王鳳華，張晨晨，高文靜，郭澤輝，劉逸寒，路福平

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學 生物工程學院，天津 300457）

酶作為生物大分子催化劑，具有高效性、專一性和作用條件溫和等特點。加氧酶屬于氧化還原酶類，能夠在溫和條件下活化分子氧，從而將底物氧化，是加速生命體氧化反應的一類生物酶的總稱。目前，通過18O示蹤法發(fā)現(xiàn)了兩大類加氧酶：一是催化O2中的兩個氧原子與底物結合的雙加氧酶；二是催化O2中的一個氧原子插入底物，另一個氧原子與電子供體提供的氫原子結合生成水的單加氧酶。其中，黃素單加氧酶（flavoprotein monooxygenases，F(xiàn)PMOs）是一類被廣泛應用的單加氧酶，其催化反應嚴格依賴輔因子、輔酶，如黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleo-tide，F(xiàn)AD）、黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）等，激活 O2[1-2]。

黃素單加氧酶廣泛參與生物反應過程，在化合物的代謝中發(fā)揮關鍵作用[3]。大多數(shù)黃素單加氧酶能夠催化黃素的C4a和分子氧之間形成共價鍵，從而產(chǎn)生黃素過氧化物中間體，這種過氧化黃素中間體在黃素單加氧酶的作用下能夠進一步氧化目標底物[4]。黃素單加氧酶在反應中可催化羥基化、拜爾-維利格氧化、硫氧化、環(huán)氧化和鹵化反應，具有的高區(qū)域選擇性和對映選擇性使其成為良好的生物催化劑，用于多種高價值化合物的合成，在食品功能因子蒜氨酸和蘿卜硫素的開發(fā)與制備等方面前景廣闊[3]。本文從黃素單加氧酶的分類、特性研究和蛋白質(zhì)工程及其在食品功能因子合成中的應用三方面展開論述，以期為黃素單加氧酶在食品領域內(nèi)的進一步開發(fā)和利用提供參考。

1 黃素單加氧酶的分類

氧化還原酶的分類可采用不同的標準，如催化的化學反應類型、還原和氧化底物的性質(zhì)、酶序列或三維結構的同源性等[5]。當前黃素單加氧酶基于結構特征、蛋白質(zhì)序列、電子供體和加氧反應的類型不同分為8個亞類：A類、B類、C類、D類、E類、F類、G類、H類[6]。其中，A類、B類、G類、H類黃素單加氧酶由單個基因編碼，C類～F類黃素單加氧酶由編碼單加氧酶和還原酶組分的兩個或者多個基因編碼。A類和B類黃素單加氧酶將單加氧酶和還原酶基因編碼于一條多肽鏈中，以FAD為輔基，NADPH為電子供體完成加氧反應，部分A類和B類黃素單加氧酶如水楊酸單加氧酶（salicylate hydroxylase，NahG）以 NADH 作為電子供體[7]。C類～H類黃素單加氧酶則以還原型黃素單核苷酸（reduced flavin mononucleotide，F(xiàn)ADH2）、還原型黃素二核苷酸（reduced flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)MNH2）或底物為電子供體完成加氧反應。黃素單加氧酶分類見表1。

表1 黃素單加氧酶分類Table 1 Classification of flavoprotein monooxygenases

1.1 A類黃素單加氧酶

A類黃素單加氧酶在催化過程中需要緊密結合FAD，具有NADH/NADPH依賴性，主要包含用于FAD結合的二核苷酸結合結構域。該酶以包含活化羥基或氨基的芳香化合物為典型底物，催化過程中C4a-過氧化黃素對芳香環(huán)發(fā)起親電或親核攻擊，NADP+和NAD+則在FAD被還原后直接釋放。A類黃素單加氧酶具有狹窄的底物特異性，通常參與多種芳香化合物的微生物降解[8]，包括已被廣泛研究的熒光假單胞菌對羥基苯甲酸羥化酶（p-hydroxybenzoic acid hydroxy lase，PHBH）、角鯊烯單加氧酶（squalene monooxyge nase，SQLE）等[9-10]。角鯊烯單加氧酶早期被稱為角鯊烯環(huán)氧化酶，是一種含有FAD的單酶，分子量約為64kDa，其催化的典型反應為細胞色素P450型氧化，能夠使角鯊烯在C=C雙鍵上環(huán)氧化生成2，3-氧化角鯊烯，在催化膽固醇生物合成中起重要作用[11]。最近研究人員解析了SQLE催化結構域的三維結構[12]，對其未來生物催化具有指導性意義。除上述反應外，A類黃素單加氧酶還參與了泛醌的生物合成[13]、芳香族聚酮[14]的修飾和生物降解途徑[15-16]。

