羅龍龍， 任衛(wèi)合， 王麗萍， 高彩雯， 楊許花，丁功濤 ， Nurul Izza Nordin， 陳士恩

(西北民族大學(xué)，生命科學(xué)與工程學(xué)院1，蘭州 730124) (西北民族大學(xué)，生物醫(yī)學(xué)研究中心，中國-馬來西亞國家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室2，蘭州 730124) (SIRIM有限公司工業(yè)生物技術(shù)研究中心3，莎阿南 40700)

青稞是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，在青藏高原等高海拔地區(qū)廣泛種植，青稞因其內(nèi)外穎殼分離，籽粒裸露，故又被稱為裸大麥、元麥、米大麥。青稞具有降血糖、降血脂、改善代謝綜合征等潛力[1]。其活性成分豐富，對改善糖尿病有明顯的效果。而青稞麩皮屬于青稞加工副產(chǎn)物，其利用率低，所以人們常常忽略了青稞麩皮的價值。青稞中脂肪含量較低，但又含有人體必需的脂肪酸、亞油酸等，因此在降低血糖、血脂和預(yù)防動脈硬化方面有良好的功效。青稞米粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為1.19%，而麩皮中粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.04%～7.45%[2]。有研究表明其脂肪酸的主要成分為C18∶1(9)、C18∶2(9,12)和C16∶0，在這些成分中C18∶2(9,12)含量為最高，麩皮油中的亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了75. 1%[3]。通過對青稞麩皮油的研究發(fā)現(xiàn)，青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶具有很強(qiáng)的抑制能力[4]，與糖尿病治療藥物阿卡波糖相比，其對α-葡萄糖苷酶的抑制能力明顯優(yōu)于阿卡波糖。因此其對II型糖尿病的治療有積極的作用。

α-葡萄糖苷酶是一組在碳水化合物代謝和糖蛋白加工中起關(guān)鍵作用的酶，廣泛分布在小腸各段上，主要位于小腸黏膜細(xì)胞刷狀緣上[5]。可選擇性水解末端(1→4)連接的α-葡萄糖殘基(淀粉或二糖)以釋放單個α-葡萄糖分子。α-葡萄糖苷酶的功能包括糖原降解、糖蛋白折疊和成熟的N-連接加工以及負(fù)責(zé)飲食中的碳水化合物在腸道消化。所以抑制α-葡萄糖苷酶是改善糖尿病并發(fā)癥的治療途徑之一。而目前的抑制物副作用明顯，因此從天然產(chǎn)物中尋找一種新的抑酶物質(zhì)尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)以青稞麩皮為原料，利用超聲浸提法提取青稞麩皮油的同時使用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，研究料液比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率以及浸提時間對青稞麩皮油脂得率的影響。隨后對青稞麩皮油抑制α-葡萄糖苷酶的能力進(jìn)行研究，并對不同提取溶劑的抑酶能力分別進(jìn)行檢測，通過酶反應(yīng)動力學(xué)方程分析其抑制機(jī)制，為青稞麩皮油脂開發(fā)為α-葡萄糖苷酶抑制劑提供了參考，并為青稞麩皮開發(fā)利用提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞麩皮，西藏拉薩；α-葡萄糖苷酶(G5003，100UN，來源于酵母)；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)；阿卡波糖；正己烷、乙酸乙酯、乙醇均為分析純；蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

AR224CN電子天平，Thermo 1510酶標(biāo)儀，Heraeus Multifuge×1R離心機(jī)，J-HH-4A恒溫水浴鍋，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，QE-200高速萬能粉碎器，KQ-250B型超聲波清洗器。

1.3 方法

1.3.1 青稞麩皮油提取工藝流程

青稞麩皮→粉碎→過篩(40目)→超聲浸提→分離→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→青稞麩皮油

1.3.2 青稞油脂提取率計(jì)算[6]

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取青稞麩皮30 g，以正己烷為提取溶劑。選擇料液比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率、浸提時間5個因素為變量，以青稞麩皮油提取率為評價指標(biāo)。通過改變其中一種因素，其他因素不變對青稞麩皮油提取工藝進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。其中各因素變量為：料液比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶6 g/mL)、超聲時間分別為(20、25、30、35、40 min)、超聲功率為(150、175、200、225、250 W)、超聲溫度分別為(25、30、35、40、45 ℃)、浸提時間分別為(4、8、12、16、20 h)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)提取3次。

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

通過分析單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲時間(A)、超聲功率(B)、超聲溫度(C)、浸提時間(D)為考查因素，以青稞麩皮油提取率為響應(yīng)值，使用Box-Behnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組合設(shè)計(jì)，采用Design Expert 8.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，優(yōu)化出青稞麩皮油最佳提取工藝。

