陸超，羅冠君，沈玥，譚媛，程婷婷，曹宗富，羅敏娜，馬旭*，趙勇*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.國家人類遺傳資源中心，北京 102206；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬南海婦產(chǎn)兒童醫(yī)院，佛山 528200)

Joubert綜合征(OMIM#213300，Joubert syndrome，簡稱JBTS)是一種罕見的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育疾病，通常表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，只有OFD1基因變異導(dǎo)致的JBTS為X連鎖隱性遺傳。1969年首次由Joubert Marie及其同事發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[1]。JBTS主要的影像學(xué)特征為中腦呈“磨牙征”[2]，主要的臨床表現(xiàn)有小腦蚓部發(fā)育不良或缺如、發(fā)育遲緩、肌張力低、新生兒期的陣發(fā)性呼吸過度、呼吸暫停和/或眼球運(yùn)動障礙，部分患兒中有視網(wǎng)膜發(fā)育不良、多囊腎、多指(趾)癥和肝纖維囊腫等伴發(fā)癥[3]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少40個纖毛相關(guān)基因與JBTS有關(guān)[4-5]，而國內(nèi)關(guān)于OFD1基因變異引起的JBTS報(bào)道較少[6-8]。2017年，廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬南海婦產(chǎn)兒童醫(yī)院康復(fù)科收治的一例患兒表現(xiàn)出典型的小腦蚓部發(fā)育不全、張力減退、發(fā)育遲緩等癥狀，臨床確診為Joubert綜合征。經(jīng)全外顯子組測序(WES)分析以及Sanger測序驗(yàn)證，最終確認(rèn)其致病位點(diǎn)為OFD1基因上的c.2626delC。現(xiàn)將該患兒的臨床特點(diǎn)及遺傳學(xué)分析結(jié)果報(bào)道如下。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)對象

患者來自廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬南海婦產(chǎn)兒童醫(yī)院康復(fù)科，在知情同意的前提下采集了患兒及父母、親屬的外周靜脈血各2 ml，并獲取了先證者的臨床資料。本研究經(jīng)國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號為201806)。

二、全外顯子組測序及數(shù)據(jù)分析

用QIAamp DNA Blood MiNi Kit(Qiagen，德國)提取全血基因組DNA，取0.5 μg先證者的DNA，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作步驟，用SureSelect Human All Exon V6試劑盒(Agilent，美國)進(jìn)行外顯子組文庫制備，并利用Novaseq 6000平臺(Illumina，美國)進(jìn)行2×150的雙末端測序，下機(jī)后數(shù)據(jù)的比對、注釋、篩選等分析過程見參考文獻(xiàn)[9-10]。

三、一代測序驗(yàn)證

依據(jù)候選致病性變異位點(diǎn)的物理位置，用NCBI blast在線工具(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)設(shè)計(jì)引物，由北京六合華大基因科技有限公司合成引物。引物序列分別為：正向引物5’-TGGTGAGGGTGACGTATTTG-3’，反向引物5’-ACAAGGAGAGGACAGGGATG-3’。以先證者及其家屬的基因組DNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，退火溫度為65℃，隨后用3730xl測序儀(ThermoFisher，美國)進(jìn)行Sanger測序，用Chromas軟件查看測序峰圖，用SeqMan軟件比對測序結(jié)果。

結(jié) 果

一、患者資料

1.基本情況：患兒，男，2歲，因“發(fā)現(xiàn)運(yùn)動、智力發(fā)育落后1年余”由家長抱送入院行康復(fù)治療?；純簽槟赣H的第4胎第3產(chǎn)，足月剖宮產(chǎn)，出生體重4.45 kg，無新生兒窒息、黃疸史?；純?歲時(shí)表現(xiàn)出運(yùn)動及智力發(fā)育遲緩，肢體松軟。家系情況：父母非近親婚配，先證者母親曾自然流產(chǎn)一男胎，先證者外婆曾夭折一名男嬰，原因未明，先證者兄姐均為正常表型。家系圖譜詳見圖1。

箭頭所指為先證者圖1 患兒家系圖

2.體格檢查：雙手手指短，手掌肥厚，通貫掌紋；頭控穩(wěn)，能完成翻身、獨(dú)坐、四爬，僅能扶物站立及行走；雙手可主動抓物，對指捏物完成較笨拙；有一定目光交流，但反應(yīng)遲鈍，僅能指認(rèn)部分常見物品，未能指認(rèn)家人，僅能理解極個別簡單指令，基本無語言表達(dá)能力；四肢肌力及肌張力低下，膝腱反射可引出，病理反射未引出。

