王佩文，歐陽耀文，劉原鋮，周良芹，羅祥林,2

(1.四川大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)院；2. 高分子材料工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（四川大學(xué)），四川 成都 610065)

近年來，光動力（PDT）-光熱（PTT）治療開始應(yīng)用于抗微生物感染。PDT 和PTT 殺菌是光敏劑經(jīng)近紅外光照射后產(chǎn)生大量的熱與活性氧分子（ROS），通過物理方式PTT 或化學(xué)損傷PDT 對細(xì)菌進(jìn)行殺傷。而且，光動-光熱聯(lián)合治療比單一方式具有更好的治療效果[1]。光照殺菌因其獨(dú)特的殺菌機(jī)理，殺菌過程并不會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[2]；并且具有精準(zhǔn)可控等優(yōu)點(diǎn)，因而受到研究者們的廣泛關(guān)注。

細(xì)菌細(xì)胞壁帶有負(fù)電荷，細(xì)菌感染的部位通常呈微酸性，最低可達(dá)pH 5.5 左右[3]。當(dāng)聚合物載體中有可以質(zhì)子化的官能團(tuán)，如叔氨基單元，在細(xì)菌感染部位的微酸環(huán)境中質(zhì)子化后轉(zhuǎn)變?yōu)檎娀鶊F(tuán)，與表面帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞壁之間產(chǎn)生正負(fù)電荷作用，從而靶向細(xì)菌，這樣的載體可以提高殺菌效率[4]。因此，本文設(shè)計(jì)并合成了帶叔氨官能團(tuán)的pH 敏感兩親嵌段聚合物，聚乙二醇單甲醚-b -聚(2-（二乙氨基）甲基丙烯酸乙酯)和聚乙二醇單甲醚-b-聚（甲基丙烯酸羥乙酯-co-甲基丙烯酸二乙氨基乙酯）（分別記為PD 和PHD），選用IR780 碘化物為模型光敏劑進(jìn)行光照殺菌研究。IR780 吸收近紅外光后可進(jìn)行光熱轉(zhuǎn)化并釋放ROS，常用于PDT、PTT 治療和熒光成像[5]。目前，以IR780 為光敏劑進(jìn)行光照殺菌的研究較少。另外，在光照過程中IR780 存在光漂白現(xiàn)象[6]。因此，在使用PD 和PHD 膠束包載IR780的同時引入一種能清除自由基的白藜蘆醇（RES）[7～9]來保護(hù)光敏劑的分子結(jié)構(gòu)，使IR780 具有更多次的光響應(yīng)效果[10]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與試劑

聚乙二醇單甲醚（mPEG,Mn=5000）、甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA）、2-溴異丁酰溴（BIBB）、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯（DEA）、白藜蘆醇（RES）：均購于Aladdin；3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化銨（MTT）：購自Sigma（美國）；IR 780 碘化物（Alfa Aesar）、2,2- 聯(lián) 吡 啶（Bpy, 99%）、溴 化 銅（CuBr2, 99%）、二苯基異苯并呋喃（DPBF）：分析純，購于成都科龍化學(xué)試劑有限公司；四氫呋喃（THF）：在使用前通過鈉回流純化，購于成都科龍化學(xué)試劑有限公司；三乙胺（TEA）、二氯甲烷（CH2Cl2）：經(jīng)CaH2減壓蒸餾提純后使用，購于成都科龍化學(xué)試劑有限公司；金黃色葡萄球菌（S.aureus，ATCC 29213）和 大 腸 桿 菌（E.coli，ATCC 25922）：均來自華西醫(yī)院；L929 細(xì)胞和HUVEC 細(xì)胞：均來自華西醫(yī)院，分別在RPMI 1640 培養(yǎng)基和DMEM 培養(yǎng)基中加入10 %胎牛血清（FBS）和1 %青霉素/鏈霉素溶液并于37 ℃含5 % CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 材料的合成