1.3.5 青稞麩皮油抑制α-葡萄糖苷酶活性測定

青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[7]中的方法并作修改。

1.3.6 青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的動力學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)中的方法[8]，配制不同質(zhì)量濃度的青稞麩皮油實(shí)驗(yàn)組(100、50、25、10 mg/mL)與酶濃度實(shí)驗(yàn)組(4.0、2.0、1.0、0.5 U/mL)以測定不同酶濃度的反應(yīng)速度，底物濃度設(shè)置為0.5 mmol/L，每組實(shí)驗(yàn)做3次平行，以酶濃度 [E]為橫坐標(biāo)，反應(yīng)初速度 ν為縱坐標(biāo)作圖，通過圖的特征分析與酶的結(jié)合方式。青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶的抑制類型由Linewaver-Burk方法確認(rèn)[9]。用不同濃度的青稞麩皮提取物，與濃度分別為(0.125、0.25、0.5、1.0、2.5 mmol/L)的底物溶液，混勻，加入1 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液，測定α-葡萄糖苷酶抑制的反應(yīng)速率V。按 Lineweave-Burk 方程，以底物濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)繪制抑制作用動力學(xué)曲線，從而確定抑制類型。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Origin 2018軟件處理和繪圖，所有實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3次重復(fù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

如圖1所示，隨著料液比的增加，青稞麩皮油提取率增加，并在料液比為1∶5時達(dá)到最大值，但是因其增加幅度較小，因此選擇料液比為1∶4較為合適，并且不列入響應(yīng)面優(yōu)化中。在超聲時間為30 min時，青稞麩皮油提取率有明顯的增加并達(dá)到最大值。隨著超聲時間的增加，青稞麩皮油提取率出現(xiàn)降低。因此，選擇25、30、35 min為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的3個水平。在超聲功率為225 W時，青稞麩皮油提取率有明顯的增加并達(dá)到最大值。隨著超聲功率的增加，青稞麩皮油提取率出現(xiàn)降低。因此，選擇200、225、250 W為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的3個水平。在超聲溫度為30 ℃時，青稞麩皮油提取率有明顯增加并達(dá)到最大值。隨著超聲溫度的增加，青稞麩皮油提取率出現(xiàn)明顯降低。參考其他研究中的原因，發(fā)現(xiàn)溫度過高會明顯影響提取率，可能的原因?yàn)闇囟冗^高導(dǎo)致溶劑揮發(fā)，并且高溫會導(dǎo)致油脂酸敗現(xiàn)象的發(fā)生[10]，而青稞麩皮中的油含量較低，影響較為明顯。因此，選擇25、30、35 ℃為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的3個水平。在浸提時間為12 h時，青稞麩皮油提取率有明顯增加并達(dá)到最大值。隨著浸提時間的增加，青稞麩皮油提取率出現(xiàn)降低。因此，選擇8、12、16 h為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的3個水平。

圖1 料液比、超聲時間、超聲功率、超聲溫度、浸提時間對青稞麩皮油提取率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

通國單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼見表1，以青稞麩皮油提取率為響應(yīng)值(Y)，響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

續(xù)表2

2.2.1 回歸方程的建立及顯著性檢驗(yàn)

用Design Expert 12.0 軟件對實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及表2進(jìn)行多元回歸擬合，得到青稞麩皮油提取率(Y)對提取時間A、提取功率B、提取溫度C、浸提時間D的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=3.42+0.49A+0.058B+0.42C+0.057D-0.077AB-0.33AC-0.032AD-0.12BC-0.15BD-0.080CD-0.40A2-0.38B2-0.37C2-0.44D2。

對回歸方程的準(zhǔn)確性進(jìn)行方差分析，并確定各因素對青稞麩皮提取率的具體影響程度見表 3。通過分析表3數(shù)據(jù)可知，回歸方程P值小于0.01，可知回歸方程模型高度顯著，而失擬項(xiàng)P值為0.121 5，說明該回歸方程與實(shí)際擬合度較好，可用于青稞麩皮油提取實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測。一次項(xiàng)中顯著的影響因素為超聲時間(A)和超聲溫度(C)，而對提取率的影響大小依次為超聲時間(A)>超聲溫度(C)>超聲功率(B)>浸提時間(D)。二次項(xiàng)中A2、B2、C2和D2皆表現(xiàn)為極顯著。3個影響因素之間的互交作用影響中AC影響極顯著，而AB、AD、BC、BD、CD之間的互交作用影響不顯著。

表3 響應(yīng)面方差分析

2.2.2 提取工藝條件的確定及檢驗(yàn)

使用Design Expert 12.0 軟件設(shè)計(jì)優(yōu)化得出的最佳提取條件為：超聲時間30 min，超聲功率225 W，超聲溫度30 ℃，浸提時間12 h。在此條件下進(jìn)行青稞麩皮油提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值為3.62%，與理論預(yù)測值基本相符，說明該模型準(zhǔn)確，且優(yōu)化的條件正確。

