張亞萍，趙風光，劉純，楊曼麗，林影，韓雙艷*

（1.華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006；2.華南理工大學 輕工科學與工程學院，廣東 廣州 510006）

面制品是中國北方地區(qū)的傳統(tǒng)主食，由于小麥的品種以及地理因素的限制，在制作面制品時，往往需要面粉改良劑的輔助[1]。傳統(tǒng)的化學添加劑，如溴酸鉀[2]、偶氮甲酰胺[1]等，由于存在安全隱患，已經(jīng)被禁止在面粉中使用。與此同時，酶制劑作為綠色溫和的面粉改良劑，正在顯示出廣泛的應用前景。近些年來，酶制劑在烘焙中的應用越來越受到重視，包括α-淀粉酶、蛋白酶和木聚糖酶在內(nèi)的幾種酶制劑已成功應用于烘焙行業(yè)[2-5]。但是，用于烘焙行業(yè)的商業(yè)木聚糖酶種類較少，并且多為國外公司供應[6]。

木聚糖酶能夠水解小麥等谷物結(jié)構(gòu)中存在的非淀粉多糖[7]。全麥面粉中的阿拉伯木聚糖（Arabinoxylan，AX）含量約為2%～5%，其中水溶性的阿拉伯木聚糖（water-extractable Arabinoxylans，WE-AX）約占25%～30%，水不溶性阿拉伯木聚糖（water-unextractable Arabinoxylans，WU-AX）約占 70%～75%[4，6，8]。WE-AX 具有低水親和力，可誘導面筋網(wǎng)絡中的水再分配，提高面團和面包的質(zhì)量，WU-AX則對面包體積具有負面影響[9-11]。Both等[12]評估木聚糖酶對全麥面包的影響，證實木聚糖酶可以減少面團中纖維的不良影響。Guo等[13]發(fā)現(xiàn)，與高分子量水不溶性阿拉伯木聚糖相比，水溶性阿拉伯木聚糖可以通過增強水分子、淀粉和麩質(zhì)之間的相互作用來改善小麥面團的流變特性和加工性能。此外，在木聚糖酶的作用下，面粉中釋放的低聚木糖具有益生元作用[14]，這些低聚物在刺激腸道雙歧桿菌生長和促進腸道健康方面有著一定的潛力[15]。

迄今為止，已經(jīng)從微生物中鑒定出多種木聚糖酶，并研究了它們對面團和面包質(zhì)量的影響[16]。然而，酶源、純度和特異性引起的活性和作用方式的變化會影響酶對面團面包的作用效果。烘焙行業(yè)一直在尋找更多具有良好性能和應用效果的酶[16]。在新酶挖掘中，基因組挖掘手段已被證明是一種有效且經(jīng)濟的方法，可以用于發(fā)現(xiàn)具有潛在工業(yè)應用的新酶[17]。在前期研究中，以對面包加工具有積極效果的棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶（spO43097.1）為出發(fā)序列，利用基因組挖掘方法，找到了5種具有潛在價值的木聚糖酶基因，且在后續(xù)的驗證試驗中，來源于鐮刀菌Fo47的木聚糖酶（EWZ46984.1）對改善面包品質(zhì)具有積極效果。

為進一步探索鐮刀菌Fo47木聚糖酶（Fusarium oxysporum Fo47 xylanase，F(xiàn)XYL）的生化特性，評估其對全麥面包品質(zhì)改善的效果，本文對鐮刀菌Fo47木聚糖酶進行了異源表達和分離純化，在研究其酶學性質(zhì)的基礎上，通過面包烘焙試驗，探討其對全麥面包品質(zhì)的影響，旨在為木聚糖酶在烘焙面包中的應用提供一種良好的候選酶，為豐富我國面粉改良酶制劑種類奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

