張月欣 李鋼鐵 李俊杰 胡博

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),呼和浩特，010000)

榆樹(UlmuspumilaL.)為榆科屬落葉喬木，又名榆、春榆、白榆、家榆、榆錢等，分布于中國、朝鮮、蘇聯(lián)、蒙古等地[1]。榆樹是我國科爾沁沙地主要建群種，其因根系發(fā)達(dá)、枝葉繁茂、壽命長、具有耐貧瘠、耐寒抗旱、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)，是干旱半干旱沙區(qū)造林的理想樹種[2]。沙地榆樹疏林是科爾沁沙地天然沙生植物的頂級群落[3]，也被認(rèn)為是最穩(wěn)定的植被類型，不僅在保護(hù)環(huán)境、涵養(yǎng)水源、防風(fēng)固沙等方面發(fā)揮著重要的作用，同時具有很強(qiáng)的適應(yīng)性、穩(wěn)定性、抗干旱能力和恢復(fù)能力[4]。

叢枝菌根真菌(AM)是一類能與陸地80%的植物形成互惠共生體的微生物[5]，在自然界中分布極其廣泛。AM真菌侵染植物后形成的菌絲大大地增加了植物根系與土壤的接觸面積，能夠極大地促進(jìn)植物對氮、磷、鉀等養(yǎng)分的吸收，提高植物抗逆性，改善植物品質(zhì)[6-7]。張可可等[8]研究表明，科爾沁沙地榆樹接種菌根菌劑能夠有效提高菌根侵染率、株高、生物量、有機(jī)質(zhì)和全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。麻云霞[9]研究表明渾善達(dá)克沙地榆孢子密度與pH呈顯著正相關(guān)，菌根侵染率和全氮、硝酸還原酶呈正相關(guān)和pH、物種豐富度呈負(fù)相關(guān)。同時，郭紹霞等[10]認(rèn)為，AM真菌群落會受到土壤類型、水分狀況、坡向等因素影響，AM真菌受土壤理化性質(zhì)和植被類型的影響，同時具有時間和空間的異質(zhì)性。由于植物不同生長階段對土壤養(yǎng)分及環(huán)境狀況不同，本試驗(yàn)以科爾沁沙地10、25、40 a榆樹林為研究對象，分析不同樹齡榆樹的孢子密度、菌根侵染率及土壤理化性質(zhì)，以揭示不同樹齡榆樹土壤理化性質(zhì)與菌根侵染率、孢子密度之間的關(guān)系。

1 研究區(qū)概況

采樣地點(diǎn)位于赤峰市翁牛特旗(42°26′～43°25′N，117°49′～120°43′E)，平均海拔695 m。屬于典型的中溫帶大陸性氣候，天氣多變，冷暖無常，日溫差大，有明顯的四季之分，年平均氣溫6.4 ℃，年平均降水量為370 mm，夏季降水量占全年降水量的75%。年日照時間為2 850～3 000 h。無霜期90～140 d。土壤類型主要為栗鈣土和風(fēng)沙土。

2 材料與方法

本試驗(yàn)選取不同樹齡(10、25和40 a)的沙地榆林為試驗(yàn)樣地，樣地土壤類型、立地條件一致，采樣時間為2020年8月(植物生長旺盛時期)。每個采樣地按樹齡設(shè)置3塊樣方(20 m×20 m)，每個樣方隨機(jī)選取生長健壯的15棵植株，3個樣地總計45株(每棵植株之間相距10 m以上)，每棵植株按照東西南北4個方位各取一份土樣(各50 g)，將這4份(共200 g)土樣混勻，以消除植株根際土壤的差異。取樣時除去土壤和表層動植物殘體后,同時采集植株與適量根部土壤，盡量保證根環(huán)境的穩(wěn)定，在5～30 cm深處采集帶有細(xì)根的根系，將樣品編號裝入自封袋。采集的根樣和土樣立即放到冰箱4 ℃保存，帶回實(shí)驗(yàn)室。土樣過2 mm篩，除去動物殘體和石塊等雜物。將過篩后的土樣放在冰箱-20 ℃保存，用于土壤理化性質(zhì)的測定。

