張琦，劉倩，漆倩榮，謝青貞

(武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，武漢 430060)

體外受精/卵胞漿內單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)的妊娠率與卵巢儲備功能、胚胎質量、子宮內膜容受性及黃體功能等諸多因素密切相關[1]。既往研究表明，扳機日過高的雌二醇(E2)水平可降低鮮胚移植周期臨床妊娠率[2]，但取卵后E2水平的變化是否影響鮮胚移植患者妊娠結局目前仍存在爭議。Sharara[3]研究結果顯示，取卵后黃體中期E2較扳機日E2急劇下降(扳機日E2/胚胎移植后第3天E2>5)時鮮胚移植臨床妊娠率顯著降低。Rehman等[4]將胚胎移植日E2按40/60/80分位數(shù)分組，發(fā)現(xiàn)隨著胚胎移植日E2高于40、60、80個百分位數(shù)，臨床妊娠率也逐漸升高。Friedler等[5]及Hung等[6]的研究結果則顯示，黃體中期較扳機日E2急劇下降與鮮胚移植臨床妊娠結局無關。本研究擬比較拮抗劑方案和卵泡期長方案促排卵患者行D3鮮胚移植后第3天E2較扳機日E2下降情況，探討黃體中期E2下降水平對鮮胚移植妊娠結局的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2020年10月至2021年10月在武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行IVF/ICSI-ET助孕的患者臨床資料。納入標準：(1)采用拮抗劑方案或卵泡期長方案促排卵，且行D3新鮮胚胎移植；(2)抗苗勒管激素(AMH)≥1.1 ng/ml；(3)基礎卵泡刺激素(bFSH)≤12 U/L，獲卵數(shù)≥5；(4)女方年齡<42歲；(5)陰道分泌物檢查及血液TORCH檢查正常。排除標準：(1)自身免疫因素異常；(2)宮腔粘連或子宮畸形等明確影響胚胎著床的患者；(3)合并甲狀腺和糖尿病等內分泌疾病的患者；(4)雙方染色體核型異常；(5)復發(fā)性流產。

本研究共納入患者212例。根據(jù)促排卵方案不同，分為拮抗劑組99例(包括妊娠組47例和未妊娠組52例)、卵泡期長方案組113例(包括妊娠組67例和未妊娠組46例)。因在該期間本中心行黃體期長方案僅12例，而拮抗劑方案行囊胚移植的周期數(shù)少，故未納入該類患者。

二、促排卵治療

1.拮抗劑方案：患者于月經來潮第2天開始每天注射重組人卵泡刺激素(r-FSH，果納芬，默克，瑞士)或尿促性腺激素(HMG，麗申寶，珠海麗珠)112.5～225 U，定期B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況和生殖激素水平以判斷卵巢反應性，根據(jù)卵巢反應性調整用藥劑量。當卵泡直徑達14 mm時每天加用拮抗劑藥物(GnRH-ant，思則凱，默克，瑞士)0.25 mg，連續(xù)應用至絨毛膜促性腺激素(HCG)日[7]。

2.卵泡期長方案：患者于月經來潮第2天肌肉注射長效GnRH-a(達菲林，益普生，法國)3.75 mg，末次注射28～30 d后行超聲和生殖激素檢測是否達降調標準。完全降調后(FSH<5 U/L，LH<5 U/L，E2<50 pmol/L，子宮內膜厚度<5 mm，卵泡直徑<5 mm)開始進行促排卵，每天肌肉注射r-FSH或HMG，行陰道超聲監(jiān)測和生殖激素水平測定，根據(jù)卵巢反應性調整用藥劑量[7]。

三、取卵、胚胎培養(yǎng)及胚胎移植

當有3個以上卵泡直徑≥17 mm或兩個卵泡直徑≥18 mm時停用促性腺激素(Gn)，并于當晚注射人源HCG(珠海麗珠)8 000～10 000 U，36 h后經陰道超聲引導下取卵。取卵后行常規(guī)IVF或ICSI，胚胎培養(yǎng)3 d評級后選擇1～2個胚胎移植，剩余胚胎采用玻璃化冷凍法行冷凍[7]。

四、黃體支持及妊娠診斷

胚胎移植后常規(guī)給予黃體酮注射液(浙江仙琚)40 mg肌肉注射及地屈孕酮片(達芙通，雅培，荷蘭)30 mg口服進行黃體支持。于鮮胚移植后第12天查血HCG，HCG>10 U/L提示妊娠；胚胎移植后30 d行陰道超聲檢查，見孕囊者確定為臨床妊娠(包括宮內或宮外妊娠)。

五、觀察指標

1.基本資料：包括年齡、不孕類型、不孕年限、不孕原因、血清bFSH水平、血清AMH水平以及受精方式。

2.促排卵情況：Gn用量、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN受精數(shù)、2PN卵裂數(shù)、D3優(yōu)質胚胎數(shù)、扳機日孕酮(P)水平。