畢赤酵母X33菌株：華南理工大學生物科學與工程學院微生物酶學實驗室保存；畢赤酵母篩選培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose zeocin agar medium，YPDZ）、發(fā)酵生長培養(yǎng)基（buffered glycerol-complex medium，BMGY）、甲醇誘導培養(yǎng)基（buffered methanolcomplex medium，BMMY）：參考美國Invitrogen公司畢赤酵母表達手冊制備；酵母粉、蛋白胨、無氨基酵母氮源（生化試劑）：美國BD公司；限制性內(nèi)切酶（生化試劑）：美國Thermo公司；鑫樂全麥面粉：塞鑫面業(yè)有限公司；木聚糖（分析純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

MicroPulser電轉(zhuǎn)儀：美國Bio-Rad公司；AKTApure蛋白純化系統(tǒng)：美國通用電氣公司；Biotek多功能酶標儀：美國基因有限公司；ESC1510全自動面包機：美的集團股份有限公司；KX32-V2171多功能烤箱：九陽股份有限公司；TA-XT質(zhì)構(gòu)儀：英國Stable Microsystem公司。

1.3 方法

1.3.1 鐮刀菌Fo47木聚糖酶畢赤酵母重組表達菌的構(gòu)建

利用 SignalP-5.0 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service） 預測鐮刀菌 Fo47木聚糖酶（EWZ 46984.1）自身信號肽序列，利用NetNGlyc1.0在線網(wǎng)站（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0）預測該蛋白N-糖基化位點。將不含前導肽序列的鐮刀菌Fo47木聚糖酶氨基酸序列，按照畢赤酵母密碼子偏好性進行優(yōu)化，并在N端和C端分別加上EcoR1和Not1酶切位點后，交由上海捷瑞生物工程有限公司進行全基因合成，合成的基因連接在pPiczαA上。對全基因合成的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoR1和Not1進行雙酶切驗證，并將該質(zhì)粒送往北京擎科生物科技有限公司進行測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pPiczαA-fxyl。然后將重組質(zhì)粒pPiczαA-fxyl線性化后，通過電擊的方法將其轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33中，并將其涂布于YPDZ固體篩選平板上。挑取YPDZ平板上的酵母單菌落進行裂解后，取適量酵母菌裂解液作為模板進行菌落聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）驗證，其中上游引物為5'-GCTCCATCTAAGGAAGGTT-3'，下游引物為 5'-TTGACATGGTTCGTTAGCTC-3'。

1.3.2 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶的誘導表達和純化

接種1.3.1酵母菌落PCR鑒定過的陽性轉(zhuǎn)化子于BMGY液體培養(yǎng)基中（5 mL），30℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)20 h～24 h。25℃溫度下，3 000 r/min離心2 min后，收集菌體，并將其轉(zhuǎn)接至BMMY液體培養(yǎng)基（25 mL）中，控制轉(zhuǎn)接后的初始菌液OD600為0.5～1.0。之后，于30℃、250 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)144 h，期間每隔24 h取樣測定木聚糖酶的酶活力，并向培養(yǎng)基中添加甲醇至1.0%。用導入pPiczαA空載體的畢赤酵母X33菌株作為對照，來驗證木聚糖酶是否成功表達。

收集發(fā)酵上清液，使用0.22 μm膜進行過濾，以防止堵塞層析柱。將獲得的樣品螯合到Ni-NTA柱，先用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0）進行平衡，之后使用含有咪唑的洗脫緩沖液（50 mmol/L～500 mmol/L咪唑、20 mmol/L磷酸鹽緩沖液、pH7.0）梯度洗脫吸附的蛋白質(zhì)，收集含有木聚糖酶活性的組分并進行濃縮。對收集到的組分進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析判斷蛋白質(zhì)純度[18]，通過考馬斯亮藍法（Bradford法）[19]測定蛋白質(zhì)的濃度，并計算重組木聚糖酶的比酶活。