2.1 土壤理化性質(zhì)的測定

土壤的pH采用電位法測定[11]；速效磷(AP)采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定[12]；速效鉀(AK)采用NH4OAC浸提-火焰光度法測定[13]；速效氮用堿解擴(kuò)散法[14]；有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀氧化法測定[15]。

2.2 菌根侵染率的測定

取出固定液中的根系，用蒸餾水清洗多次，切成1 cm左右長的根段；然后將根段置于5% KOH溶液中，90 ℃水浴加熱脫色60 min；脫色后用蒸餾水沖洗數(shù)次再用堿性H2O2軟化20 min(根據(jù)根的軟硬程度調(diào)整軟化時間)，直至根樣軟化為止；軟化后置于1% HCI溶液中酸化10 min；然后置于用0.12%的臺盼藍(lán)染液(250 mL乳酸，250 mL甘油，500 mL水，1.2 mg臺盼藍(lán))于水浴鍋中90 ℃染色30 min，最后置于乳酸-甘油(V(乳酸)∶V(甘油)=1∶1)溶液中脫色。脫好色的根段置于載玻片上壓片，用網(wǎng)格十字交叉法[16]在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)，按下面的公式計算菌根侵染率。

2.3 AM真菌孢子的分離

采用濕篩傾析-蔗糖離心法[17-18]從土壤樣品中盡可能的分離孢子，具體操作如下：

(1)將干凈的孔徑(0.880、0.250、0.055 mm的土壤篩子)疊放在一起，孔徑由下往上逐漸變大；

(2)稱取100 g風(fēng)干土樣放入大燒杯中浸泡30 min，用玻璃棒充分?jǐn)嚢枋雇寥浪缮ⅲ?/p>

(3)用干凈的玻璃棒攪拌后，充分混勻后靜置30 s；

(4)將上清液反復(fù)沖洗燒杯中的土樣，直到上清液變?yōu)榍宄海?/p>

(5)逐層沖洗篩子，收集底層上篩子的雜物到離心機(jī)管中，2 000 r/min離心3 min；

(6)取出，倒掉上清液，加入50%的蔗糖溶液，2 000 r/min離心3 mim；

(7)取出，將上清液再倒入干凈的0.055 mm土壤篩，用自來水沖洗2～3遍；

(8)將洗凈的孢子及雜物沖到培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下用解剖針將孢子集中，然后用吸管把孢子吸取收集。

2.4 AM真菌形態(tài)鑒定

將濕篩傾析法得到的孢子或孢子果制片后，在體式顯微鏡下觀察孢子的形態(tài)、大小、顏色、孢子的聚集方式、壁的結(jié)構(gòu)等特征，并且參考Schenck et al.[19]的《VA菌根真菌鑒定手冊》和國際叢枝菌根真菌保藏中心(INVAM)國際網(wǎng)站(http：//invam.wvu.edu./the-fungi/species-descriptions)在Internet上提供的種的描述及照片，同時參閱近年來發(fā)表的文獻(xiàn)資料進(jìn)行AM真菌種類的鑒定。

2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2019和SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析；利用雙尾檢驗(yàn)的Pearson相關(guān)分析法分析各個土壤養(yǎng)分因子與AM菌根侵染率、孢子密度之間的關(guān)系。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤養(yǎng)分變化情況

分析不同樹齡根系土壤理化性質(zhì)結(jié)果表明：隨著樹齡的增加，酸性增強(qiáng)，pH在7.25～6.03；土壤速效P和速效N質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨樹齡增加，先減少后增加。土壤速效鉀和有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨樹齡增加呈增加趨勢。