以mPEG-Br 為大分子引發(fā)劑引發(fā)HEMA 和DEA 混合物或DEA 反應(yīng)合成PHD 和PD。

1.2.1 mPEG-Br的合成：將60 ℃真空干燥的mPEG-OH（10.0 g，2.0 mmol）溶解于12 mL CH2Cl2中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入三乙胺（0.556 mL，2.0 mmol），置于冰-乙醇浴中充分?jǐn)嚢?。通過恒壓滴液漏斗加入溶解于4 mL 干燥CH2Cl2的BIBB（0.494 mL，2.0 mmol），滴加速度為每秒1～2 滴。滴加完后繼續(xù)攪拌30 min。移除冷卻浴后繼續(xù)反應(yīng)36 h。濾去不溶性鹽，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮溶液。產(chǎn)物用冰乙醚沉淀純化，真空干燥。

1.2.2 PHD 和PD 的合成：大分子引發(fā)劑mPEG-Br通過ATRP 反應(yīng)引發(fā)HEMA 與DEA 共聚合成PHD。在Schlenk 瓶 中 加 入mPEG-Br（1.0 g，0.192 mmol），單 體DEA（0.355 g，1.192 mmol），HEMA（0.249 g，1.192 mmol）和 Bpy（46.5 mg，0.298 mmol）。抽真空-通氮?dú)廪D(zhuǎn)換3 次后，加入混合溶劑（甲醇、水的體積比1:1）7 mL，通入氮?dú)?0 min 除去氧氣。最后在氮?dú)鈿夥障孪騍chlenk 瓶中加入CuBr（0.017 g，0.192 mmol），迅速密封瓶口，常溫?cái)嚢琛?4 h 后混合物移入截留分子量3500 的透析袋，純水透析48 h，冷凍干燥24 h 得到產(chǎn)物。合成PD 的過程和步驟完全與上面一致，只是不加單體HEMA。

1.3 聚合物的表征

核磁共振氫譜在德國Bruker 核磁共振波譜儀上測定（400 Hz），采用V(CDCl3)∶V(CD3OD)= 1:1 為溶劑。紅外測試采用溴化鉀壓片法，在美國Nicolet Magna560 傅里葉變換紅外光譜儀上測得，掃描波長范圍為500～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.4 聚合物膠束的制備

采用透析法制備膠束。將10 mg PHD 或PD 溶解于2 mL THF 中，將其逐滴加入6 mL 超純水中。加入完畢后搖勻，超聲30 min 并將其裝入截留分子量為3500 的透析袋中，透析24 h。定容至10 mL，以3500 r/min 離心10 min，取上層清液保存于4 ℃冰箱中備用。載藥膠束的制備方法基本同上，只是在材料溶解的過程中加入IR780 和RES 形成均勻溶液，并保持透析過程避光。

1.5 膠束測試和表征

1.5.1 膠束粒徑及粒徑分布和載藥量分析：膠束粒徑和粒徑分布采用動態(tài)光散射法（DLS）檢測（Malvern Zetasizer Nano Series）,測試角度173 °，溫度25 ℃。

用紫外光譜法測定載藥量（DLC）。將200μL載藥膠束添加到1.8 mL THF 溶劑中并通過式（1）、式（2）進(jìn)行計(jì)算

式中：EE—包封率，%；m1—載藥膠束中藥物的質(zhì)量, g；m2—載藥膠束的總質(zhì)量, g；m3—投遞藥物的總質(zhì)量, g。

由于IR780除了在780 nm有強(qiáng)吸收外，在300～400 nm也存在一定程度上的紫外吸收，與RES（310 nm）在此處的紫外吸收有部分重疊。故需用紫外分光光度計(jì)測定IR780 在310 nm 和780 nm 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由IR780 在780 nm 處的紫外擬合曲線測算出IR780 的濃度后，反推算出IR780 在310 nm 處的紫外吸收強(qiáng)度。由總的紫外吸收強(qiáng)度減去IR780 在310 nm 處的紫外吸收強(qiáng)度后，再由RES 的紫外吸收強(qiáng)度-濃度擬合曲線換算出RES 的濃度。

