馮春燕 唐宋文 黃秀榕▲ 祁明信 胡艷紅

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院眼科，福建福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州 350003

研究發(fā)現(xiàn)雌激素對晶狀體有保護(hù)作用，可減輕晶狀體氧化損傷、抑制晶狀體上皮細(xì)胞（lens epithelial cell，LEC）凋亡，起到防治白內(nèi)障的作用[1-6]。 富含植物雌激素的中藥，如補(bǔ)骨脂、牛膝、葛根等具有雌激素樣活性[7]，在抗癌、預(yù)防心腦血管疾病等方面，具有雌激素不可替代的很多優(yōu)點(diǎn)。金雀異黃素（genistein，GEN）又名染料木黃酮，是一種來源于豆類植物的異黃酮類化合物，其化學(xué)名為5，4，7-三羥基異黃酮。 它是有芳香環(huán)的三苯基異黃酮化合物，帶有兩個酚羥基的結(jié)構(gòu)類似于雌二醇（β-estradiol，E2），分子量為270，能低親合力地結(jié)合雌激素受體（estrogen receptor，ER），具有微弱雌激素樣作用，其生物效應(yīng)相當(dāng)于E2的10-5～10-3，故有植物雌激素之稱[8]。

課題組前期工作發(fā)現(xiàn)GEN 能夠保護(hù)實(shí)驗(yàn)性人晶狀體上皮細(xì)胞系（human lens epithelial cell B3，HLEB3）氧化損傷和減輕細(xì)胞凋亡程度[9-11]。本研究擬在探討具有雌激素活性的中藥單體GEN 防護(hù)HLE-B3 氧化損傷的基礎(chǔ)上，采用表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜（surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）聯(lián)合蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測分析GEN 作用于氧化損傷的HLE-B3 后線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變，尋求其防護(hù)HLE-B3 氧化損傷的線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)規(guī)律及作用靶點(diǎn)，為臨床尋求防治老年性白內(nèi)障的安全有效天然藥物提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HLE-B3 細(xì)胞由廣州中山大學(xué)眼科研究中心提供；E2粉末（Sigma，美國，純度97%），GEN 粉末（國家藥品生物制品檢定所，中國，純度96.3%），30%過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2，上海試劑總廠，中國），DMEM 培養(yǎng)基（DMEM，GIBCO，美國），線粒體分離試劑盒（試劑A 和試劑C，Pierce，USA）和線粒體蛋白質(zhì)分離試劑盒（星漢生物科技有限公司，中國）。 自動酶標(biāo)讀數(shù)儀（BioTek ELX808，美國）；PBS Ⅱ+型SELDITOF-MS 及Bio-processor 96 孔蛋白質(zhì)芯片工作平臺（美國）；Biophotometer 6131 蛋白核酸測定儀 （德國）；常溫離心機(jī)（Heraeus Inc.，德國）；低溫離心機(jī)（Beckman Coulter Avanti J-20，德國）。

1.2 方法

1.2.1 HLE-B3 培養(yǎng)及傳代 ①將凍存細(xì)胞的凍存管立即放入37℃水中解凍，將細(xì)胞懸浮液在培養(yǎng)基中稀釋10 倍，離心半徑10 cm，以1000 r/min 離心5 min，去上清，然后磷酸鹽緩沖液洗滌3 次。 ②以5×105個/ml細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中， 并在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 ③待2～3 d 細(xì)胞生長融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 分組 將HLE-B3 分為四組，正常組、H2O2組、E2組 和GEN 組。 正常組：HLE-B3+DMEM 培 養(yǎng)液；H2O2組：HLE-B3+DMEM 培養(yǎng)液+H2O2（終濃度300 μmol/L）；E2組：HLE-B3+DMEM 培養(yǎng)液+H2O2（終濃度300 μmol /L）+E2（終濃度×10-8mol/L）；GEN組：HLE-B3+DMEM 培養(yǎng)液+H2O2（終濃度300 μmol/L）+GEN（終濃度×10-6mol/L）。

