張龍飛，楊苑鶴，沈 童，葉 靈，吳占月，王夢杰，吳 華

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，其主要功能是吞噬細(xì)胞、參與抗原處理、消滅各種病原微生物及抗腫瘤等。細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自主走向死亡的兩種主要方式，細(xì)胞凋亡是受多基因復(fù)雜調(diào)控的細(xì)胞程序化死亡，細(xì)胞自噬是一種在真核生物中高度保守的細(xì)胞內(nèi)整體降解系統(tǒng)[1]。JNK信號(hào)通路是MAPK信號(hào)通路的重要分支，它在細(xì)胞周期、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用[2]。

青海特色藥用野生植物黑枸杞(LycuumruthenicumMurr)的主要活性成分為花青素(Anthocyanins，AC),花青素存在于植物細(xì)胞的液泡中，屬類黃酮的酚類物質(zhì)，具有護(hù)肝、抗炎、抗氧化、降血糖、提高免疫力等多種生物功效[3-5]。曹柏營等[4]研究發(fā)現(xiàn)，花青素可以提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能，增強(qiáng)小鼠免疫力。武強(qiáng)等[1]研究發(fā)現(xiàn)花青素能促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖，抑制細(xì)胞自噬，提高小鼠免疫力。大量研究發(fā)現(xiàn)花青素可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖、抑制巨噬細(xì)胞的自噬，但對(duì)于巨噬細(xì)胞凋亡與自噬相互作用的研究較少。本研究基于JNK信號(hào)通路探究黑枸杞花青素對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡與自噬的相互調(diào)節(jié)作用及相關(guān)分子機(jī)制，為黑枸杞花青素對(duì)細(xì)胞水平的免疫功能機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；黑枸杞花青素購自青海金麥杞生物科技有限公司(花青素64.4%、蛋白6%、糖1.32%、氨基酸3.56%、灰分0.6%、其他24.12%)[5]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制 黑枸杞花青素溶液配制：取0.01 mg黑枸杞花青素于DMEM培養(yǎng)基中避光溶解，配成100 μg/mL的花青素母液于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆?；JNK抑制劑SP600125溶液配制：取1 mg SP600125溶于DMEM培養(yǎng)基中，配成1 mmol/L的SP600125母液于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?本試驗(yàn)SP600125終濃度為10 μmol/L)；3-MA抑制劑溶液配制：取0.015 g 3-MA溶于DMEM培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱溶解2 h，配成100 mmol/L的3-MA母液于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7放置于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，然后在37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長70%～80%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞懸液0.1 mL于1.5 mL離心管，加0.8 mL PBS與0.1 mL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液，搖勻，室溫放置2～3 min后置于血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞分組及處理 細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板，分為分組1：對(duì)照組(0 μg/mL)、花青素組(25 μg/mL)、花青素(25 μg/mL)+SP600125(10 μmol/L)組、SP600125組(10 μmol/L)；分組2：對(duì)照組(0 μg/mL)、花青素組(25 μg/mL)、花青素(25 μg/mL)+3-MA(5 mmol/L)組、3-MA組(5 mmol/L)。每組3個(gè)復(fù)孔，分組處理后常規(guī)培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞。

1.2.4 DAPI、Hoechst檢測細(xì)胞核形態(tài) 以每孔4×104個(gè)細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板，按分組2處理后進(jìn)行培養(yǎng)；PBS洗滌2次后用4%甲醛固定，加入DAPI、Hoechst染液分別于室溫孵育15、30 min后用PBS洗滌2次，使用倒置熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板，按分組2處理后進(jìn)行培養(yǎng)；PBS洗滌2次，懸浮于100 μL的1×結(jié)合緩沖液，5 μL AV-FITC及10 μL PI室溫避光染色15 min，加入400 μL的1×結(jié)合緩沖液后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.6 RT-qPCR檢測JNK信號(hào)通路因子JNK及凋亡與自噬相關(guān)因子mRNA的表達(dá) 用TRNzol法分別提取各分組細(xì)胞總RNA并進(jìn)行完整性檢測及濃度檢測，隨后按照天根公司的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，以β-actin作為內(nèi)參采用SYBR Primescript TM試劑盒進(jìn)行定量PCR分析，引物序列如下：β-actin：5′-GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGC-3′(正向)，5′-ACATTCGAGGCTCCAGTGAATTCGG-3′(反向)；JNK：5′-CGCCTTATGTGGTGACTCGCTAC-3′(正向)，5′-CTCCCATGATGCACCCAACTGAC-3′(反向)；Caspase-3：5′-AGTGGGACTGATGAGGAGATGGC-3′(正向)，5′-ATGCTGCAAAGGGACTGGATGAAC-3′(反向)；Bcl-2：5′-CCGTCGTGACTTCGCAGAGATG-3′(正向)，5′-ATCCCTGAAGAGTTCCTCCACCAC-3′(反向)；Bax：5′-ACGCATCCACCAAGAAGC-3′(正向)，5′-GCCACACGGAAGAAGACC-3′(反向)；LC3-Ⅱ：5′-TGTGTCCACTCCCATCTCCGAAG-3′(正向)，5′-CCATTGCTGTCCCGAATGTCTCC-3′(反向)；Beclin-1：5′-GACACGAGCTTCAAGATCCTGGAC-3′(正向)，5′-CCTCCTGGGTCTCTCCTGGTTTC-3′(反向)。