3.扳機日和黃體中期血清E2水平：E2下降幅度=(1-移植后第3天E2/扳機日E2)×100%。

六、統(tǒng)計學分析

結 果

一、兩種促排卵方案中妊娠組與未妊娠組患者的基本資料

本研究共納入212例IVF/ICSI患者，其中妊娠組114例，未妊娠組98例，總體的臨床妊娠率為53.8%。拮抗劑方案和卵泡期長方案中的妊娠組與未妊娠組患者間的年齡、不孕類型、不孕原因、不孕年限、基礎FSH、受精方式等基本資料差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩種促排卵方案中妊娠組與未妊娠組患者的基本資料比較[(-±s)，n(%)]

續(xù)表

二、兩種促排卵方案中妊娠組與未妊娠組患者的促排卵結果

統(tǒng)計結果顯示，拮抗劑方案和卵泡期長方案中的妊娠組與未妊娠組患者間Gn用量、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN受精數(shù)、2PN卵裂數(shù)、D3優(yōu)質胚胎數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)；拮抗劑方案中妊娠組扳機日P水平顯著低于未妊娠組(P<0.05)，而卵泡期長方案中妊娠組與未妊娠組的扳機日P水平無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩種促排卵方案中妊娠組與未妊娠組患者的促排卵情況比較[(-±s)]

三、不同促排卵方案患者的血清E2水平及下降幅度比較

拮抗劑方案組患者扳機日血清E2水平顯著高于卵泡期長方案組(P<0.05)，但兩組患者移植后第3天的E2水平的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；下降幅度比較上，拮抗劑方案組E2下降幅度顯著高于卵泡期長方案組(P<0.05)，而臨床妊娠率(47.5%)顯著低于卵泡期長方案組(59.3%)(P<0.05)(表3)。

表3 兩種促排方案E2下降幅度比較[(-±s)，%]

四、兩種促排卵方案中妊娠組與未妊娠組患者血清E2水平及下降幅度比較

為了分析血清E2水平及下降幅度對妊娠結局的影響，分別比較了兩種促排卵方案中妊娠組與未妊娠組扳機日及移植后第3天E2的血清水平。拮抗劑方案組中，妊娠組與未妊娠組患者在兩個時間點的血清E2水平均無顯著性差異(P>0.05)，但未妊娠組E2下降幅度顯著高于妊娠組(P<0.05)；而在卵泡期長方案周期中，妊娠組與未妊娠組兩個時間點的血清E2水平及E2下降幅度均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表4)。

表4 不同促排方案中妊娠與未妊娠組患者E2下降幅度比較[(-±s)]

五、Logistic回歸分析E2下降幅度對妊娠結局的影響

前面結果顯示，拮抗劑方案中妊娠組和未妊娠組患者的E2下降幅度有顯著性差異，因此，根據(jù)本方案E2下降幅度的四分位數(shù)(35.42/62.61/82.38)分為E2下降幅度<35.42%、35.43%～62.60%、62.61%～82.37%、>82.38%四組。單因素Logistic回歸分析結果表明，與E2下降幅度<35.42%組相比，E2下降幅度>82.38%與臨床妊娠結局顯著相關(P=0.021，OR=0.233)。為進一步排除其他混雜因素的影響，確定E2下降幅度與妊娠結局的相關性，以是否臨床妊娠為因變量，將可能影響拮抗劑方案周期妊娠結局的因素包括E2下降幅度、年齡、不孕年限、不孕原因、AMH、基礎FSH水平、獲卵數(shù)及扳機日P值納入自變量行多因素Logistic回歸分析，結果表明調整混雜因素后，與E2下降幅度<35.42%組相比，>82.38%組仍與妊娠結局顯著相關(P=0.020，OR=0.117)，即在拮抗劑方案周期中，E2下降幅度大于82.38%是影響臨床妊娠的獨立危險因素(表5)。

表5 Logistic回歸分析拮抗劑方案E2下降幅度對妊娠結局的影響

通過計算ROC曲線下面積(AUC)來評估拮抗劑方案周期中E2下降幅度大于82.38%對臨床妊娠結局的預測價值，結果顯示拮抗劑方案移植D3胚胎周期中E2下降幅度大于82.38%對臨床妊娠結局有良好的預測價值[AUC=0.799，95%CI(0.702，0.896)](圖1)。

圖1 拮抗劑方案周期E2下降幅度預測臨床妊娠結局的ROC曲線

討 論

在輔助生殖(ART)助孕周期中，卵丘復合物的取出會伴隨著E2水平迅速下降，到黃體中期卵巢顆粒黃體細胞及卵泡膜黃體細胞繼續(xù)分泌E2和P，參與胚胎著床和妊娠的建立，此時期的E2和P水平可反映黃體功能。Stewart等[8]首次報道在供精人工授精周期中，妊娠組黃體期E2顯著高于未妊娠組，提示黃體期E2水平可能是影響妊娠結局的關鍵因素。Ganesh等[9]發(fā)現(xiàn)，在黃體期長方案鮮胚移植周期中，妊娠組與未妊娠組移植當天E2水平無顯著差異，而在移植后第7天和第14天，妊娠組的E2水平顯著高于未妊娠組。而Friedler等[5]及Narvekar等[10]研究發(fā)現(xiàn)，鮮胚移植后黃體中期E2下降幅度與妊娠結局無明顯相關性。鑒于以上研究多關注GnRH-a降調節(jié)周期，對使用拮抗劑方案關注較少，因此本研究將拮抗劑方案納入觀察對象，觀察不同促排方案中黃體中期E2下降幅度是否對妊娠結局存在影響。