3.2 菌根侵染率與孢子密度變化情況

分析不同樹齡菌根侵染率發(fā)現(xiàn)，菌根侵染率隨著樹齡的增加呈現(xiàn)增長的趨勢，10、25、40 a的菌根侵染率分別為35.28%、42.19%、55.67%。分析不同樹齡孢子密度發(fā)現(xiàn)，隨著樹齡的增加，孢子密度不斷增大，10、25、40 a沙地榆孢子密度分別為每100 g中有135、152和160個。

3.3 AM真菌種類鑒定及描述

從3個林齡沙地榆根圍共分離出AM真菌4屬30種(圖1)，其中球囊霉屬(Glomus)17種，占總數(shù)的56.67%，無梗囊霉屬(Acaulospora)9種，占總數(shù)的30%，盾巨孢囊霉屬(Scutellospora)3種，占總數(shù)的10%，原囊霉屬(Archaeospora)1種，占總數(shù)的3.33%。球囊霉屬(Glomus)和無梗囊霉屬(Acaulospora)為優(yōu)勢屬。

1.黑球囊霉(G. melanosporum)；2.摩西球囊霉(G. mosseae)；3.沙荒球囊霉(G. deserticola)；4.縮球囊霉(G. constrictum)；5.層狀球囊霉(G. lamellosum)；6.地表球囊霉(G. versiforme)；7.網(wǎng)狀球囊霉(G. reticulatum)；8.根內(nèi)球囊霉(G. intaradices)；9.地球囊霉(G. geosporum)；10.純黃球囊霉(G. luteum)；11.膨果球囊霉(G. pansihalos)；12.長孢球囊霉(G. dolihosporum)；13.凹坑球囊霉(G. multiforum)；14.近明球囊霉(G. claroideum)；15.暈環(huán)球囊霉(G. halonatum)；16.副冠球囊霉(G. coronatum)；17.蔭形球囊霉(G. tenebrisum)；18.蜜色無梗囊霉(A. mellea)；19.細(xì)凹無梗囊霉(A. scrobiculata)；20.麗孢無梗囊霉(A. elegans)；21.孔窩無梗囊霉(A. foveata)；22.雙網(wǎng)無梗囊霉(A. bireticulata)；23.光壁無梗囊霉(A. laevis)；24.瑞士無梗囊霉(A. rehmii)；25.凹坑無梗囊霉(A. excavate)；26.椒紅無梗囊霉(A. capsicular)；27.網(wǎng)紋盾巨孢囊霉(S. reticulata)；28.黑色盾巨孢囊霉(S. nigra)；29.紅色盾巨孢囊霉(S. erythropa)；30.薄壁原囊霉(A. leptoticha)。

1.球囊霉屬(Glomus)

(1)黑球囊霉(Glomus.melanosporum)

孢子表面常附著不勻的薄壁菌絲，黑棕色至黑紅棕色，球形至近球形，卵形或橢圓形，大小為165～250 μm。

(2)摩西球囊霉(Glomus.mosseae)

孢壁2層，連孢菌絲單根，在連點(diǎn)處朝連點(diǎn)擴(kuò)張呈漏斗形，孢子內(nèi)含物為大小不等的油滴或顆粒，淡黃色至黃棕色深紅棕色，圓形、近圓形，大小為100～200 μm。

(3)沙荒球囊霉(Glomus.deserticola)

孢子壁單層，成熟孢子連點(diǎn)處直徑5～11 μm，稍呈漏斗狀，淡紅棕色至深棕色，球形、近球形，大小為90～110 μm。

(4)縮球囊霉(Glomus.constrictum)

連孢菌絲柱狀或稍呈漏斗狀，通常在連點(diǎn)處驟然彎曲縊縮，孢子內(nèi)含物為大小不等的油滴和顆粒，深黃棕色至深紅棕或黑色，球形至橢圓形，大小為(50～110)μm×(50～120)μm。