1.5.2 膠束的形貌表征：膠束形貌采用透射電子顯微鏡（TEM）觀察。將濃度1 mg/mL 的膠束滴加在銅網(wǎng)上，待其蒸發(fā)后，滴加磷鎢酸染色2.5 min 后即可測試。

1.6 載藥膠束光熱-光動測試

1.6.1 光熱測試：用超純水將載藥的PD 及PHD 膠束稀釋至IR780 濃度為50μg/mL 的溶液，取100μL上述溶液加入離心管中并使用2 W/cm2的808 nm 激光器照射30 s，同時用紅外探頭檢測溫度變化。照射結(jié)束后冷卻至室溫，重復(fù)上步實(shí)驗(yàn)步驟。分別將100μL上述溶液在離心管中直接照射5 min，并記錄溫度變化。

1.6.2 光動測試：取400μL上述2 種膠束溶液加入離心管中，每種膠束分成3 組并逐個加入30μL DPBF溶液，分別記為L1，L3，L4，于常溫避光條件下分別用808 nm 激光器照射1 次、3次和4次，每次持續(xù)30 s。加入超純水定容至2 mL，用紫外分光光度計(jì)測量其在350～950 nm 范圍的紫外吸收變化。

1.7 RES 清 除ROS 檢 測

配制IR780:RES 濃度比為1:2/1:4/1:10/1:20 的系列溶液，并設(shè)定其中的IR780 濃度為50μg/mL。將DPBF 6 mg 溶解于2 mL DMF 中，在上述的IR780:RES 溶液400μL中加入30μL DPBF 溶液。在室溫避光條件下，使用808 nm 激光器分別對IR780:RES系列溶液光照30 s 和60 s。然后加入DMF 定容至2 mL，用紫外分光光度計(jì)測量其在350～950 nm 范圍的紫外吸收變化。

1.8 R780 及RES 的π-π堆疊效應(yīng)驗(yàn)證

取200μL PD 及PHD 載藥膠束分別以THF 及超純水稀釋至2 mL，用紫外分光光度計(jì)檢測250～950 nm 范圍的紫外吸收變化。

Fig.11H-NMR spectra of mPEG-Br(A),PHD(B)and PD(C)in V(CDCl3):V(CD3OD)=1:1,and their infrared spectra(D)

配制10μg/mL 的IR780 及RES 的THF 溶液及其兩者的混合溶液。采用熒光分光光度計(jì)檢測，激發(fā)波長為730 nm。

1.9 平板抗菌測試

使用106CFU/mL 的金黃色葡萄球菌液和大腸桿菌液，采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算抗菌率。 將PD@IR780&RES 和PHD@IR780&RES 用超純水稀釋至IR780 的濃度為50μg/mL 的溶液，每種膠束分成3組，記為L-1，L2-1，L3-1（L2-1 和L3-1 在與菌液混合前分別進(jìn)行2 次和3 次808 nm 激光器照射30 s，每次照射結(jié)束后冷卻5～10 min 再進(jìn)行下一次的光照。然后將L-1，L2-1 和L3-1 分別與同體積的106CFU/mL 的菌液混合，并用808 激光器照射30 s）。取光照后的溶液10μL加至瓊脂板上涂勻，培養(yǎng)12 h，檢驗(yàn)殺菌效果。同時以空白膠束、載藥非光照膠束以及106CFU/mL 的菌液與無菌水同體積混合液作為對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物表征

兩親嵌段聚合物PHD 及PD 的合成是以mPEG-Br為大分子引發(fā)劑，通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）引發(fā)HEMA 和DEA 混合物或DEA 反應(yīng)合成的。目標(biāo)產(chǎn)物和大分子引發(fā)劑的核磁共振波譜和紅外光譜如Fig.1 所示。

