李君 胡玉霞 張夢迪 王躍武 張謙 胡格吉胡 高峰 常福厚

關(guān)鍵詞蒙藥;三子散;高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜;成分組成;結(jié)構(gòu)鑒定

三子散系蒙古族經(jīng)典名方，收載于2020 年版《中國藥典》（一部），由訶子、川楝子、梔子3 味藥材按1 ∶1 ∶1 配比組成[1]。該方具有清血熱、解毒等功效，將其制成糊狀外用還具有收斂、止痛、消炎的作用，蒙醫(yī)臨床用于溫?zé)?、血熱、眩暈、新久熱等疾病的治療[2]?，F(xiàn)有研究表明，三子散所含化學(xué)成分主要包括環(huán)烯醚萜苷類、鞣質(zhì)類、黃酮類、有機酸類等[3]，但其在疾病治療過程中發(fā)揮藥效的活性成分尚不清楚。而明確該方的化學(xué)物質(zhì)組成是闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要前提。本課題組前期采用高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)，以方中沒食子酸、阿魏酸、梔子苷、槲皮素、川楝素等10 種成分含量為指標(biāo)，通過正交實驗對三子散的醇提工藝進行了優(yōu)化[4]，并在最優(yōu)提取工藝的支撐下，通過冷凍干燥技術(shù)獲得了三子散醇提物。在此基礎(chǔ)上，本研究采用具有分析周期短、檢測靈敏度高等特點的高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（HPLC-Q-Exactive-MS）技術(shù)對三子散醇提物中的復(fù)雜化學(xué)成分進行快速在線分離與鑒定，從而為后續(xù)該方移行入血成分分析、藥動學(xué)-藥效學(xué)相關(guān)性研究等提供基礎(chǔ)，進而闡明該方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

HPLC-Q-Exactive 型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（含Ultimate 3000 型色譜儀、Q-Exactive 型高分辨質(zhì)譜儀）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;AP135W型十萬分之一電子天平購自日本Shimadzu公司;KH-500DV型數(shù)控超聲波清洗器購自昆山禾創(chuàng)超聲有限公司;2TB-A 型磁力加熱攪拌電熱套購自山東鄄城華魯電熱儀器有限公司;RE3000A型全自動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自鄭州科達機械儀器設(shè)備有限公司;FDU2110 型冷凍干燥機購自東京理化器械株式會社。

1.2 主要藥品與試劑

梔子（批號19072703，產(chǎn)地為江西）、川楝子（批號200101131，產(chǎn)地為四川）、訶子（批號20022403，產(chǎn)地為云南）飲片均購自內(nèi)蒙古北域藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥資源教研室渠弼教授鑒定分別為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis、楝科植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc.和絨毛訶子Terminaliachebula Retz. var tomentella Kurt. 的干燥成熟果實。川楝素（批號111824-201804，純度≥96.9%）、梔子苷（批號110749-201718，純度≥97.6%）、山柰酚（批號110861-202013，純度≥98.0%）、沒食子酸（批號110831-201605，純度≥98.8%）、鞣花酸（批號111959-201903，純度≥88.8%）、槲皮素（批號100081-201810，純度≥99.1%）、阿魏酸（批號110773-201914，純度≥99.0%）、蘆?。ㄅ?1020402，純度≥98.0%）、綠原酸（批號110753-202018，純度≥96.1%）9 種對照品均購自中國食品藥品檢定研究院;柯里拉京（批號DST190113-012，純度≥98.2%）、木犀草素（批號DSTDM003201，純度≥98.0%）、齊墩果酸（批號DSTDQ005101，純度≥98.0%）3 種對照品均購自成都德思特生物科技有限公司;甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸、乙酸銨均為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

采用Shim-pack GIST-HP C18 色譜柱（150 mm×4.6mm，3 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～10 min，10%A;10～15 min，10%A→30%A;15～25 min，30%A→70%A;25～30 min，70%A→90%A;30～35 min，90%A;35～40 min，10%A）;流速為1 mL/min;柱溫為40 ℃;進樣量為10 μL。

采用電噴霧離子源（ESI），在正、負(fù)離子檢測模式下檢測。正離子檢測模式下的檢測條件為：輔助氣體積流量30 L/min，噴霧電壓3.50 kV，離子傳輸管溫度300 ℃，輔助氣溫度200 ℃，碰撞能量45 eV;負(fù)離子檢測模式下的檢測條件為：輔助氣體積流量30 L/min，噴霧電壓2.80 kV，離子傳輸管溫度400 ℃，輔助氣溫度100 ℃，碰撞能量30 eV。檢測方式為Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500，掃描范圍為m/z110～1 200。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備根據(jù)前期實驗基礎(chǔ)[4]，按處方比例稱取川楝子、梔子、訶子飲片，粉碎，混勻，過60 目篩。稱取混合粉末共約180.00 g，置于圓底燒瓶中，加50%乙醇1 800 mL，用電熱套加熱回流提取3 次、每次1.5 h，分別過濾并收集濾液。合并3 次濾液，旋蒸濃縮，回收乙醇，濃縮液冷凍干燥，得到三子散醇提物凍干粉。稱取上述凍干粉1.0 g 于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度后稱質(zhì)量，超聲（功率200 W，頻率50 kHz）20 min，冷卻至室溫，再次稱定其質(zhì)量，以甲醇補足減少的質(zhì)量，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備精密稱取川楝素、梔子苷、齊墩果酸、山柰酚、沒食子酸、鞣花酸、柯里拉京、槲皮素、阿魏酸、蘆丁、木犀草素、綠原酸12 種對照品各適量，分別置于不同10 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，制成上述12 種成分質(zhì)量濃度分別為475、201、258、285、206、200、239、237、255、228、292、344 μg/mL的單一對照品貯備液。分別精密量取上述各單一對照品貯備液適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成上述12 種成分質(zhì)量濃度分別為950、402、516、570、412、400、478、474、510、456、584、688 ng/mL 的混合對照品溶液，將其置于4 ℃保存，備用。