1.2 B類黃素單加氧酶

與A類黃素單加氧酶類似，B類黃素單加氧酶在催化反應過程中亦需要與之緊密結合的輔因子FAD，并且依賴于NADPH或NADH作為輔酶。B類黃素單加氧酶結構主要包含F(xiàn)AD和NAD（P）H兩個二核苷酸結合結構域，在整個催化過程中始終保持NADP+的結合[2，17]。Cho 等[18]發(fā)現(xiàn) NADP+的結合可能穩(wěn)定了黃素過氧化物中間體。由于B類黃素單加氧酶能夠氧化底物分子上的碳原子、硫原子和其他（雜）原子，因此又被稱為多功能含黃素的單加氧酶，其介導的氧化反應具有立體、化學和區(qū)域選擇性高的特點。因此，幾十年來越來越多的B類黃素單加氧酶被鑒定、克隆、重組表達、工程化并用于生物催化。B類黃素單加氧酶包含兩個典型的Rossman折疊基序（GxGxxG），一個Rossman折疊基序位于N端附近，另一個位于序列中間部位。根據(jù)序列相關性，已有的B類黃素單加氧酶可進一步分為3個亞類：拜爾-維利格單加氧酶（Baeyer-Villiger monooxygenases，BVMOs）、含黃素的單加氧酶（flavincontaining monooxygenases，F(xiàn)MOs）和 N-羥基化單加氧酶（N-hydroxylating monooxygenases，NMOs）[19-20]。

1.2.1 拜爾-維利格單加氧酶

在有機化學中，酮氧化產(chǎn)生酯或內(nèi)酯被稱為拜爾-維利格氧化。拜爾-維利格單加氧酶包含序列基序FxGxxxHxxxWP/D，主要催化含雜原子化合物（N、S、B或Se化合物）的加氧，具有較高的立體、區(qū)域和化學選擇性。由于拜爾-維利格單加氧酶的產(chǎn)物手性內(nèi)酯是合成天然產(chǎn)物和類似物的重要中間體，因此，越來越多的拜爾-維利格單加氧酶被廣泛研究[21]。從醋酸鈣不動桿菌中獲得的環(huán)己酮單加氧酶（cyclohexanone monooxygenase，CHMO）是一種重要的單加氧酶，其能夠催化多種酮類的選擇性氧化從而實現(xiàn)底物的對稱化反應、區(qū)域性氧化以及動力學拆分等[22]，是強大生物催化劑；目前，CHMO可在大腸桿菌中高效表達，并已獲得其與底物環(huán)己酮、NADP+和FAD復合物2.4 ?分辨率的三維空間結構[23]，為其進一步應用奠定了基礎。另一種被廣泛研究的拜爾-維利格單加氧酶為來自褐色嗜熱裂孢菌的苯丙酮單加氧酶（phenylacetone monooxygenase，PAMO），其編碼序列從褐色嗜熱裂孢菌基因組DNA中克隆獲得，并利用pBAD/myc-HisA衍生載體pBADNK在大腸桿菌中實現(xiàn)表達；研究表明，苯丙酮單加氧酶能夠催化苯丙酮氧化生成乙酸芐酯，此外該酶還能催化芳香酮族、脂肪酮族、有機硫化物以及含氮化合物和硼原子發(fā)生氧化反應，具有耐受高溫和有機溶劑的特征[24-25]；另外，Yang等[25]和Dudek等[26]分別通過蛋白質(zhì)工程和催化反應條件優(yōu)化等方法提高了PAMO催化反應的轉(zhuǎn)化率，增加了酶催化底物的選擇性。最近，一種新的參與黃曲霉毒素生物合成的細菌I型拜爾-維利格單加氧酶MoxY被鑒定為羥基異色酮/異色酮單加氧酶，其可將黃曲霉毒素合成的中間產(chǎn)物羥基異色酮（hydroxyversicolorone，HVN）轉(zhuǎn)化為乙酸異丙醇半縮醛（versiconal hemiacetal acetate，VHA），異色酮（versicolorone，VN）轉(zhuǎn)化為乙酸異丙醇（versiconol acetate，VOAc）；若moxY基因被破壞，則導致HVN和VN的積累，進而引發(fā)黃曲霉毒素的合成量減少[27-28]。BVMOs在自然界中分布廣泛，參與非典型碳源的初級代謝以及有毒或有用的復雜次級代謝產(chǎn)物的合成，如抗生素、抗癌劑和抗增殖劑。作為一種化學拜爾-維利格氧化的替代物，其更為環(huán)保，并且具有更為良好的區(qū)域和對映選擇性。