相比于大分子引發(fā)劑的譜圖（Fig.1A），F(xiàn)ig.1B中δ3.80 處c 峰（—COOCH2CH2OH）和δ4.08 處d 峰（—COOCH2CH2OH）的出現(xiàn)，表明HEMA 的ATRP 反應(yīng)成功。同時，δ2.65 處g 峰（—CH2N(CH2CH3)2）和δ1.11 處h 峰（—CH2N(CH2CH3)2）的出現(xiàn)，表明DEA 也成功共聚到產(chǎn)物中。δ3.40 處a 峰（CH3OCH2CH2O—）分別與δ3.80 處c 峰（—COOCH2CH2OH）和δ1.11 處h 峰（—CH2N(CH2CH3)2）積分，積分比為1∶50∶56，換算后得HEMA 聚合度為76，DEA 聚合度為28。Fig.1C 中，δ2.70 處d 峰（—COOCH2CH2N—），δ2.57處e 峰（ —CH2N(CH2CH3)2）以 及δ1.04 處f 峰（—CH2N(CH2CH3)2）的出現(xiàn)表明PD 的合成成功，DEA 的聚合度為28。

紅外譜圖中，1726 cm-1處—C=O 伸縮振動吸收峰歸屬于聚乙二醇單甲醚酯；在3446 cm-1處—OH的伸縮振動吸收峰的出現(xiàn)，以及1281 cm-1處—C—N伸縮振動吸收峰的出現(xiàn)，表明以mPEG-Br 為大分子引發(fā)劑的HEMA 和DEA 的ATRP 反應(yīng)成功。同理，PD 也出現(xiàn)了1281 cm-1處—C—N 伸縮振動吸收峰。綜上，目標(biāo)產(chǎn)物合成成功。

2.2 聚合物膠束性質(zhì)

PHD 及PD 膠束的粒徑及其分布、TEM 及其臨界膠束濃度（CMC）曲線如Fig.2 所示。

Fig.2 Particle size distribution and TEM (a, b), CMC curves (c, d) of PD and PHD micelles

DLS 結(jié) 果 顯 示，PD 和PHD 為 單 峰 分 布。TEM顯示，2 種膠束都具有類球形典型的殼核結(jié)構(gòu)，但它們的粒徑大小與DLS 測得的結(jié)果（Tab.1）有所不同。CMC 結(jié)果顯示，PD 膠束的CMC 值比PHD 膠束的CMC 值小，分別為7.76μg/mL 和44.67μg/mL，這可能是因?yàn)镠EMA 與DEA 無規(guī)共聚使膠束結(jié)構(gòu)中的疏水部分P(HEMA-DEA)的疏水性降低，因而膠束PHD 不 如PD 穩(wěn) 定。

Tab. 1 Properties of blank micelles

如Tab.1所示，PD和PHD的平均粒徑在120～150 nm，且粒徑分布較窄，PDI 均在0.21 以下；pH 7.4 的表面電荷為+16～+19。正Zeta 電位是由于DEA 部分質(zhì)子化，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[11,12]。膠束表面正電荷有利于膠束通過靜電相互作用靶向細(xì)菌以及被細(xì)菌攝入。DLS 測得的是膠束的水合粒徑，PD 和PHD 是水溶性較好的聚合物，所以水合粒徑大于TEM 觀察到的粒徑。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PD 或PHD 單獨(dú)包載IR780 或RES時，其載藥量均較低。例如，PD 包載IR780（投藥量為1 mg），IR780 的濃度僅有6.54μg/mL。當(dāng)同時載IR780 和RES，則表現(xiàn)出不同的性質(zhì)，如Tab.2 所示。當(dāng)IR780:RES=1: 4 時，2 種藥物在PD 膠束中的濃度接近1: 1，而在PHD 膠束中IR780 的濃度高于RES。隨著RES 投藥量增大，在膠束溶液中IR780藥物濃度略微增加并在IR780 與RES 的比例為1:10時達(dá)到最大。該比例下，2 種膠束中RES 的藥物濃度比為1: 4 比例時RES 的藥物濃度的4 倍還多。2種載藥膠束也在1: 10 呈現(xiàn)出IR780 和RES 最高載藥量和包封率，此時的PDI 分別為0.27 和0.17。2 種藥物不同投藥比得到的載藥膠束的粒徑及其分布如Fig.3 所示。可以看到，IR780 與RES 比例為1: 4 或1: 10 時，2 種載藥膠束均為單峰分布。1:10 的TEM 顯示，2 類載雙藥膠束均呈現(xiàn)球形結(jié)構(gòu)。故選取該比例時的2 種載藥膠束用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Tab. 2 Properties of two kinds of micelles with different dosage ratios