1.2.3 SELDI-TOF-MS 聯(lián)合蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測HLE-B3 線粒體蛋白質(zhì)組的變化 ①收集2×107個細(xì)胞于2.0 ml 微量離心管A，離心半徑15 cm，2259 r/min，2 min，棄上清；②加800 μl 線粒體分離試劑A 于離心管A，漩渦5 s，冰上孵育2 min；③細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)于冰冷的杜恩斯組織研磨器充分勻漿細(xì)胞，然后勻漿液移到原離心管A 中，加800 μl 線粒體分離試劑C 和200 μl線粒體分離試劑A，混勻，離心半徑15 cm，2050 r/min，10 min，4℃；轉(zhuǎn)上清液于離心管B，離心半徑15 cm，4244 r/min，15 min，4℃；轉(zhuǎn)上清液于離心管C，加500 μl線粒體分離試劑C，離心半徑15 cm，8490 r/min，5 min，4℃，棄上清，所得沉淀即為HLE-B3 線粒體。 ④加200 μl 線粒體蛋白質(zhì)提取試劑，4℃振蕩15 min，混合，離心半徑15 cm，8490 r/min，15 min，4℃。 提取上清液后，測定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整為5 mg/ml。 ⑤每個線粒體蛋白樣品與CM10 芯片組合，每個處理組的芯片上有3 個點(diǎn)。向每個樣品點(diǎn)加入結(jié)合緩沖液（50 mmol/L乙酸鈉，pH 值4.0，3 μl），浸泡3 次，每次5 min。 取出緩沖液，立即加入5 μl 緩沖液，將蛋白質(zhì)樣品稀釋至1.8 mg/ml。 在室溫下1 h 后，除去緩沖液，每個斑點(diǎn)加入3 μl 結(jié)合緩沖液，5 min 后除去，該過程重復(fù)3 次。將HPLC 級水（3 μl）加入每個斑點(diǎn)，然后立即除去，該程序重復(fù)2 次。 ⑥芯片風(fēng)干20 min，加入能量吸收分子SPA 溶液，然后空氣干燥，采用統(tǒng)一分析參數(shù)，激光強(qiáng)度設(shè)置為185， 檢測靈敏度為7， 檢測上限為100 000 質(zhì)荷比，優(yōu)化采集數(shù)據(jù)范圍為2000～20 000 m/z，信號采集位置為20～80，每個樣本平均有144 個點(diǎn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用Proteinchip 軟件3.2 以xlm 格式導(dǎo)出初始數(shù)據(jù)。SELDI-TOF-MS 數(shù)據(jù)以為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。 浙江大學(xué)癌癥研究所設(shè)計的ZUCI-Protein Chip數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計分析。通過統(tǒng)計過濾結(jié)合模型依賴性篩選的方法選取特征向量。 通過Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)分析每個質(zhì)荷比。 通過Nemenyi 檢驗(yàn)對四組中質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)峰值進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義[12]。

2 結(jié)果

2.1 H2O2 對HLE-B3 線粒體蛋白質(zhì)組的影響

經(jīng)H2O2作用的HLE-B3 在CM10 芯片結(jié)合的蛋白點(diǎn)有50 個， 其中質(zhì)荷比為6532 和6809 的2 個蛋白點(diǎn)的峰值高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1、圖1～2）。

表1 H2O2 對HLE-B3 線粒體蛋白質(zhì)組的影響（n=3，±s）

表1 H2O2 對HLE-B3 線粒體蛋白質(zhì)組的影響（n=3，±s）

6532 6809 107.76±70.84 109.59±31.19 1460.72±267.57 522.09±200.20+13.6+4.8質(zhì)荷比 峰值改變倍數(shù)平均峰值正常組 H2O2 組

2.2 E2 對H2O2 誘導(dǎo)氧化損傷的HLE-B3 線粒體蛋白質(zhì)組的影響

經(jīng)E2作用于H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HLE-B3 在CM10 芯片結(jié)合的蛋白點(diǎn)有46 個，其中質(zhì)荷比為6532的蛋白點(diǎn)的峰值（519.59±138.72）低于H2O2組的（1460.72±267.57），為H2O2組的2.8 倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.3 GEN 對H2O2 誘導(dǎo)氧化損傷的HLE-B3 線粒體蛋白質(zhì)組的影響

經(jīng)GEN 作用于H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HLE-B3在CM10 芯片結(jié)合的蛋白點(diǎn)有49 個，其中質(zhì)荷比為6532 和6809 這2 個蛋白點(diǎn)的峰值低于H2O2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2、圖4～5）。

表2 GEN 對H2O2 誘導(dǎo)氧化損傷的HLE-B3 線粒體蛋白質(zhì)組的影響（n=3，±s）

表2 GEN 對H2O2 誘導(dǎo)氧化損傷的HLE-B3 線粒體蛋白質(zhì)組的影響（n=3，±s）

6532 6809 1460.72±267.57 522.09±200.20 420.22±449.56 109.98±59.92-7.6-4.7質(zhì)荷比 峰值改變倍數(shù)平均峰值H2O2 組 GEN 組

3 討論

Nordgaard[13]從人眼庫的眼球中分離出視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的線粒體蛋白質(zhì)，經(jīng)雙向電泳，質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD) 較正常組有八個差異表達(dá)蛋白位點(diǎn)，提示AMD 的發(fā)生與線粒體功能障礙有關(guān)。 Saraswathy等[14]發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜線粒體蛋白水平在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveoretinitis，EAU）早期階段對氧化應(yīng)激的反應(yīng)。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：GEN 可提高由H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HLE-B3 內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，降低膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（malonaldehyde，MDA）的含量，以及升高線粒體膜電位，表明GEN 發(fā)揮了雌激素樣作用，能夠保護(hù)實(shí)驗(yàn)性HLE-B3 氧化損傷和減輕細(xì)胞凋亡程度[11-13]。