1.2.2 含黃素的單加氧酶

與其他B類黃素單加氧酶相比，F(xiàn)MOs具有獨特的序列基序FxGxxxHxxxYK/R，用于特異性催化含雜原子化合物的氧化，對拜爾-維利格氧化反應的催化效率非常低。FMOs最初在肝微粒體中被鑒定，并命名為“混合功能氧化酶”，后更名為含黃素的單加氧酶。FMOs普遍存在于哺乳動物和真核生物中，包括多種亞型，定位于不同組織，并具有不同的底物特異性。人類基因組中發(fā)現(xiàn)了共計6個FMO基因，其中FMO3是最重要的亞型[29]。在哺乳動物中，F(xiàn)MOs負責含氮和含硫化合物的解毒作用[30]。近期多種人源和哺乳動物FMOs的結構解析取得了突破性進展[31-32]。與哺乳動物FMOs相比，酵母FMOs不氧化含氮化合物，只與生物硫醇發(fā)生作用，酵母細胞通過FMOs在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中制造氧化環(huán)境從而實現(xiàn)含二硫鍵蛋白的正確折疊[33]。目前，基因組分析表明，F(xiàn)MOs基因在植物中十分常見，如參與次生植物代謝物N-羥基-哌啶酸生物合成的植物來源的含黃素單加氧酶1[34-35]，參與多功能植物激素吲哚-3-乙酸生物合成的吲哚-3-丙酮酸單加氧酶（in dole-3-pyruvate monooxygenase）[36]以及具有亞砜化活性的大蒜來源的含黃素單加氧酶（Allium sativum flavincontaining monooxygenase 1，AsFMO1）[37]。與其它真核生物FMOs相比，細菌FMOs相對較少，但其更易于表達成為可溶性蛋白。因此，細菌FMOs逐漸發(fā)展成為有潛力的生物催化劑。

1.2.3 N-羥基化單加氧酶

N-羥基化單加氧酶與B類黃素單加氧酶具有序列同源性，但缺乏典型的序列基序FxGxxxHxxx[38]。當前，只有少數(shù)來源于細菌和真菌的NMOs被報道，這些NMOs通過催化L-鳥氨酸、L-賴氨酸、腐胺和尸胺的末端胺的N-羥基化，參與羥胺基苷酸的生物合成。Robinson等[39]研究發(fā)現(xiàn)NMOs中的鳥氨酸單加氧酶（ornithine monooxygenase，OMO）能夠催化 L-鳥氨酸的羥基化反應為N5-羥基-L-鳥氨酸，而鳥氨酸N5-羥基化是生產(chǎn)天然產(chǎn)品重要非蛋白源構件哌嗪鹽的第一步反應[40]。

1.3 C類～F類黃素單加氧酶

C類～F類黃素單加氧酶一般由還原酶和單加氧酶兩個具有不同功能的多肽鏈組分組成。還原酶組分主要完成黃素的還原，而單加氧酶組分則通過分子氧氧化對應底物。這些多組分酶系統(tǒng)的單加氧酶僅有少數(shù)結構被解析。