Fig.3 Particle size distribution curves of (a) PD@IR780&RES and (b) PHD@IR780&RES drug loaded micelles with different dosage ratios TEM showed the morphologies of two kinds of micelles with the ratio of 1:10

2.3 IR780 及RES 的 驗(yàn) 證

雙載藥膠束載藥量顯著提高可能是IR780 與RES 之間存在π-π堆疊效應(yīng)。為了驗(yàn)證這種推測，將膠束分別用超純水和THF 稀釋并以IR780 的THF溶液為對照，測定紫外和熒光光譜（Fig.4）。結(jié)果顯示，π-π堆疊效應(yīng)PD@IR780&RES 在THF 中紫外吸收有藍(lán)移現(xiàn)象，但是在水溶液中與IR780 的THF 溶液相比并沒有位移，只是峰型變寬（Fig. 4a）。PHD@IR780&RES 則在THF 中并沒有明顯的位移現(xiàn)象，而水溶液中則表現(xiàn)出一定的紅移，峰型同樣也變寬（Fig. 4b）。這些位移現(xiàn)象表明RES 與IR780 具有π-π堆疊效應(yīng)。RES 與IR780 在THF 中混合后的熒光效果如Fig.4C 所示，在780 nm 處的吸收峰相比于純IR780 明顯藍(lán)移，說明兩者間確實(shí)存在π-π堆疊。

Fig.4 UV absorption spectra of IR780,blank micelles and drug loaded micelles(a,b);fluorescence spectra of IR780,RES and IR780+RES(c)

2.4 光照過程中ROS 的產(chǎn)生和清除

為了驗(yàn)證RES 清除ROS 的能力，加入活性氧探針DPBF 至不同比例的RES/IR780 溶液中，測定光照30 s 的紫外吸收，結(jié)果如Fig.5 所示。

冰浴、光照IR780/RES 溶液，各圖譜的紫外吸收峰峰值沒有發(fā)生太大變化，說明IR780 的分子結(jié)構(gòu)未被破壞。文獻(xiàn)報(bào)道[6]，IR780 的光漂白機(jī)理是光照產(chǎn)生的ROS 加成至IR780 分子的雙鍵上形成中間體，然后在熱的作用下分解。由于沒有熱，光照的條件即使產(chǎn)生了ROS，也基本不會造成IR780 分子結(jié)構(gòu)破壞。而室溫下，IR780/RES 組在DPBF 的415 nm 處的峰以及IR780 在780 nm 處的吸收峰均比純IR780 溶液的峰值更大，且隨著RES 量的增大，效果越好（Fig.5b）。當(dāng)光照時間從30 s 變?yōu)?0 s，純的IR780 溶液在415 nm 處的吸收峰進(jìn)一步降低，表明光照產(chǎn)生了更多ROS（Fig.5c）。同時，780 nm 處的紫外吸收峰均比純的IR780 溶液高，表明RES 確實(shí)能夠通過吸收一部分ROS 來保護(hù)IR780 的分子結(jié)構(gòu)。

Fig. 5 UV absorption spectra of different proportions of IR780/ RES solution under illumination

2.5 載藥膠束ROS 測試

在載藥膠束溶液中加入DPBF，測定不同光照次數(shù)后的紫外波譜圖（Fig.6）。隨著光照次數(shù)的增加，DPBF 和IR780 的吸收峰降低，說明產(chǎn)生的ROS更多（DPBF 峰下降），同時更多IR780 分子被破壞（IR780 峰下降）。2 種載藥膠束相比，光照后PD@IR780&RES 在415 nm 處的DPBF 吸收峰強(qiáng)度仍然略高于PHD@IR780&RES，L3 和L4 時，有較為明顯的差異，這表明膠束包載了更多的RES 的確更有利于清除ROS。

Fig.6 UV absorption spectra of the IR780/ RES loaded micelles added with DPBF before and after NIR laser irradiation