黃體期E2對子宮內膜容受性、胚胎植入和妊娠維持有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)，黃體期E2促進分泌期子宮內膜孕激素受體(PR)增加，維持必要的PR濃度，從而介導和完成P的子宮內膜轉化功能[11]。Choi等[12]在缺乏類固醇激素的切除卵巢小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，當黃體中期E2缺乏時可誘導子宮內膜上皮細胞的自噬增加，從而導致子宮內膜容受性下降，影響胚胎植入，而且與扳機日E2高水平影響子宮內膜容受性不同，黃體中期E2水平下降會下調子宮內膜中某些因子(例如白介素-1，腫瘤壞死因子-α、干擾素)的表達，改變子宮內膜局部分子微環(huán)境[10]，干擾胚胎植入，以上結果提示黃體中期E2下降可能與ART妊娠結局相關。

卵泡期長方案操作簡單且有較好的經濟適用性，相較于其他方案對子宮內膜厚度和胚胎種植率等有一定改善，已成為很多生殖中心的主要促排方案。拮抗劑方案相較于卵泡期長方案，具有靈活個體化的特點，對PCOS、高反應及低反應患者均有良好的應用前景，但鮮胚移植妊娠率低，黃體功能穩(wěn)定性欠佳。有研究發(fā)現(xiàn)，在使用拮抗劑方案超促排卵時，血清E2的水平可能隨著血清P水平升高而減少，并且與GnRH-a激動劑方案相比，這種降低程度更大[13]。本研究也發(fā)現(xiàn)，相較于卵泡期長方案，拮抗劑方案無論是妊娠組還是未妊娠組，E2下降幅度均更大，提示拮抗劑方案黃體功能穩(wěn)定性欠佳。因此有人提出在拮抗劑方案黃體支持時額外補充E2可能對妊娠結局有所幫助。但是，目前對于拮抗劑方案該不該加強雌激素的補充，以及補充的條件和方式仍存在較大爭議。一項前瞻性研究也發(fā)現(xiàn)，在使用拮抗劑方案周期中黃體支持時額外補充E2能顯著提高胚胎植入率，降低黃體期陰道出血發(fā)生率[14]。然而一項系統(tǒng)薈萃分析顯示，在拮抗劑方案中黃體期額外補充E2并不能改善妊娠結局[15]。同時另外兩項研究表明，在拮抗劑方案周期中利用不同的E2途徑(包括口服、透皮貼劑或透皮凝膠)來支持黃體期并沒有提高妊娠率[16-17]。

本研究同時納入了卵泡期長方案和拮抗劑方案進行分析，結果發(fā)現(xiàn)卵泡期長方案E2下降幅度與妊娠結局無關，其可能與卵泡期長方案相較于拮抗劑方案E2下降幅度小，黃體功能更加穩(wěn)定，足以支持胚胎植入并維持妊娠有關。本研究通過Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)拮抗劑方案中E2下降幅度與妊娠結局相關，且當E2下降幅度>82.38%時，臨床妊娠率顯著下降；ROC曲線分析進一步證實，在拮抗劑方案中E2下降幅度>82.38%對妊娠結局有良好的預測價值(AUC=0.799)，提示在拮抗劑方案移植D3胚胎周期中，當E2下降幅度>82.38%時有必要額外補充E2加強黃體支持，但給藥劑量及給藥途經仍有待研究。本結果可作為臨床工作中對拮抗劑方案促排卵患者行雌激素補充治療的重要參考。

本研究的局限性在于：(1)納入研究例數(shù)有限，可能影響結果的可靠性，未來仍需要擴大樣本量進一步分析證實；(2)未進一步納入比較黃體期長方案及D5囊胚移植后E2下降趨勢與臨床妊娠率關系；(3)本研究為回顧性隊列分析，可能存在一定程度的用藥偏倚和混雜因素，未來需要進一步行前瞻性研究來證實。

綜上所述，拮抗劑方案D3胚胎移植周期中，E2下降幅度與妊娠結局相關，且當下降幅度大于82.38%時其臨床妊娠率顯著降低；而卵泡期長方案中D3胚胎移植后第3天E2下降水平不影響IVF/ICSI-ET助孕結局。本研究為拮抗劑方案鮮胚移植策略提供了一個新思路，對于拮抗劑方案D3胚胎移植后第3天E2下降幅度大于82.38%的患者，在取卵后應額外補充E2加強黃體支持改善妊娠結局，但對于給藥時間、給藥途徑及用藥劑量等問題，未來仍需要擴大樣本量進行下一步臨床研究。