C類黃素單加氧酶是一種TIM-barrel酶，它能從依賴NAD（P）H的黃素還原酶中獲得FMN；其成員有細菌熒光素酶（bacterial luciferase，LUX）和烷磺酸單加氧酶（alkanesulfonate monooxygenase，SsuD），可分別實現(xiàn)醛氧化和脫硫（拜爾-維利格氧化），同時能夠催化亞砜化、環(huán)氧化和羥基化反應[41-44]。

D類黃素單加氧酶能夠結合FADH2/FMNH2，從依賴NAD（P）H的黃素還原酶獲得還原型的FAD/FMN；目前已知的D類酶有近幾十種，能夠催化芳香羥基化或N-羥基化反應等。

E類黃素單加氧酶是具有PHBH（GR-2）折疊的環(huán)氧酶[45]，可從利用NADH的黃素還原酶獲得FAD。例如，E類發(fā)現(xiàn)的苯乙烯單氧合酶（styrene monooxygenase，SMO），能夠?qū)⒈揭蚁┭苌镛D(zhuǎn)化為相應的（S）-苯乙烯氧化物[6]。

F類黃素單加氧酶可催化活化有機分子的區(qū)域選擇性氯化和溴化反應，其代表性酶色氨酸-7-鹵代酶（tryptophan-7-halogenase，PrnA）的催化反應機制是生成黃素過氧物中間體，進而與氯離子反應生成次氯酸[6]。

1.4 G類、H類黃素單加氧酶

G類和H類黃素單加氧酶是通過底物氧化還原黃素輔因子的單組分酶，主要催化氧化脫氨和氧化脫羧反應。G類黃素單加氧酶以氨基酸底物作為電子供體，其催化反應分為還原半反應和氧化半反應；反應過程中首先裂解氨基酸的α-CH鍵，形成與酶結合的亞胺酸，然后亞胺酸氧化脫羧最終形成酰胺。H類黃素單加氧酶具有TIM-barrel折疊，能夠結合FMN，通過底物氧化還原黃素輔因子，此亞類的代表性酶是乳酸-2-單加氧酶（lactate 2-monooxygenase），可催化 L-乳酸氧化為醋酸鹽、水和二氧化碳[6，41]。

2 黃素單加氧酶的特性及蛋白質(zhì)工程

隨著分子生物學、蛋白質(zhì)工程和生物信息學的發(fā)展，黃素單加氧酶得到了廣泛的生化和結構表征。通過對目的基因的高通量篩選，應用分子生物學和發(fā)酵工程等技術已獲得多種高表達的黃素單加氧酶。利用定向進化和理性設計等蛋白質(zhì)工程技術，擴大了酶的催化底物范圍，開發(fā)出多種具有獨特性質(zhì)的生物催化劑，成熟生物催化劑開發(fā)流程見圖1。

圖1 開發(fā)成熟生物催化劑的全流程Fig.1 Full process of developing a mature biocatalyst

2.1 黃素單加氧酶的表達與催化條件優(yōu)化

2.1.1 表達條件優(yōu)化

Van等[52]將PAMO作為BVMOs的模型，采用逐步改進的策略來提高PAMO在重組大腸桿菌中的表達水平，結果表明在30℃、0.2% L-阿拉伯糖的誘導下每毫克細胞可產(chǎn)生160 nmol/h PAMO，進一步發(fā)現(xiàn)誘導6 h內(nèi)乙酸芐酯的生成相對穩(wěn)定，4 h時誘導效果最佳。Riebel等[53]通過改變溫度、阿拉伯糖濃度以及利用NADPH依賴性黃素還原的方法將來自紅球菌RHA1的22個BVMO編碼基因均以可溶性活性酶的形式進行表達。Dudek等[26]開發(fā)了一種基于周質(zhì)表達PAMO的篩選方法，通過從施氏假單孢菌WM88中添加的亞磷酸鹽脫氫酶（phosphite dehydrogenase，PTDH）使底物完全與酶結合并促進NADPH回收。另外，重組的PAMO蛋白在大腸桿菌細胞周質(zhì)中得以功能性表達，同時實現(xiàn)了該系統(tǒng)與基于亞磷酸鹽脫氫酶的再生系統(tǒng)連用完成生物轉(zhuǎn)化。