1.3.3 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶酶活力測定

使用 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定木聚糖酶的酶活力[20]：以山毛櫸木聚糖作為底物，用100 mmol/L的檸檬酸鹽緩沖液（pH5.0）配制成1%山毛櫸木聚糖的濃度。取100 μL底物，向其中加入100 μL稀釋后的酶液，45℃反應10 min，立即加入300 μL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至20℃～30℃后，用酶標儀測定540 nm下吸光度值。配制不同濃度的木糖溶液，同樣條件下與DNS反應，繪制標準曲線。木聚糖酶酶活力定義：在45℃，1 min水解底物生成1 μmoL還原糖的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

1.3.4 pH值和溫度對重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶特性的影響

按照1.3.3酶活力測定方法，測定重組木聚糖酶在不同pH值（3.0～8.0）和不同溫度（30℃～60℃）下的酶活力，確定最適反應pH值和最適反應溫度。將酶液置于不同pH值（4.0～11.0）的緩沖液中，25℃下處理12 h，以最高木聚糖酶酶活力為100%，計算相對酶活力，研究重組木聚糖酶的pH值穩(wěn)定性。將酶液分別置于不同溫度（4℃～70℃）中保溫1 h，以最高木聚糖酶酶活力為100%，計算相對酶活力，確定其溫度穩(wěn)定性。所用緩沖液pH 3.0～6.0內(nèi)采用100 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液，pH6.0～8.0內(nèi)采用100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH8.0～9.0 采用 100 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH9.0～11.0采用100 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。

1.3.5 面包的制作及質(zhì)量評估

參照Liu等[21]的方法進行全麥面包的制作。將100 g全面粉、58 g純凈水、6 g糖、1.6 g食用鹽、1 g酵母粉、3 g食用油和適量1.3.2純化的酶制劑加入到面包機中，攪拌后形成均勻的面團。將和好的面團置于天平上，分成50 g/個，揉成圓形，置于38℃條件下發(fā)酵60 min。發(fā)酵結(jié)束后，將面團放入180℃烤箱中焙烤10 min，得到面包成品。將制得的面包20℃～30℃下冷卻2 h，測定全麥面包的質(zhì)量、體積、質(zhì)構(gòu)和比容，比容為全麥面包的體積/全麥面包的質(zhì)量（cm3/g）。為測試全麥面包芯的質(zhì)構(gòu)特性，將全麥面包切成厚度為2 cm的面包片，使用TA-XT質(zhì)構(gòu)儀的P/25探頭進行測試，測前速度、測試速度和測后速度分別設置為1、1 mm/s和5 mm/s，面包壓縮比設置為50%，兩次下壓間隔時間設置為10 s。其中，以不加酶組為對照組，以加酶組為試驗組。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行繪圖。使用SPSS22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 鐮刀菌Fo47木聚糖酶基因的優(yōu)化

鐮刀菌Fo47來源的木聚糖酶（EWZ46984.1）序列全長289個氨基酸，SignalP-5.0信號肽預測顯示其肽鏈的N端含有19個氨基酸前導肽序列。針對畢赤酵母偏好性，對鐮刀菌Fo47木聚糖酶去除前導肽后的270個氨基酸序列，進行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的鐮刀菌Fo47木聚糖酶序列圖見圖1。

圖1 密碼子優(yōu)化后鐮刀菌Fo47木聚糖酶序列Fig.1 Sequence diagram of Fusarium oxysporum Fo47 xylanase after codon optimization

為方便后續(xù)的重組表達載體構(gòu)建及質(zhì)粒線性化，密碼子優(yōu)化后的堿基序列規(guī)避了EcoR1、Not1和Sac1酶切位點，優(yōu)化后的堿基序列GC含量為48.89%，開放閱讀框內(nèi)目的蛋白理論分子量為31.6 kDa，NetNGlyc糖基化預測發(fā)現(xiàn)該蛋白有兩個N-糖基化位點。

2.2 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶畢赤酵母工程菌的構(gòu)建

將全基因合成生物公司交付的質(zhì)粒用EcoR1和Not1限制性內(nèi)切酶進行雙酶切驗證，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，重組表達質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切后，得到了3 500 bp和800 bp左右的條帶，分別與載體片段和目的基因片段大小一致。將該質(zhì)粒線性化后電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33中，培養(yǎng)獲得重組子，通過菌落PCR驗證，結(jié)果見圖3。