3.輔助檢查：顱腦MRI顯示第四腦室變形，雙側(cè)大腦半球皮層下白質(zhì)內(nèi)及雙側(cè)側(cè)腦室旁示多發(fā)斑片狀等T1長T2異常信號影，腦白質(zhì)髓鞘化進(jìn)程中。小腦上腳增粗、延長，呈“磨牙征”(圖2A)，小腦蚓部形態(tài)失常。Gesell發(fā)育量表檢查結(jié)果：社會適應(yīng)DQ=47.4、大動作DQ=23.4、精細(xì)動作DQ=39.6、語言DQ=31、個人社交DQ=24.1、SM=8分。

A：軸位T1WI顯示“磨牙征”(箭頭指示處)；B：矢位T2WI顯示小腦上腳增粗、延長(箭頭指示處)。圖2 患兒腦部磁共振成像(MRI)圖

二、全外顯子組測序及變異位點(diǎn)分析結(jié)果

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過比對、注釋、過濾、篩選后，在已知致病基因中發(fā)現(xiàn)了OFD1基因(NM_003611.2)的c.2626delC變異，該變異位于第20號外顯子，該堿基缺失導(dǎo)致第876位的谷氨酰胺變?yōu)橘嚢彼幔⒃斐傻鞍踪|(zhì)翻譯提前終止(p.Gln876Lysfs*12)，形成截短的蛋白質(zhì)。該位點(diǎn)在dbSNP和HGMD均未收錄，是尚未報(bào)道的新變異。根據(jù)ACMG解讀指南，該位點(diǎn)為致病性變異。

三、Sanger測序驗(yàn)證

Sanger測序結(jié)果表明，先證者OFD1基因上的c.2626delC位點(diǎn)來自母親(圖3箭頭所示)。父親(Ⅱ4)為野生型半合子，母親(Ⅱ5)為雜合子，先證者(Ⅲ6)為突變型半合子，先證者之姐為雜合子，先證者之兄為野生型半合子，符合伴X染色體隱性遺傳定律。由于伴X染色體隱性遺傳病的特殊性，后期回溯病人家族史，發(fā)現(xiàn)該家系中先證者母親有姐妹5人(圖1)。應(yīng)親屬要求，對該家系育齡女性(Ⅰ2，Ⅱ1，Ⅱ7，Ⅱ8，Ⅱ9)進(jìn)行了一代測序篩查，發(fā)現(xiàn)其家族中外婆(Ⅰ2)和大姨(Ⅱ1)均為該突變的攜帶者(圖3)。

黑色箭頭所示為變異位點(diǎn)所在的堿基圖3 OFD1基因c. 2626delC位點(diǎn)的Sanger測序峰圖

討 論

OFD1基因變異被證實(shí)與多種疾病相關(guān)，包括口面指綜合征Ⅰ型(OFD1，OMIM#311200)、Simpson-Golabi-Behmel綜合征2型(SGBS2，OMIM#300209)、視網(wǎng)膜色素變性23型(RP23，OMIM#300424)和Joubert綜合征[11-14]。OFD1最早被發(fā)現(xiàn)引起口面指綜合征Ⅰ型[11]。口面指綜合征Ⅰ型是一種X連鎖顯性遺傳病，男性致死，女性患者通常有口腔畸形(上唇正中裂、腭裂、分葉舌、口腔系帶增生、舌錯構(gòu)瘤、牙槽嵴增厚及牙列異常等)、特殊面容(前額突出、塌鼻梁、眼距寬等)和多指(趾)畸形等臨床表現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常和多囊腎也是該病常見伴發(fā)癥[15-18]。OFD1導(dǎo)致的SGBS2為X連鎖隱形遺傳病，患者表現(xiàn)為精神發(fā)育遲滯、肥胖、反復(fù)呼吸問題以及大頭畸形等[12，19]。2009年，Coene等[14]首次報(bào)道OFD1與JBTS有關(guān)，該病患者均為男性，有“磨牙征”、發(fā)育遲緩、多指、視網(wǎng)膜色素變性等表型。這些因OFD1基因變異導(dǎo)致的疾病表型復(fù)雜多樣，不僅在不同疾病類型的患者之間具有差異性，在相同疾病的患者之間，甚至在攜帶相同致病變異的患者中，其臨床表現(xiàn)也可能存在差異[20]。本文患兒男性，頭顱MRI呈現(xiàn)“磨牙征”、發(fā)育落后，全外顯子組測序以及Sanger測序結(jié)果表明OFD1 c.2626delC是患兒的致病原因，為一例典型的X連鎖隱性遺傳JBTS病例。