1.2.7 Western Blot檢測JNK信號(hào)通路因子p-JNK及自噬因子LC3-Ⅱ蛋白表達(dá) 分別提取各分組細(xì)胞總蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度；使用SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜及封閉，加入一抗(p-JNK抗體或LC3-Ⅱ抗體)，4 ℃孵育過夜，加入二抗(山羊抗IgG)，室溫孵育1 h后洗膜、顯影、定影；使用Image J對(duì)條帶吸光度(A)值進(jìn)行分析。

1.2.8 MDC染色檢測細(xì)胞自噬小體 以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板，按分組1處理后進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后收集細(xì)胞；用300 μL的1×Wash buffer清洗細(xì)胞1次，800 g離心5 min，棄上清，加入適量的1×Wash buffer重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至106個(gè)/mL，取90 μL的細(xì)胞懸液至新的EP管中，加入10 μL的MDC Stain，輕輕混勻，室溫避光染色45 min；800 g離心5 min，收集細(xì)胞，用300 μL的1×Wash buffer清洗細(xì)胞1次，棄上清，加入100 μL的1×Wash buffer重懸細(xì)胞，滴加于載玻片上并加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用one-way ANOVA選擇Duncan′s法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，利用GraphPad Prism 8.0繪圖軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑枸杞花青素結(jié)合3-MA對(duì)RAW264.7細(xì)胞核形態(tài)的影響

如圖1所示，各組細(xì)胞均具有圓形的均質(zhì)核，沒有形態(tài)變化的單層細(xì)胞，未表現(xiàn)出典型的凋亡特征，且花青素+3-MA組細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組，這說明在抑制RAW264.7細(xì)胞自噬的同時(shí)，花青素可促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡。

圖1 黑枸杞花青素結(jié)合3-MA對(duì)RAW264.7細(xì)胞核形態(tài)的影響Fig.1 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with 3-MA on the nuclear morphology of RAW264.7

2.2 黑枸杞花青素結(jié)合3-MA對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡率的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，花青素組、3-MA組顯著抑制RAW264.7細(xì)胞凋亡(P<0.05)，花青素+3-MA組可極顯著抑制RAW264.7細(xì)胞凋亡(P<0.01)；與3-MA組相比，花青素+3-MA組可顯著抑制RAW264.7細(xì)胞凋亡(P<0.05)。

圖中與對(duì)照組相比，*為P<0.05，**為P<0.01；與3-MA組相比，#為P<0.05，下同。圖2 黑枸杞花青素結(jié)合3-MA對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡率的影響Fig.2 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with 3-MA on the apoptosis rate of RAW264.7

2.3 黑枸杞花青素結(jié)合3-MA對(duì)凋亡因子Caspase-3、Bcl-2、Bax、Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

如圖3所示，與對(duì)照組相比，花青素組顯著降低Caspase-3、Bax的mRNA表達(dá)(P<0.05)，3-MA組與花青素+3-MA組極顯著降低Caspase-3、Bax的mRNA表達(dá)(P<0.01)；花青素組顯著增高Bcl-2 的mRNA表達(dá)(P<0.05)，3-MA組與花青素+3-MA組極顯著增高Bcl-2的mRNA表達(dá)(P<0.01)；花青素組、3-MA組與花青素+3-MA組極顯著降低Bax/Bcl-2的mRNA表達(dá)(P<0.01)。與3-MA組相比，花青素+3-MA組顯著降低Caspase-3、Bax與Bax/Bcl-2的mRNA表達(dá)(P<0.05)，顯著增高Bcl-2的mRNA表達(dá)(P<0.05)。

圖3 黑枸杞花青素結(jié)合3-MA對(duì)凋亡因子Caspase-3、Bcl-2、Bax、Bax/Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with 3-MA on the expression of apoptosis factors Caspase-3，Bcl-2，Bax and Bax/Bcl-2 mRNA

2.4 黑枸杞花青素結(jié)合3-MA對(duì)JNK信號(hào)通路因子JNK mRNA表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，花青素組與3-MA組顯著降低JNK的mRNA表達(dá)(P<0.05)，花青素+3-MA組極顯著降低JNK的mRNA表達(dá)(P<0.01)。與3-MA組相比，花青素+3-MA組顯著降低JNK的mRNA表達(dá)(P<0.05)。

2.5 黑枸杞花青素結(jié)合3-MA對(duì)JNK信號(hào)通路因子p-JNK蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組相比，花青素組顯著降低p-JNK的蛋白表達(dá)(P<0.05)，3-MA組與花青素+3-MA組極顯著降低p-JNK的蛋白表達(dá)(P<0.01)。與3-MA組相比，花青素+3-MA組顯著降低p-JNK的蛋白表達(dá)(P<0.05)。

