殷娜　宋娜麗　普曉佳　顧茜蘭　楊海浩　 萬(wàn)春平　祁燕　李小絲　鄭喜

摘要：藥用植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性物質(zhì)，民族藥馬利筋生物活性廣泛。為獲得馬利筋活性內(nèi)生真菌資源，該研究基于“民族藥-內(nèi)生真菌-活性成分”的思路，考察了168株馬利筋內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的生物活性，并分別采用SRB法、Griess法、PNPG法和DPPH法對(duì)內(nèi)生真菌發(fā)酵液乙酸乙酯提取物進(jìn)行抗腫瘤、抗炎、α葡萄糖苷酶抑制和抗氧化等生物活性測(cè)定，對(duì)活性菌株進(jìn)行ITS菌種鑒定。結(jié)果表明：（1）所篩選的168株內(nèi)生真菌中有22株表現(xiàn)出不同程度的生物活性。其中，9株內(nèi)生真菌具有顯著抗腫瘤活性，其IC50值在0.1～40μg·mL1之間;菌株MJF53在2.5μg·mL1時(shí)對(duì)LPS誘導(dǎo)的Raw264.7釋放的NO和IL1β均具有明顯的抑制作用;7株內(nèi)生真菌表現(xiàn)出不同程度的α葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50值在1.0～4.0mg·mL1之間，其中MYF16和MYF55對(duì)α葡萄糖苷酶抑制活性接近阿卡波糖;19株內(nèi)生真菌具有不同程度的DPPH自由基清除活性，其中菌株MYF9、MYF19和MJF84表現(xiàn)出中等強(qiáng)度的抗氧化活性，IC50值分別為13.562、17.776、12.395μg·mL1。（2）ITS菌株鑒定發(fā)現(xiàn)，22株活性菌株分屬于鏈格孢屬（Alternariasp.）、刺盤(pán)孢屬（Colletotrichumsp.）、鐮刀菌屬（Fusariumsp.）、間座殼屬（Diaporthesp.）、踝節(jié)菌屬（Talaromycessp.）和新殼梭孢屬（Neofusicoccumsp.）等不同屬。研究結(jié)果認(rèn)為，馬利筋內(nèi)生真菌的生物活性具有多樣性，可為從馬利筋內(nèi)生真菌中挖掘潛在新型天然抗腫瘤、抗炎、降糖和抗氧化活性化合物奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：馬利筋，內(nèi)生真菌，抗腫瘤，抗炎，α葡萄糖苷酶抑制劑，DPPH自由基，ITS

中圖分類號(hào)：Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：10003142（2022）05078109

Biologicalactivitiesofendophyticfungi

fromAsclepiascurassavica

Abstract：Endophyticfungiinmedicinalplantshavethecapacitytoproducebioactivecompoundswhosefeatureshavegreatidentityorsimilaritywiththephytohosts.SinceAsclepiascurassavicahasbeenknowntopossessabroadrangeofbiologicalactivities，wesoughttoobtaintheactiveendophyticfungifromthisplant.Weperformedthestudyfollowedtheideaof“ethnicdrug-endophyticfungi-activeingredients”，andthereafterweexaminedthebioactivitiesoffungalmetabolitesfrom168strainsofendophyticfungiisolatedfromA.curassavica.Toevaluatethebiologicalactivitiesofantitumor，antiinflammatory，antiαglucosidaseandantioxidantinthesefungi，theethylacetateextractsfromfermentationbrothofendophyticfungiwerefirstdeterminedusingthemethodsofSRB，Griess，PNPGandDPPH，respectively.Furthermore，weidentifiedthebioactivefungalstrainswithconservedITSsequencing.Theresultswereasfollows：（1）Atotalof22in168isolatedstrainshadvariablebiologicalactivities.NinestrainshadobviousantitumoreffectwiththeIC50valuesof0.1-40μg·mL1.Further，thestrainMJF53displayedprominentinhibitoryeffectsonthereleaseofbothNOandIL1βinRaw264.7celllinebyLPSinductionundertheconcentrationof2.5μg·mL1.ThereweresevenstrainsshowingαglucosidaseinhibitoryactivitywiththeIC50valuesrangingfrom1.0to4.0mg·mL1，especially，theinhibitoryactivitiesofMYF16andMYF55wereclosetoacarbose;19endophyticfungihaddifferentdegreesofDPPHfreeradicalscavengingactivities，amongwhichMYF9，MYF19andMJF84showedmoderateantioxidantactivitieswithIC50valuesof13.562，17.776and12.395μg·mL1respectively.（2）TheITSidentificationshowedthatthe22activestrainsweremainlydistributeinsixgenera：Alternariasp.，Colletotrichumsp.，F(xiàn)usariumsp.，Diaporthesp.，Talaromycessp.andNeofusicoccumsp.ThisstudyindicatesthatthebioactivitiesoftheendophyticfungifromA.curassavicaarediverse，whichlaysafoundationforexploringnewpotentialnaturalantitumor，antiinflammatory，hypoglycemicandantioxidantcompoundsfromtheendophyticfungiofA.curassavica.697B9528-575B-4F9E-B926-7C77DA6C1103