OFD1基因位于X染色體短臂p22.2，包含23個外顯子，編碼一個包含1 012個氨基酸的蛋白質(zhì)[21-22]。OFD1蛋白的主要功能區(qū)包括LisH結(jié)構(gòu)域(72～101氨基酸，位于3號外顯子)、7個coiled-coil結(jié)構(gòu)域(位于7～21號外顯子)以及5個無序結(jié)構(gòu)域(IDRs)(719～991氨基酸，位于16～23號外顯子)，其中N端的LisH結(jié)構(gòu)域在所有物種中高度保守[11，23]。目前，HGMD數(shù)據(jù)庫中收錄的OFD1基因的致病性變異中，與口面指綜合征Ⅰ型相關(guān)變異138個，均位于17號外顯子以前的位置。JBTS相關(guān)變異16個中8個分布在10號外顯子以前，其余均在20號外顯子以后的位置，本文的致病變異也在20號以后的位置上。有文獻(xiàn)推測OFD117號外顯子前發(fā)生的無義突變，尤其是發(fā)生在10號外顯子前的無義和錯義變異可能導(dǎo)致了OFD1蛋白質(zhì)功能失調(diào)，而發(fā)生在OFD117號外顯子后的變異造成了疾病類型的多樣(如SGBS2和JBTS)以及疾病表型的多變和溫和[23-26]，這可能是本文患兒表型較為輕微的原因之一。2017年，孟晨等[6]曾報(bào)道一例因OFD1變異的男性Joubert綜合征患兒，其變異位點(diǎn)為c.2843_2844delAA，位于OFD1基因21號外顯子上。該患兒的臨床癥狀除中腦呈“磨牙狀”外，還伴有多指、四肢短小、視盤缺損、內(nèi)臟反位的臨床癥狀。2020年，Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)一個因OFD1基因7號外顯子c.599T>C變異所致的JBTS家系，該變異靠近OFD1基因N端的位置。先證者具有“磨牙征”，主要表現(xiàn)為重度發(fā)育遲緩和智力障礙。其母再孕2次均為患胎，基因型與先證者同，且第4胎除“磨牙征”外還有法洛四聯(lián)癥的影像學(xué)表現(xiàn)。本文患兒的致病變異發(fā)生于20號外顯子，雖同樣是靠近OFD1基因C端的位置，但較孟晨等[6]報(bào)道的病例癥狀為輕，從另一方面證實(shí)了該基因所致疾病表型的差異性。

本文報(bào)道的先證者目前暫未發(fā)現(xiàn)其他伴發(fā)癥狀，需要關(guān)注的主要是發(fā)育遲緩，干預(yù)手段主要是康復(fù)治療。后期詢問家族史時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)先證者母親有多位女性同胞，考慮到OFD1伴X隱性遺傳的特征，女性攜帶者生育時(shí)，男嬰的患病風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)50%，女嬰則有50%的可能為攜帶者，因此對該家族女性進(jìn)行OFD1 c.2626delC變異位點(diǎn)的攜帶者篩查非常必要。告知篩查意義后我們應(yīng)親屬要求為該家系育齡女性進(jìn)行了基因篩查，發(fā)現(xiàn)先證者大姨為c.2626delC變異的攜帶者(圖1)。先證者大姨的兩個女兒因未成年暫未接受攜帶者檢測，待其婚配時(shí)，可再行檢測以確定是否攜帶c.2626delC變異。一旦確定攜帶OFD1致病位點(diǎn)，則孕期需進(jìn)行產(chǎn)前診斷，以避免JBTS患兒的出生。因此，本文研究結(jié)果對于該家系有生育需求的女性攜帶者的孕前遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷具有重要意義。

綜上，本文利用全外顯子組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一個新的OFD1基因的致病變異，擴(kuò)大了OFD1基因的突變譜。本文是由OFD1基因變異引起的多成員JBTS家系，基因檢測結(jié)果可為該家族女性攜帶者的優(yōu)生優(yōu)育提供重要的分子依據(jù)。