(5)層狀球囊霉(Glomus.lamellosum)

孢子壁1層，連點(diǎn)處孢壁不增厚；連點(diǎn)縊縮，連孢菌絲常向一側(cè)彎曲，黃至黃棕色，圓、近圓或長圓，大小為130～180 μm。

(6)地表球囊霉(Glomus.versiforme)

孢壁3層，L3破裂后可見，呈亮金黃色，連孢菌絲成熟后脫落，連點(diǎn)直或小喇叭狀，黑棕紅色，球形至近球形，大小為100～240 μm。

(7)網(wǎng)狀球囊霉(Glomus.reticulatum)

孢子表面有較規(guī)則的網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)狀四邊形或多邊形，連孢菌絲直筒或微漏斗形，無色、淡黃色至淡黃棕色，球形、近球形或不規(guī)則形，大小為80～150 μm。

(8)根內(nèi)球囊霉(Glomus.intaradices)

孢壁3層，最外層L1無色透明，L2在孢子成熟后易被分解成顆粒狀或黏孢子，深棕色至黑色，球形至近球形，大小為70～135 μm。

(9)地球囊霉(Glomus.geosporum)

厚垣孢子于土壤中單生，連孢菌絲基部粗硬，可見一層壁，連孢菌絲單根，連絲基部不擴(kuò)張，淺黃色、深黃色至褐色，球形至近球形，大小為120～145 μm。

(10)純黃球囊霉(Glomus.luteum)

孢壁4層，都緊貼在一起，只有在幼小孢子里L(fēng)1和L2存在，否則通常貼在一起，黃色、黃棕色至黑橘色，球形、近球形，大小為60～175 μm。

(11)膨果球囊霉(Glomus.pansihalos)

表面有灰白色薄壁菌絲，連孢菌絲單根，直或彎，連點(diǎn)開放或由L3封閉，L1在乳酸中膨脹，黃棕至紅棕色，球形或近球、橢球形，大小為110～190 μm。

(12)長孢球囊霉(Glomus.dolihosporum)

孢子長寬比1.00∶(0.41～0.66)或1.00∶0.77，連孢菌絲黃棕色，橢圓形、長橢圓形、卵形或矩形，大小為(110～220)μm×(65～110)μm。

(13)凹坑球囊霉(Glomus.multiforum)

孢壁2層，連孢菌絲單根，在連點(diǎn)處呈圓筒形或小喇叭形，孢子內(nèi)含物為顆粒狀和油滴，淡黃色至黃棕色，球形、近球形，大小為70～150 μm。

(14)近明球囊霉(G.claroideum)

厚垣孢子于土壤中單生，連孢菌絲圓柱狀或稍縮，黃色至黃紅色，球形至近球形，大小為125～175 μm。

(15)暈環(huán)球囊霉(Glomus.halonatum)

孢壁2層，L1易逝壁，L2為層狀壁，黃色或橙色，在Melzer’s試劑中呈深粉色，淺橙黃色至深紅黃色，球形或近球形，大小為100～220 μm。

(16)副冠球囊霉(Glomus.coronatum)

孢子于土壤內(nèi)單生，淺橙黃色到深紅色，在Melzer’s試劑中呈深粉色，球形至近球形，大小為100～220 μm。

(17)蔭形球囊霉(Glomus.tenebrisum)

孢子單生，圓形或近圓形，黃棕色至深棕色；孢壁2層，外層無色，薄；連孢菌絲1根，基部增厚。

2.無梗囊霉屬(Acaulospora)

(18)蜜色無梗囊霉(Acaulospora.mellea)

孢壁3層，L1透明易逝，L2淺黃色至橙棕色層狀壁，L3透明，淺橙色或橙黃色，圓形、橢圓形，大小為90～120 μm。

(19)細(xì)凹無梗囊霉(Acaulospora.scrobiculata)