圖2 重組Fo47木聚糖酶畢赤酵母質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of recombinant plasmid by double enzyme digestion

由圖3可知，菌落PCR的片段大小約為800 bp，與目的基因大小相符，表明重組鐮刀菌木聚糖酶畢赤酵母重組菌構(gòu)建成功。

圖3 重組Fo47木聚糖酶畢赤酵母菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification of recombinant Pichia pastoris colony

2.3 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶在畢赤酵母中的分泌表達

將酵母菌落PCR鑒定的陽性轉(zhuǎn)化子按照1.3.2所述方法進行搖瓶發(fā)酵，用1%的甲醇進行誘導表達，每隔24 h取樣，測試重組酵母菌生長情況和發(fā)酵液上清木聚糖酶酶活力，結(jié)果見圖4。

圖4 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶畢赤酵母生長曲線和產(chǎn)酶曲線Fig.4 Growth curve and enzyme production curve of recombinant Pichia pastoris

由圖4可知，隨著誘導表達時間的延長，重組畢赤酵母菌OD600和發(fā)酵液上清中木聚糖酶的酶活力逐漸上升，當誘導表達時間為144 h時，重組畢赤酵母菌OD600達到33.96，發(fā)酵上清酶活力達到779.64 U/mL。結(jié)果表明，利用畢赤酵母X33，實現(xiàn)了重組鐮刀菌木聚糖酶的異源分泌表達。

2.4 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶的純化及SDS-PAGE分析

收集發(fā)酵上清液，利用Ni-NTA柱層析對發(fā)酵液上清中的重組木聚糖酶進行純化，收集洗脫液進行木聚糖酶酶活力測定，蛋白濃度測定和SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖5。

圖5 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant xylanase

結(jié)果表明，純化后的FXYL木聚糖酶的比酶活為764.33 U/mg，表觀分子量約為35 kDa，略大于其理論分子量31.6 kDa，推測可能是蛋白質(zhì)糖基化導致的分子量增加。

2.5 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶的酶學性質(zhì)研究

pH值對重組FXYL的影響如圖6所示。

圖6 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶最適反應pH值Fig.6 Effects of pH on the activity of of recombinant FXYL

由圖6可知，隨著pH值的升高，F(xiàn)XYL的相對酶活力先升高再降低，最適反應pH值為5.0。將FXYL在不同pH值（4.0～11.0）孵育12 h后，測定相對酶活力，結(jié)果如圖7所示。

圖7 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶pH值穩(wěn)定性Fig.7 The pH stability of recombinant FXYL

由圖7可知，在pH5.5～10.0內(nèi)放置12 h，F(xiàn)XYL能保持60%以上的相對酶活力，表明FXYL具有較寬的pH值耐受性。

溫度對重組FXYL的影響如圖8所示。

圖8 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶最適反應溫度Fig.8 Effects of temperature on the activity of recombinant FXYL

由圖8可知，F(xiàn)XYL的最適溫度為45℃，在30℃～50℃相對酶活力在60%以上。熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖9所示。

圖9 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶溫度穩(wěn)定性Fig.9 The temperature stability of recombinant FXYL

由圖9可知，隨著溫度的升高，重組FXYL的酶活力逐漸降低，在溫度小于40℃放置1 h時，F(xiàn)XYL的相對酶活力保持在80%以上，隨著溫度的進一步升高，酶活力急劇降低，在溫度為50℃時，F(xiàn)XYL僅殘余20%左右的相對酶活力。