圖5 黑枸杞花青素結(jié)合3-MA對(duì)JNK信號(hào)通路因子p-JNK蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with 3-MA on the protein expression of JNK signaling pathway factor p-JNK

2.6 黑枸杞花青素結(jié)合SP600125對(duì)RAW264.7細(xì)胞自噬的影響

經(jīng)過MDC染色后，細(xì)胞內(nèi)的自噬體可被染色并在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光，熒光的聚積程度反映細(xì)胞自噬的水平，結(jié)果如圖6所示。對(duì)照組內(nèi)含有少量熒光，花青素組的熒光明顯減少,SP600125組、花青素+SP600125組幾乎看不到熒光。表明黑枸杞花青素可以抑制RAW264.7細(xì)胞自噬體的聚集。

圖6 黑枸杞花青素結(jié)合SP600125對(duì)RAW264.7細(xì)胞自噬的影響Fig.6 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with SP600125 on the autophagy of RAW264.7

2.7 黑枸杞花青素結(jié)合SP600125對(duì)自噬因子LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA表達(dá)的影響

如圖7所示，與對(duì)照組相比，花青素組、SP600125組與花青素+SP600125組顯著降低Beclin-1的mRNA表達(dá)(P<0.05)；花青素組、SP600125組顯著降低LC3-Ⅱ的mRNA表達(dá)(P<0.05)，花青素+SP600125組極顯著降低LC3-Ⅱ的mRNA表達(dá)(P<0.01)。與SP600125組相比，花青素+SP600125組顯著降低LC3-Ⅱ、Beclin-1的mRNA表達(dá)(P<0.05)。

圖中與對(duì)照組相比，*為P<0.05，**為P<0.01；與SP600125組相比，#為P<0.05，下同。圖7 黑枸杞花青素結(jié)合SP600125對(duì)自噬因子LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA表達(dá)的影響Fig.7 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with SP600125 on the expression of autophagy factors LC3-Ⅱ and Beclin-1 mRNA

2.8 黑枸杞花青素結(jié)合SP600125對(duì)自噬因子LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響

如圖8所示，與對(duì)照組相比，花青素組顯著降低LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)(P<0.05)，SP600125組與花青素+SP600125組極顯著降低LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)(P<0.01)。與SP600125組相比，花青素+SP600125組顯著降低LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)(P<0.05)。

圖8 黑枸杞花青素結(jié)合SP600125對(duì)自噬因子LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effects of Lycuum ruthenicum Murr anthocyanin combined with SP600125 on the protein expression of autophagy factor LC3-Ⅱ

3 討論與結(jié)論

文獻(xiàn)[6-8]研究發(fā)現(xiàn)JNK磷酸化后能促進(jìn)Bax的表達(dá)，Bax和Bcl-2屬于Bcl-2基因家族成員，Bax的過度表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于死亡，而Bcl-2能抑制線粒體內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶及誘凋亡因子細(xì)胞色素C的釋放，干擾Caspase-3活化來發(fā)揮抗凋亡的作用，認(rèn)為Bcl-2可能抑制了Caspase-3的合成[8-10]。本研究中花青素結(jié)合3-MA誘導(dǎo)RAW264.7 24 h后未發(fā)現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)，但細(xì)胞數(shù)量增多，凋亡率顯著下降(P<0.05)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)花青素結(jié)合3-MA能顯著降低JNK信號(hào)通路因子JNK的mRNA表達(dá)及p-JNK的蛋白表達(dá)(P<0.05)，顯著降低Caspase-3及Bax的mRNA表達(dá)(P<0.05)，顯著升高Bcl-2的mRNA表達(dá)(P<0.05)，顯著降低了Bax與Bcl-2的mRNA比值(P<0.05)，這說明花青素結(jié)合3-MA后能通過JNK信號(hào)通路抑制RAW264.7的細(xì)胞凋亡。

SP600125主要通過抑制JNK磷酸化從而發(fā)揮抑制JNK信號(hào)通路的作用[11-13]，JNK信號(hào)通路通過對(duì)自噬因子Beclin-1與抗凋亡因子Bcl-2相互作用的影響來調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[14-15]。本研究中花青素結(jié)合SP600125處理RAW264.7 24 h后觀察不到自噬體聚集現(xiàn)象，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)花青素結(jié)合SP600125能顯著降低LC3-Ⅱ的mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.05)，顯著降低Beclin-1的mRNA表達(dá)(P<0.05)，這說明花青素結(jié)合SP600125能抑制RAW264.7的細(xì)胞自噬且與JNK信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，黑枸杞花青素可通過JNK信號(hào)通路對(duì)RAW264.7細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬的相互關(guān)系進(jìn)行調(diào)控，發(fā)揮對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用，增強(qiáng)小鼠免疫力。