表面有凹坑形紋飾，凹坑為圓形、長形或多角形，有時密集有時稀疏，布滿孢子表面，淡黃色至黃褐色，圓形、近圓形，大小為90～135 μm。

(20)麗孢無梗囊霉(Acaulospora.elegans)

孢壁2層，L1透明，L2層狀壁；突起上覆蓋有齒槽形網(wǎng)格紋飾，黃棕色，球形至近球形，大小為(140～280)μm×(145～330)μm。

(21)孔窩無梗囊霉(Acaulospora.foveata)

孢壁3層，孢子表面有雙層網(wǎng)紋，網(wǎng)孔呈多角形，孢子中含有透明的小油滴，球形至橢圓形，淺黃色至杏黃色，球形至橢圓形，大小為240～320 μm。

(22)雙網(wǎng)無梗囊霉(Acaulospora.bireticulata)

孢壁2層，L1透明，L2層狀壁；突起上覆蓋有齒槽形網(wǎng)格紋飾，淺褐色或褐色，球形至橢圓形，大小為(120～150)μm×(140～180)μm。

(23)光壁無梗囊霉(Acaulospora.laevis)

孢壁3層，L1透明光滑，L2淺黃色至暗黃棕色層狀璧，L3淺黃棕色，淺黃至黑紅棕色，球形，在Melzer’s試劑中特異性反應(yīng)不明顯。

(24)瑞士無梗囊霉(Acaulospora.rehmii)

孢子無柄，外表有迷宮似的紋飾。在Melzer’s試劑中呈紅色，淺黃棕色，球形、近球。

(25)凹坑無梗囊霉(Acaulospora.excavate)

表面有圓至近圓形大凹坑紋飾，有碎屑，球形或近球形，大小為100～195 μm。

(26)椒紅無梗囊霉(Acaulospora.capsicular)

球形至近球形，橘紅色至辣椒紅，大小為80～150 μm。

3.盾巨孢囊霉屬(Scutellaspora)

(27)網(wǎng)紋盾巨孢囊霉(Scutellaspora.reticulata)

L1有突起的四至八邊形的網(wǎng)格覆蓋，網(wǎng)格上有圓錐形的刺，橘紅色至黑紅色，圓形至近球形，大小為380～430 μm。

(28)黑色盾巨孢囊霉(Scutellaspora.nigra)

孢子表面上有內(nèi)陷小孔，且大小形狀不均勻，重疊在一起構(gòu)成環(huán)狀飾物，黑色或深棕色，近球形，大小為297～500 μm。

(29)紅色盾巨孢囊霉(Scutellaspora.erythropa)

厚垣孢子于土壤中單生，孢壁5層，L1、L2為單一壁，光澤度高；L3膜狀；L4層狀壁；在Melzer’s試劑中，L5紫紅，近球形，黃棕色，大小為220 μm×210 μm。

4.原囊霉屬(Archaeospora)

(30)薄壁原囊霉(Archaeospora.leptoticha)

球形至橢圓形，淺褐色或褐色，孢子表面常有一些附著物或呈脫斑狀，有些還具有不明顯的網(wǎng)狀飾物，大小為(20～150)μm×(40～180)μm。

3.4 孢子密度和菌根侵染率與土壤因子的相關(guān)性

除速效N和速效P外，其他土壤因子及菌根侵染率均與樹齡呈顯著相關(guān)。孢子密度和菌根侵染率與pH顯著負(fù)相關(guān)，與有機(jī)質(zhì)和速效鉀顯著相關(guān)(表1)。