2.1.2 催化反應過程優(yōu)化

黃素單加氧酶生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化策略包括輔因子再生系統(tǒng)開發(fā)、原位底物進料和產(chǎn)物去除（substrate feeding and product removal，SFPR）技術、全細胞催化以及溶劑工程等。

黃素單加氧酶催化反應多數(shù)嚴格依賴于輔因子NADPH，然而NADPH的高成本限制了酶的實際應用，因此開發(fā)輔因子再生系統(tǒng)成為催化反應過程優(yōu)化的重要一部分。利用細胞自身產(chǎn)生的NADPH進行生物轉(zhuǎn)化可有效避免或減少NADPH的補充。細胞內(nèi)的輔酶再生系統(tǒng)通?；隈詈厦阜磻糜贜ADPH再生的典型酶包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、亞磷酸鹽脫氫酶、醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶。Kohl等[54]采用多酶級聯(lián)反應促進NADPH輔因子的再生，即通過構建環(huán)己酮單加氧酶與乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）共表達的質(zhì)粒載體pRSFDuet在大腸桿菌中進行表達來實現(xiàn)輔因子再生，與來自兩個單獨質(zhì)粒分別表達相比，兩個基因串聯(lián)共表達的細胞對底物環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化率更高。Valencia等[55]將PTDH和BVMO進行融合，獲得PTDH-BVMO融合蛋白，能夠使系統(tǒng)中BVMO所需的NADPH實現(xiàn)自給自足。Lee等[56]研究發(fā)現(xiàn)，酵母中的NADH激酶在產(chǎn)生CHMO的大腸桿菌細胞中可以將NADH直接磷酸化為NADPH，與缺乏NADH激酶的對照相比，這種方法增強了分批補料生物轉(zhuǎn)化中環(huán)己酮的氧化，并使產(chǎn)物ε-己內(nèi)酯的產(chǎn)率提高了一倍。Wang等[57]提出了一種提高NADPH生物利用度的策略，即用枯草芽孢桿菌的NADP+依賴性gapB基因替換大腸桿菌中的天然NAD+依賴甘油醛-3-磷酸脫氫酶gapA基因，提高了NADPH利用度。Masuyama等[58]描述了一個釀酒酵母全細胞生物催化系統(tǒng)，在表達酵母來源的含黃素單加氧酶（yeast flavin-containing monooxygenase，YFMO）的同時表達UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，無需添加UDP-葡萄糖醛酸而獲得葡萄糖醛酸苷類化合物；此外，在酵母中使用硫磺轉(zhuǎn)移酶表達系統(tǒng)能合成磺基共軛物，而過程中不需要添加昂貴的輔助因子3-磷酸腺苷-5-磷酸硫酸鹽，這種新的酵母表達系統(tǒng)可能成為生產(chǎn)N-或S-氧化物的有力工具。Delgove等[59]將來自Thermocrispum urbane的熱穩(wěn)定性環(huán)己酮單加氧酶與來自嗜酸嗜熱原胞菌的葡萄糖脫氫酶共固定，用于NADPH輔因子再生。研究發(fā)現(xiàn)與在補料分批策略中應用的可溶性酶相比，共固定化可提供最有效的生物催化劑，在15個再利用循環(huán)中平均轉(zhuǎn)化率為83%，生物催化劑產(chǎn)率提高50倍。這種固定化的生物催化劑有助于環(huán)己酮單加氧酶在大規(guī)模生物氧化過程中的應用。由此可見，全細胞生物催化和酶的固定化在黃素單加氧酶生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)化中有著廣闊的發(fā)展前景。