本實(shí)驗(yàn)H2O2組檢測到的蛋白點(diǎn)有50 個，E2組檢測到的蛋白點(diǎn)有46 個，GEN 組檢測到的蛋白點(diǎn)有49個。其中，用H2O2誘導(dǎo)HLE-B3 氧化損傷后，出現(xiàn)質(zhì)荷比為6532 和6809 兩個差異的蛋白點(diǎn)表達(dá)均上調(diào)；E2作用于氧化損傷的HLE-B3 后， 出現(xiàn)質(zhì)荷比為6532 蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)；GEN 作用于氧化損傷的HLE-B3 后，出現(xiàn)質(zhì)荷比為6532 和6809 兩個蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。說明GEN 在防護(hù)由H2O2所致HLE-B3 氧化損傷的同時，也引起HLE-B3 線粒體差異蛋白的表達(dá)，質(zhì)荷比為6532 的蛋白點(diǎn)可能是GEN 防護(hù)H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3 氧化損傷的重要的作用靶點(diǎn)。 質(zhì)荷比為6532的蛋白點(diǎn)在Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫中檢索的匹配蛋白質(zhì)，明確與人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡、細(xì)胞氧化損傷和老年性白內(nèi)障相關(guān)的蛋白質(zhì)只有一種，即40S 核糖體蛋白S29（ribosomal protein S29，RPS29）。

線粒體核糖體蛋白（mitochondrial ribosomal pro teins，MRPs）是線粒體核糖體（mitochondrial ribosome）的重要組成部分，其中任何一種發(fā)生突變或缺失也會影響到線粒體蛋白的合成而導(dǎo)致線粒體疾病。MRPs 有兩個亞基：大亞基MRPL（60S）和小亞基MRPS（40S）[15]。 Zhang 等[16]發(fā)現(xiàn)編碼MRPL21、L15、L13a 和L7a 的基因的表達(dá)在老年性白內(nèi)障患者晶狀體中表達(dá)均較正常晶狀體中下降，結(jié)果表明核糖體蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白合成和（或）介導(dǎo)細(xì)胞其他功能和老年性白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)。

線粒體核糖體蛋白S29（mitochondrial ribosomal protein S29，MRPS29）是線粒體核糖體小亞基的一種40S 蛋白組分。 MRPs 除了構(gòu)成線粒體的翻譯機(jī)器之外，還具有其他的功能。 1996年，Kondoh 等[17]首次發(fā)現(xiàn)RPS29 能增加Krev-1 基因表達(dá)產(chǎn)物對惡性增殖細(xì)胞的抑制活性；Khanna 等[18]研究表明RPS29 在細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中發(fā)揮著首要的關(guān)鍵作用。 唐勝建等[19]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)RPS29 基因表達(dá)產(chǎn)物也能抑制成纖維細(xì)胞的增殖， 并能促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Cavdar Koc 等[20]研究發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的兩種蛋白GTP 結(jié)合蛋白DAP3 和PDCD9 實(shí)際上是線粒體核糖體小亞基組成蛋白MRPS29 和MRPS30，進(jìn)一步明確了線粒體核糖體與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。Han等[21]EST 數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)絡(luò)搜索揭示了在5′-UTR 處含有上游開放閱讀框（Upstream Open Reading Frame，uORF）的MRPS29mRNA 的剪接變體的存在。 此研究中提供的數(shù)據(jù)表明MRPS29 表達(dá)受損，這是由于在熒光素酶測定和蛋白質(zhì)印跡分析中顯示的MRPS29 mRNA 的5′-UTR 中發(fā)現(xiàn)的uORF。 通過siRNA 處理減少內(nèi)源性MRPS29 表達(dá)阻止HeLa 和CHO 細(xì)胞經(jīng)歷STS 誘導(dǎo)的線粒體片段化和凋亡。 進(jìn)一步證實(shí)線MRPS29 是線粒體促凋亡蛋白，也稱為死亡相關(guān)蛋白3（death associated protein 3，DAP3）。

本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)HLEC 氧化損傷的同時，也引起HLEC 內(nèi)線粒體RPS29 表達(dá)的增加， 影響HLEC 線粒體蛋白合成，導(dǎo)致HLEC 氧化損傷和HLEC凋亡。植物雌激素GEN 能下調(diào)HLEC 內(nèi)線粒體RPS29表達(dá)，抑制HLEC 凋亡，保護(hù)HLEC 氧化損傷。 因此，GEN 能有效防護(hù)H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3 氧化損傷，質(zhì)荷比為6532 的蛋白點(diǎn)可能是GEN 防護(hù)H2O2誘導(dǎo)的HLE-B3 氧化損傷的作用靶點(diǎn)，線粒體RPS29 可能是植物雌激素GEN 保護(hù)HLEC 氧化損傷的一個線粒體蛋白質(zhì)。 本研究發(fā)現(xiàn)的植物雌激素GEN 在保護(hù)氧化損傷的HLEC 的過程中差異表達(dá)的線粒體蛋白質(zhì)組作用靶點(diǎn)和線粒體蛋白質(zhì)等線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)機(jī)制，將為進(jìn)一步闡明老年性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，尋求防治老年性白內(nèi)障安全有效天然藥物提供新的有價值的線索和科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。