2.6 載藥膠束光熱性能

Fig.7 是 載 藥 膠 束（PD@IR780&RES 以 及PHD@IR780&RES）的光熱循環(huán)曲線和稀釋液的光熱曲線。

Fig.7 Photothermal cycling curves of two drug loaded micelles under 30 s illumination(50 μg/mL)(a，b)and photothermal curves under 5 min illumination after dilution(c,d)

載藥膠束顯示了良好的光熱循環(huán)，第4 次以及第5 次光照時仍具有一定的光熱效果（Fig.7a，F(xiàn)ig.7b）。這是由于膠束中的RES 在一定程度保護(hù)了IR780。對比2 種載藥膠束的光熱效果，從第3 次光照開始，PD 膠束明顯地優(yōu)于PHD 膠束，這可能是由于前者具有更高的RES 載藥量，因而更好地保護(hù)了IR780 的分子結(jié)構(gòu)。載藥膠束及稀釋液光照5 min 的光熱曲線顯示（Fig.7c, Fig.7d），2 種載藥膠束隨稀釋倍數(shù)增加，能夠達(dá)到的最高溫度下降，但均高于純水光照的最高溫度。PD@IR780&RES 光熱曲線的最大值達(dá)到95 ℃，而PHD@IR780&RES 是82 ℃，因此，PD@IR780&RES 確實(shí)具有更優(yōu)的光熱效果。

2.7 載藥膠束抗菌性能

載藥膠束對S.aureus和E.coli的平板抗菌結(jié)果如Fig.8 所示。激光器照射30 s 并不影響2 種細(xì)菌的生長?？瞻啄z束與沒光照的載藥膠束的情況類似，對S.aureus和E.coli都有一定的殺菌作用，抗菌率分別為60 % 和20 %。對S.aureus更好抗菌效果源于細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分酸性多糖磷壁酸能夠與膠束的陽離子結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。引人注目的是，載藥膠束光照殺菌率均在99 %以上（L-1 組）。說明PD@IR780&RES 及PHD@IR780&RES 中包載的光敏劑IR780 具有顯著的光照殺菌性能。

Fig.8 Light sterilization effect of drug loaded micelles on S.aureus(a)and E.coli(b)and growth of bacteria on agar plate(c)

從前面的結(jié)果可以看到，光照過程中盡管RES對IR780 的結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用，然而依然部分地破壞了IR780 分子。為了驗(yàn)證近紅外光照（NIR）后的載藥膠束是否還具有足夠的殺菌性，測定了預(yù)先光照2 次和3 次的載藥膠束的光照殺菌（L2-1 和L3-1）能力，結(jié)果顯示，它們的殺菌效果依然良好，高于99%。這也意味著，載IR780/RES 的膠束光照既可以殺死革蘭氏陽性菌也可以殺死革蘭氏陰性菌，而且還可以用于多次光照殺菌。Fig.8 C 直觀地展示了瓊脂板上細(xì)菌的生長情況。

3 結(jié)論

本文成功合成了具有細(xì)菌微環(huán)境響應(yīng)性的兩親嵌段聚合物PHD 和PD，并將其制備成聚合物膠束用于包載IR780 和RES，進(jìn)行了載藥膠束的光照抗菌研究。PHD 和PD 均能夠在水溶液中形成球形聚合物膠束，膠束表面電荷都呈現(xiàn)正電。PHD 和PD 都能夠同時包載IR780 和RES，而且膠束包載雙藥的載藥量遠(yuǎn)高于單獨(dú)包載IR780 或RES 的載藥量。通過改變投藥比例制備得到了含RES 最高的載藥膠束。紫外光譜驗(yàn)證了RES 可以改善IR780 的光 漂 白 現(xiàn) 象 。 在 PD@IR780&RES 或 者PHD@IR780&RES 中，RES 依然可以對光照的IR780起保護(hù)作用，并且，前者的光熱循環(huán)效果更優(yōu)一些。瓊脂平板抗菌結(jié)果顯示，2 種載藥膠束可以重復(fù)光照殺菌，殺菌效果良好。