SFPR技術允許生物轉(zhuǎn)化過程使用超過毒性水平的底物濃度，并避免由于底物或產(chǎn)物在體系中的濃度過高而產(chǎn)生的抑制反應。Mihovilovic等[60]在生物反應器中利用原位SFPR技術對叢毛單胞菌中的環(huán)戊酮單加氧酶進行生物轉(zhuǎn)化，將4-甲基環(huán)己酮轉(zhuǎn)化為相應的內(nèi)酯，使得內(nèi)酯的分離產(chǎn)率高達70%。Solé等[61]研究了來自Thermocrispum urbane的環(huán)己酮單加氧酶催化3，3，5-三甲基-環(huán)己酮氧化為三甲基-ε-己內(nèi)酯，結果發(fā)現(xiàn)在中試工廠規(guī)模（100 L反應容器）反應9 h后，轉(zhuǎn)化率達到85%，總分離的三甲基-ε-己內(nèi)酯產(chǎn)率為76%。此外，Pazmi?o等[62]通過將氨基酸殘基Met446突變?yōu)镚ly增強了PAMO介導的幾種前手性硫醚氧化的立體選擇性。Gonzalo等[63]進一步探索了溶劑工程方法擴大野生型和M446G PAMO的應用，在緩沖液/共溶劑的17種組合中評估了芐基甲基硫醚的氧化，并與水介質(zhì)中的反應進行了比較，發(fā)現(xiàn)在含有5%甲醇的Tris-HCl（pH9.0）中進行的反應使相應的亞砜具有高轉(zhuǎn)化率和良好的對映體比率。

2.2 黃素單加氧酶的蛋白質(zhì)工程

黃素單加氧酶有8個亞類，具有不同的性質(zhì)，能夠催化不同的反應，但應用條件非常有限。因此，深入了解黃素單加氧酶的三維空間結構及其作用機制，利用蛋白質(zhì)工程對其進行定向進化及合理設計，對提高酶的對映體選擇性、區(qū)域選擇性、擴寬酶的底物范圍等方面具有重要意義。Romero等[64]對一種來自于Thermocrispum municipal DSM 44069的環(huán)己酮單加氧酶（Thermocrispum municipal cyclohexanone monooxygenase，TmCHMO）進行了純化、表征、晶體結構測定以及底物特異性研究。Li等[65]對熱穩(wěn)定的TmCHMO底物結合口袋進行了迭代飽和突變，實現(xiàn)了該酶對底物4-苯基-2-丁酮的區(qū)域選擇性從99∶1到2∶98的逆轉(zhuǎn)。為了進一步擴大酶的底物譜，Zhang等[66]采用蛋白質(zhì)工程改變CHMO鄰近底物通道的活性位點，使底物特異性從環(huán)己酮單氧合作用轉(zhuǎn)向奧美拉唑硫氧化，從而有利于合成藥物奧美拉唑。Yang等[25]通過迭代位點特異性突變將耐高溫苯丙酮單加氧酶的底物范圍擴展到環(huán)己酮，獲得的最佳突變體I67Y/P440F，在10 h內(nèi)將環(huán)己酮轉(zhuǎn)化為ε-己內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化率可高達99%。Woo等[67]選擇了來自惡臭假單胞菌KT2440的BVMO與可溶性多離子肽標簽[即六-谷氨酸（E6）]融合后的重組酶（E6BVMO），將302位的半胱氨酸突變?yōu)榱涟彼幔瑥亩@得了在氧化和應激下更為穩(wěn)定的酶（E6BVMOC-302L），該酶在優(yōu)化催化條件后8 h內(nèi)酯的生產(chǎn)濃度為132 mmol/L（41 g/L）。Shirey等[68]將一種黃素依賴的 N-羥基化單加氧酶SidA中參與結合NADPH焦磷酸部分的Ser257突變?yōu)锳la，其活性受到較大影響，表明該絲氨酸對于NADP+的正確定位十分重要，能夠穩(wěn)定黃素過氧化物中間體。Valentino等[37]在大腸桿菌中異源表達了大蒜來源的含黃素單加酶，解析了AsFMO1與FAD復合物的結構，然而研究發(fā)現(xiàn)AsFMO1在催化底物 S-烯丙基-L-半胱氨酸（S-allyl-L-cysteine，SAC）時幾乎沒有活性；SAC模型表明當S原子靠近黃素C4a時，可能沒有足夠的空間容納SAC的3個末端C原子；鑒于蛋白質(zhì)工程改造已經(jīng)成功應用于CHMO、PAMO、BVMO等，極有可能實現(xiàn)通過定點突變使AsFMO1催化SAC產(chǎn)生目標產(chǎn)物。