表1 土壤因子與根系侵染率和孢子密度的相關(guān)性

4 討論與結(jié)論

國內(nèi)外很多學(xué)者對樹齡和菌根狀況的關(guān)系做了大量的研究，崔莉娜等[20]研究我國杉木林孢子密度與菌根侵染率與林齡顯著正相關(guān)。陳雪冬等[21]研究黃土高原地區(qū)刺槐純林的孢子密度和菌根侵染率隨著樹齡的增加而增加。與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致，其原因可能是老齡根系統(tǒng)具有較多且發(fā)達(dá)的細(xì)根，并且有大量孢壁細(xì)胞和發(fā)達(dá)的細(xì)胞間隙，因而表層阻力小，更有利于AM真菌的侵染。并且對榆樹而言，隨樹齡的增加其側(cè)根和須根的數(shù)量增加，為AM真菌提供了更多的侵染位點(diǎn)，因此侵染率隨著樹齡的增加而上升。

研究發(fā)現(xiàn)，土壤pH隨樹齡的增加酸性增強(qiáng)，這與崔莉娜等[20]研究結(jié)果一致。原因主要是榆樹根系分泌物的長期累積、凋落物的堆積和腐蝕均可導(dǎo)致根系土壤酸化。N、P質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著樹齡的增加先降低后增加，這可能是榆樹在中齡階段屬于速生和桿材階段[21]，植物對土壤養(yǎng)分的需求大，該階段土壤微生物數(shù)量和活性較低使得凋落物對N、P元素的歸還較少導(dǎo)致的[22]。在過去的研究中速效K質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨樹齡變化的結(jié)果并不一致，林希昊等[23]研究表明隨著橡膠林樹齡增加速效K質(zhì)量分?jǐn)?shù)有逐漸減少的趨勢，而本文速效K質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨樹齡的增加而增加的結(jié)果與張社奇等[24]研究結(jié)果一致，可能是土壤中K元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少，隨著樹齡的增加，土壤微生物增多，促進(jìn)了難溶、無效的礦物態(tài)鉀向水溶性及交換性鉀交換。有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著樹齡的增加呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，與蔡葵等[25]研究結(jié)果一致，原因可能是榆樹在幼齡階段凋零物和其他分解量相對較少，自身生長發(fā)育需要吸收量較多導(dǎo)致有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，隨著樹齡的增加，枯落物、植物殘體等分解成有機(jī)質(zhì)，且榆樹生長末期對有機(jī)質(zhì)的吸收減少，導(dǎo)致有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高。

本研究發(fā)現(xiàn)，榆樹生長狀況的影響因子也與樹齡有關(guān)。具體而言，10年生榆樹林光合能力強(qiáng)，各器官生長代謝活躍，可以充分的利用自身和土壤養(yǎng)分來滿足自身的生長需求，因此AM作用并不明顯；25年生榆樹正處于生長旺盛階段，隨著林分密度增大，種內(nèi)競爭激烈，此時榆樹生長較快，根系向土層深處生長，給AM提供了生長的場所；榆樹生長40 a，此時榆樹根系發(fā)達(dá)，土壤中具有豐富的外延菌絲網(wǎng)[8]，擴(kuò)大了根系的吸收范圍，此時是AM充分發(fā)揮作用的階段。

本試驗(yàn)結(jié)果表明：不同樹齡沙地榆樹根系均能與AM真菌形成良好的共生關(guān)系。孢子密度和菌根侵染率均為40年生最高。從沙地榆根圍共分離出AM真菌4屬30種，球囊霉屬(Glomus)17種，無梗囊霉屬(Acaulospora)9種，盾巨孢囊霉屬(Scutellospora)3種，原囊霉屬(Archaeospora)1種，其中球囊霉屬(Glomus)為主要優(yōu)勢菌。不同樹齡沙地榆樹根際土壤pH、速效P、速效N、速效K、有機(jī)質(zhì)存在差異。隨著樹齡的增加速效K與有機(jī)質(zhì)呈現(xiàn)增長的趨勢，pH呈現(xiàn)降低趨勢，速效P和速效N質(zhì)量分?jǐn)?shù)先降低后增加。這為篩選AM真菌資源，利用菌根技術(shù)提高沙區(qū)榆樹抗逆性等方面奠定了基礎(chǔ)。