2.3 數(shù)據(jù)庫的建立及分析

利用中國知網(wǎng)、萬方等數(shù)據(jù)庫檢索有關(guān)三子散全方及各單味藥材化學(xué)成分研究的文獻，將收集的化學(xué)成分信息進行匯總，建立一個包括化合物名稱、分子式、精確分子量、一級和多級質(zhì)譜碎片等信息的本地數(shù)據(jù)庫，從而為化合物的鑒定提供參考。將供試品溶液和對照品溶液在正、負(fù)離子模式下檢測到的質(zhì)譜信息導(dǎo)入Xcalibur3.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，利用HPLC-Q-Exactive-MS高分辨質(zhì)譜計算化合物的精確分子量，再結(jié)合保留時間、質(zhì)譜信息及Xcalibur 3.0 軟件擬合的分子式，通過與已建立數(shù)據(jù)庫中化合物信息和部分對照品質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行比對，以實際測得與理論的偏差小于10 ppm 為原則[5]，快速鑒別出三子散醇提物中所含有的固有化學(xué)成分。

3 結(jié)果

3.1 三子散醇提物的總離子流圖及成分分析

按“2.1”項下色譜-質(zhì)譜條件，對三子散醇提物進行HPLC-Q-Exactive-MS 檢測分析，獲得了三子散醇提物在正、負(fù)離子檢測模式下的總離子流圖（見圖1）。根據(jù)“2.3”項下分析方法，最終鑒定出化合物64 個，包括9 個黃酮類成分、13 個環(huán)烯醚萜類成分、14 個有機酸類成分、18 個鞣質(zhì)類成分、3 個三萜類成分、3 個氨基酸類成分和4 個脂肪酸類成分。其中，有11 個成分的結(jié)構(gòu)通過與對照品比對得到了確證。三子散醇提物化學(xué)成分的HPLC-Q-Exactive-MS鑒定結(jié)果見表1。

3.2 成分鑒定過程分析

鑒于同類成分具有相似的裂解規(guī)律，本文選取組方中主要含有的環(huán)烯醚萜類成分、黃酮類成分、有機酸類成分和鞣質(zhì)類成分為例進行成分鑒定過程分析。

3.2.1 環(huán)烯醚萜類成分在組方中共鑒定出環(huán)烯醚萜類化合物13 個。本研究以梔子苷（化合物33）為例來說明環(huán)烯醚萜類成分的結(jié)構(gòu)鑒定過程：在負(fù)離子檢測模式下可見m/z 433.133 82[M+COOH]-的準(zhǔn)分子離子峰，準(zhǔn)分子離子峰相繼脫去1 分子甲酸和1 分子中性碎片葡萄糖殘基后產(chǎn)生碎片離子峰m/z 225.077 03[M-HGlu]-，然后進一步丟失1 分子H2O得到碎片離子峰m/z207.065 87[M-H-Glu-H2O]-，隨后苷元進一步發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)產(chǎn)生碎片離子峰m/z 123.043 95。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片離子峰信息及與對照品比對結(jié)果[5，7]，確認(rèn)化合物33 為梔子苷。梔子苷對照品和化合物33 的二級質(zhì)譜（MS2）圖分別見圖2、圖3，梔子苷可能的裂解途徑見圖4。

3.2.2 黃酮類成分在組方中共鑒定出黃酮類化合物9個。本研究以蘆?。ɑ衔?9）為例來說明黃酮類成分的結(jié)構(gòu)鑒定過程：在負(fù)離子檢測模式下可見m/z609.147 22[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，并發(fā)現(xiàn)其主要二級碎片離子峰為m/z 301.034 76、m/z 300.027 80、m/z271.025 27、m/z 151.002 62，即準(zhǔn)分子離子峰通過碰撞解離丟失蕓香糖產(chǎn)生碎片離子峰m/z 301.034 76[M-HC12H20O9]-，并進一步脫去1 個氫產(chǎn)生碎片離子峰m/z300.027 80[M-H-C12H20O9-H]-，或脫去1 個中性碎片H2CO 產(chǎn)生碎片離子峰m/z 271.025 27[M - H -C12H20O9-H2CO]-，或發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)產(chǎn)生碎片離子峰m/z 151.002 62。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片離子峰信息及與對照品比對結(jié)果，確認(rèn)化合物39 為蘆丁[11]。蘆丁對照品和化合物39 的MS2圖分別見圖5、圖6，蘆丁可能的裂解途徑見圖7。