近些年，B類黃素單加氧酶在表達條件優(yōu)化、催化反應優(yōu)化和蛋白質(zhì)工程改造3個方面不斷發(fā)展，研究工作者可以按照應用目的特定改造獲得具有良好特性的酶。B類黃素單加氧酶在生化和結構表征方面的成功，推動了其在食品、醫(yī)藥、化工領域的廣泛應用。

3 黃素單加氧酶在食品功能因子制備方面的應用

3.1 蒜氨酸的制備

目前，研究表明黃素單加氧酶參與食品功能因子蒜氨酸的生物合成。蒜氨酸（S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜）是大蒜中主要的含硫化合物之一[69]，為在組織受損時產(chǎn)生的藥用和風味化合物的主要來源。蒜氨酸是半胱氨酸的衍生物，具有碳中心和硫中心的立體化學結構[70]。體內(nèi)體外實驗證實，蒜氨酸具有降血糖、降脂、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗輻射等生物活性，同時可作為調(diào)味品[71]，在不同條件下與其他物質(zhì)發(fā)生反應產(chǎn)生風味物質(zhì)，增加食品的甜味、咸味和鮮味，在食品及醫(yī)藥領域具有潛在的應用價值。研究表明，一些動物來源的含黃素單加氧酶能夠?qū)-烯丙基-L-半胱氨酸進行S-氧化生成蒜氨酸，由此推測，在蔥屬植物中蒜氨酸的生物合成過程，含黃素的單加氧酶參與了S-氧化反應[72]。Yoshimoto等[73]發(fā)現(xiàn)了一種大蒜來源的含黃素單加氧酶AsFMO1，可催化SAC素進行S-氧化反應合成蒜氨酸。因此，近幾年蒜氨酸的生物制備受到了廣泛的關注。

3.2 硫代葡萄糖苷的制備

十字花科蔬菜的抗癌作用通常歸因于天然產(chǎn)物硫代葡萄糖苷（glucosinolates，GSLs）的分解所產(chǎn)生的異硫氰酸鹽。由4-甲基亞磺?；榛虼咸烟擒辗纸猱a(chǎn)生的異硫氰酸鹽，被認為具有抗癌特性。Hansen等[74]鑒定了一種擬南芥黃素單加氧酶，體內(nèi)研究表明該酶可實現(xiàn)幾乎全部的甲硫烷基硫代葡萄糖苷向甲基亞磺?；榛咸烟擒盏霓D(zhuǎn)化，對生產(chǎn)富含預防癌癥的蘿卜硫素的功能食品具有重要意義。

4 結論與展望

黃素單加氧酶來源廣泛，存在于絕大多數(shù)動植物、真菌和細菌中。由于其具有多種優(yōu)良的性能，可用于蒜氨酸和蘿卜硫素等多種保健和功能性食品的生產(chǎn)。截至目前，黃素單加氧酶家族已包含大約300種已知生理功能的酶，根據(jù)序列相似性和結構特征分為A類～H類。通過基因挖掘和蛋白質(zhì)工程等手段，目前多種具有高對映選擇性、高氧化活性和高熱穩(wěn)定性的黃素單加氧酶生物催化劑逐漸被開發(fā)。野生型及突變型黃素單加氧酶數(shù)量呈指數(shù)級增長，可催化新的氧化反應，從而進一步用于各工業(yè)領域。隨著高通量篩選和蛋白質(zhì)工程、多酶級聯(lián)策略、固定化等技術的快速發(fā)展，大數(shù)據(jù)及人工智能、多酶定向共固定化、納米載體等逐步延伸至更多不同功能黃素單加氧酶的發(fā)現(xiàn)及表征、結構及功能機制解析、應用拓展等，從而使其成為具有巨大潛力和發(fā)展前景的生物催化劑。