酶的作用溫度對于面包烘焙至關重要，面團制備和醒發(fā)通常在中低溫下進行，這意味著在中低溫下具有良好活性的木聚糖酶可能更適合烘焙行業(yè)[22]。FXYL在30℃～45℃的溫度內(nèi)，具有良好的活性和穩(wěn)定性（＞60%），這也與面團的制備和醒發(fā)溫度相一致。另一方面，木聚糖酶的pH值活性對其在烘焙中的利用也非常重要。在面團發(fā)酵過程中，面團中細菌緩慢產(chǎn)生的有機酸以及二氧化碳在水中溶解產(chǎn)生的碳酸會導致面團的pH值處于弱酸性（pH 6左右）[23]。在該pH值下，F(xiàn)XYL木聚糖酶的活性和穩(wěn)定性都能夠保持60%以上。這些結(jié)果均表明FXYL木聚糖酶在面包生產(chǎn)中具有潛在的優(yōu)勢。

2.6 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶對全麥面包品質(zhì)的影響

為了評估FXYL的潛在應用價值，將上述純化的重組FXYL木聚糖酶（764.33 U/mg）添加到面團中，進行面包的制備，結(jié)果見表1。

表1 重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶對全麥面包品質(zhì)的影響Table 1 Effect of recombinant FXYL on wholemeal bread

在面包烘焙行業(yè)中，面包體積是評價面包質(zhì)量的重要指標。從表1可以看出，與對照組相比，添加重組鐮刀菌木聚糖酶FXYL后，全麥面包的比容明顯增加，當FXYL添加量為15 mg/kg面粉基時，全麥面包的比容最大，與對照組相比，增加了13.06%。另一方面，面包的質(zhì)構(gòu)特性對于面包的品質(zhì)也至關重要，在本研究中，通過質(zhì)構(gòu)儀研究了FXYL對面包硬度、彈性、咀嚼性的影響，與對照組相比，添加FXYL后，全麥面包的硬度和咀嚼性顯著降低，彈性則明顯增加。當FXYL添加量為20 mg/kg面粉基時，面包的硬度和咀嚼性分別降低了32.20%和29.39%，彈性增加了3.85%。全麥面包的比容和彈性與全麥面包品質(zhì)成正比，硬度和咀嚼性則與全麥面包的品質(zhì)成反比。這些結(jié)果表明，添加FXYL可以顯著提高全麥面包的品質(zhì)，其有望成為面包改良劑的候選。

研究表明，面粉中存在的水不溶性阿拉伯木聚糖是影響面粉加工品質(zhì)的重要影響因素[8]。在面團混合過程中，阿拉伯木聚糖與面筋競爭水分，影響面筋蛋白的聚集和面筋網(wǎng)絡的形成[24]。木聚糖酶可以通過水解水不溶性阿拉伯木聚糖的主鏈，降低其分子大小和持水能力，從而產(chǎn)生更好的面筋網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，進而提高面團的持氣性和終端產(chǎn)品面包的品質(zhì)[24-25]。

3 結(jié)論

本研究根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性，在不改變氨基酸序列的條件下，對鐮刀菌Fo47木聚糖酶進行了密碼子優(yōu)化。之后構(gòu)建了鐮刀菌Fo47木聚糖酶重組表達菌，實現(xiàn)了其在畢赤酵母中的分泌表達。搖瓶水平下，甲醇誘導表達144 h后，重組畢赤酵母菌發(fā)酵上清酶活力達到779.64 U/mL。通過Ni-NTA柱層析對重組畢赤酵母發(fā)酵上清液進行了分離純化，目的蛋白比酶活為764.33 U/mg。酶學性質(zhì)研究表明，重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶最適反應溫度為45℃，在小于40℃溫度下放置1 h后，木聚糖酶的相對酶活力能保持在80%以上，屬于中溫酶；重組木聚糖酶最適反應pH值為 5.0，在 pH5.5～10.0，25℃放置 12 h后，相對酶活力保持60%以上，具有良好的pH值穩(wěn)定性。最后，初步研究了重組鐮刀菌Fo47木聚糖酶對全麥面包品質(zhì)的影響，該酶能夠提高全麥面包的比容和彈性，降低全麥面包的硬度和咀嚼性，后續(xù)需要進一步開展更為細致的研究，考察其是否可以發(fā)展成為一種新型的面包改良劑。