3.2.3 有機酸類成分在組方中共鑒定出有機酸類化合物14 個。本研究以綠原酸（化合物28）為例來說明有機酸類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定過程：在負(fù)離子檢測模式下可見m/z 353.087 74[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，其特征裂解途徑為結(jié)構(gòu)中酯鍵斷裂產(chǎn)生奎寧酸（quinic acid，QA）及咖啡酸（caffeic acid，CA），主要二級碎片離子峰為m/z191.055 54[QA - H] - 、m/z 179.034 23[CA - H] - 、m/z173.044 75[QA-H-H2O]-、m/z 135.044 10[CA-HCO2]-，即準(zhǔn)分子離子峰脫去咖啡酰氧基或奎尼酸基團產(chǎn)生m/z 191.055 54[QA-H]-或m/z 179.034 23[CAH]-的特征碎片離子峰，然后進一步丟失1 分子CO2或1 分子H2O 產(chǎn)生m/z 173.044 75[QA-H-H2O] - 、m/z135.044 10[CA-H-CO2]-的碎片離子峰。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與對照品的比對結(jié)果，確認(rèn)化合物28 為綠原酸[9-10]。綠原酸對照品和化合物28 的MS2圖分別見圖8、圖9，綠原酸可能的裂解途徑見圖10。

3.2.4 鞣質(zhì)類成分在組方中共鑒別出鞣質(zhì)類化合物18 個。本研究以柯里拉京（化合物30）為例來說明鞣質(zhì)類成分的結(jié)構(gòu)鑒定過程：在負(fù)離子檢測模式下可見m/z633.074 40[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，準(zhǔn)分子離子峰失去1 分子沒食子酰葡萄糖單元形成特征碎片離子峰m/z300.999 39[M-H-galloyl-glu]-，或失去1 分子葡萄糖單元和1 分子六羥基二苯甲酰基（HHDP）產(chǎn)生碎片離子峰m/z 169.013 34[M-H-glu-HHDP]-。結(jié)合化合物的分子式、裂解規(guī)律、碎片信息及與對照品比對的結(jié)果，確認(rèn)化合物30 為柯里拉京[11]?？吕锢φ掌泛突衔?0 的MS2圖分別見圖11、圖12，柯里拉京可能的裂解途徑見圖13。

4 討論

在前期預(yù)實驗中，本課題組對不同流動相體系（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸溶液）進行了考察。結(jié)果表明，在流動相中加入適量甲酸能夠明顯改變組方中成分的質(zhì)譜響應(yīng)值;而與甲醇比較，采用乙腈為流動相組成部分能夠顯著提高組方中各成分的分離度。因此，本研究采用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相體系。

由于傳統(tǒng)復(fù)方制劑中成分較多且響應(yīng)模式不盡相同，為獲得全面的質(zhì)譜信息，本研究采用正、負(fù)離子全掃描模式對三子散醇提物中的化學(xué)成分進行了辨識分析。結(jié)果，在三子散醇提物中共鑒定出64 個化學(xué)成分，以環(huán)烯醚萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類、有機酸類為主。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，環(huán)烯醚萜類成分梔子苷在抗炎、抗氧化、降壓、調(diào)脂等方面作用顯著，并具有保肝利膽的作用[17-18]。黃酮類化合物存在于多種藥用植物中，具有多重生物活性：槲皮素可通過縮小心肌梗死面積、降低心肌髓過氧化物酶活力而發(fā)揮心肌保護作用[19];蘆丁具有顯著的抗炎活性，且該作用可能與其減少促炎細胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)[20]。鞣質(zhì)類成分大多具有抗真菌及抗腫瘤活性，同時對結(jié)腸癌、肝癌和宮頸癌細胞均表現(xiàn)出了一定的抑制作用[11]。此外，本研究還鑒定出了多種有機酸類成分，其在心血管相關(guān)疾病方面作用廣泛：蘋果酸可提高琥珀酸脫氫酶、細胞色素氧化酶活性，增加腺苷三磷酸合成，進而保護心肌細胞的完整性[21];沒食子酸具有較強的抗氧化活性，對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌梗死模型大鼠有較好的心臟保護作用[22];綠原酸對中輕度高血壓患者具有降壓作用，這可能與其抑制活性氧的過量產(chǎn)生、降低氧化應(yīng)激有關(guān)[23]。在鑒定出的三萜類成分中，熊果酸和齊墩果酸可通過抑制血管平滑肌細胞的異常增殖和遷移而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[24]。

綜上，本研究采用HPLC-Q-Exactive-MS 技術(shù)對三子散醇提物的化學(xué)成分進行了系統(tǒng)、快速、全面的定性研究，所鑒定出的多種化合物可能是三子散發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，但仍需進行進一步的藥效學(xué)驗證。