于紅汁乳菇中與活性天然產(chǎn)物相關(guān)的細(xì)胞色素P450的氧化途徑、結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步揭示與闡明。

本研究為紅汁乳菇潛在次生代謝產(chǎn)物合成基因的挖掘和深度研究紅汁乳菇中天然活性化合物奠定基礎(chǔ)。