2.3 青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

使用正己烷提取青稞麩皮工藝優(yōu)化后的青稞麩皮油與其他不同溶劑提取的提取物分別進(jìn)行體外α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)并以阿卡波糖作為對照。結(jié)果如圖2所示，以正己烷作為提取溶劑的青稞麩皮油抑酶作用顯著強(qiáng)于阿卡波糖。而乙酸乙酯及乙醇提取物與阿卡波糖效果相近。其中阿卡波糖IC50值為0.867 mg/mL，正己烷提取物的IC50值為0.736 mg/mL，乙酸乙酯提取物的IC50值為0.953 mg/mL，而乙醇提取物的IC50值為1.304 mg/mL。因此正己烷提取的青稞麩皮油比其他溶劑提取的青稞麩皮提取物抑酶效果更好。

圖2 不同提取溶劑對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

2.4 青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)制分析

使用工藝優(yōu)化后的青稞麩皮油對不同濃度下的α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。結(jié)果表明不同濃度的青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有線性關(guān)系，并且經(jīng)過原點(diǎn)，隨著提取物濃度的不斷增加，斜率減小。由此說明提取物并沒有改變酶的數(shù)量，而是降低了酶的活性。青稞麩皮油的抑制作用類型屬于可逆的。

圖3 青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶活性的抑制動力學(xué)曲線

青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的Lineweaver-Burk雙倒曲線如圖4所示。通過Lineweaver-Burk雙倒曲線可以確定抑制類型和抑制常數(shù)，結(jié)果表明青稞麩皮油濃度增加，直線斜率越大。而所有擬合直線相交于第一象限，說明青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶的抑制作用屬于混合競爭性抑制。

圖4 青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的 Lineweaver-Burk曲線

3 討論

目前應(yīng)用于臨床的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要為米格列醇(Miglitol)、阿卡波糖(Acarbose)和伏格列波糖(Voglibose)等，這些抑制劑具有明顯的副作用，例如患者服用后導(dǎo)致腫脹、脹氣、腹瀉和繼發(fā)性衰竭、治療效果不理想等[11]?，F(xiàn)在對α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究主要集中于從天然產(chǎn)物中篩選或者是通過化學(xué)方法合成[12]。由于青稞含有多種活性物質(zhì)，具有降血糖、降血脂、改善代謝綜合征等潛力[13]。李悅等[14]研究發(fā)現(xiàn)青稞麩皮油能夠緩解動脈硬化的小鼠癥狀，龔凌霄等[4]發(fā)現(xiàn)青稞麩皮油的α-葡萄糖苷酶抑制能力強(qiáng)于阿卡波糖，因此青稞麩皮油可作為一種潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑，但目前關(guān)于青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶作用方式和作用類型尚不明確。本文以正己烷為溶劑，對超聲波輔助提取青稞麩皮油的工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過單因素與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化出的最終結(jié)果為：超聲時間30 min，超聲功率225 W，超聲溫度30 ℃，浸提時間12 h。隨后的體外α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)表明，正己烷作為溶劑提取的青稞麩皮油效果明顯強(qiáng)于阿卡波糖，其他溶劑提取物的效果明顯不如正己烷，乙醇、乙酸乙酯和正己烷這3種溶劑中，正己烷為非極性溶劑，而乙醇極性大于乙酸乙酯。不同溶劑的抑酶效果可能與不同溶劑的極性相關(guān)，極性越小，抑酶效果越強(qiáng)，并且不同極性的溶劑提取的物質(zhì)也有不同[15,16]。因此正己烷提取的阿卡波糖可作為一種潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

通過抑制劑與酶不同的結(jié)合方式，抑制劑與酶的作用方式可分為不可逆抑制與可逆抑制[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶的抑制類型是可逆型抑制。這說明酶與抑制物結(jié)合方式屬于非共價鍵結(jié)合，而可逆抑制類型又可以分為反競爭性抑制、競爭性抑制和非競爭性抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競爭與非競爭的混合型可逆抑制。橡子仁有機(jī)溶劑萃取[18]結(jié)果表明酶抑制類型為混合型抑制，這與本研究結(jié)果類似。

本研究結(jié)果表明青稞麩皮油作為一種天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑有很大的應(yīng)用潛力，對青稞麩皮油脂肪酸成分分析[19]表明，青稞麩皮油成分復(fù)雜，推測其對α-葡萄糖苷酶作用主要為混合型抑制[4]，而這也與本研究結(jié)果相印證。但目前對青稞麩皮油的具體抑制機(jī)理研究較少，因此未來可以對此進(jìn)一步深入探索。

4 結(jié)論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化出青稞麩皮油最佳提取工藝為超聲時間30 min，超聲功率225 W，超聲溫度30 ℃，浸提時間12 h，優(yōu)化出最佳提取率為3.62%。使用該工藝處理過程簡單，提取效率增加。而之后的α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)說明青稞麩皮油的抑酶能力顯著強(qiáng)于市售阿卡波糖，并且正己烷作為溶劑提取的青稞麩皮油抑酶能力最佳，青稞麩皮油可作為一種潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑。抑制機(jī)制和酶動力學(xué)研究表明青稞麩皮油對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型為可逆的混合型抑制，其在體內(nèi)具體作用方式仍需繼續(xù)探究。