Keywords：Asclepiascurassavica，endophyticfungus，antitumor，antiinflammatory，αglucosidaseinhibitor，DPPHfreeradical，ITS

植物內(nèi)生真菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部，而不使宿主植物產(chǎn)生病變和排斥反應(yīng)的真菌（Hardoimetal.，2015）。藥用植物內(nèi)生真菌在抗腫瘤、抗微生物、抗炎、抗氧化、降糖、殺蟲(chóng)等方面有較好的生物活性。Wei等（2020）從莞根中分離得到內(nèi)生真菌pr10能顯著抑制A549的生長(zhǎng);Ran等（2017）從喜樹(shù)組織中分離獲得能產(chǎn)抗腫瘤化合物喜樹(shù)堿的內(nèi)生真菌;Sailesh等（2020）從黃芩根中分離的內(nèi)生真菌QF001，其代謝產(chǎn)物能夠有效抑制LPS刺激Raw264.7中促炎細(xì)胞因子NO、TNFα和IL6的表達(dá);Geethanjali等（2019）從長(zhǎng)春花中分離的黑毛殼菌代謝物乙酸乙酯提取物具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性;Afra等（2015）研究發(fā)現(xiàn)葫蘆種子和苦杏內(nèi)生真菌代謝物具有較強(qiáng)的抗氧化能力;鄭喜等（2014;2015）從昆明山海棠中分離獲得一株具有抑制α糖苷酶作用的鏈革孢屬真菌ThF63和一株具有抗菌和殺蟲(chóng)活性的簡(jiǎn)青霉ThF11。因此，藥用植物內(nèi)生真菌被認(rèn)為是活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源（Sanjanaetal.，2012）。近年來(lái)，從藥用植物內(nèi)生真菌中尋找新型天然活性化合物已成為新的研究熱點(diǎn)，藥用植物內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的多樣性為尋找新穎天然活性化合物提供了有效途徑。

馬利筋（Asclepiascurassavica）是云南傣醫(yī)常用藥，性涼、味甘，具有調(diào)經(jīng)活血、止痛退熱、消炎散腫的功效（蔣振忠和馮德強(qiáng)，2006），被廣泛用于強(qiáng)心、癌癥、哮喘、發(fā)燒、炎癥、腹瀉、淋病、風(fēng)濕、心血管等疾病的治療（楊衛(wèi)平等，2016;李岡榮，2017;蔣洪和宋緯文，2017）。目前，馬利筋的研究主要集中在藥效學(xué)方面，研究表明馬利筋提取物具有抗菌、抗癌、心血管、鎮(zhèn)痛、解熱等多種藥理活性（Raja&Ravindranadh，2014;Ali，2015）;藥效機(jī)制方面，Zheng等（2019）研究發(fā)現(xiàn)馬利筋乙酸乙酯提取物能顯著抑制A549、Hela、SKOV3、MGC803、NICH1975等多株腫瘤細(xì)胞的增殖，通過(guò)激活P38和JNKMAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)NICH1975發(fā)生凋亡。然而，有關(guān)馬利筋內(nèi)生真菌及其生物活性的研究鮮有報(bào)道。

藥用植物中蘊(yùn)藏著豐富多樣的內(nèi)生真菌，與宿主植物長(zhǎng)期進(jìn)化使之能產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性物質(zhì)（王景儀等，2020）。Stierle等（1993）從紅豆杉中分離獲得產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌。因此，從藥用植物內(nèi)生真菌中尋找天然活性產(chǎn)物是一條有效的途徑。基于此，我們提出了“馬利筋內(nèi)生真菌可能具有抗腫瘤、抗炎癥和抗氧化等生物活性”的科學(xué)假說(shuō)，并基于“藥用植物-內(nèi)生菌-生物活性”的研究思路，首次以馬利筋內(nèi)生真菌為研究對(duì)象，對(duì)168株西雙版納產(chǎn)馬利筋內(nèi)生真菌進(jìn)行抗腫瘤、抗炎、α葡萄糖苷酶抑制及DPPH自由基清除等活性研究，以期為后續(xù)從中深入發(fā)掘潛在新型天然抗腫瘤、抗炎、降糖和抗氧化等活性化合物奠定良好基礎(chǔ)，這對(duì)保護(hù)民族藥馬利筋野生資源具有重要意義。

1材料與方法

1.1內(nèi)生真菌和供試細(xì)胞株

168株供試內(nèi)生真菌是從產(chǎn)自云南西雙版納的新鮮馬利筋的莖和葉中分離獲得，其中莖中分離獲得106株（MJF1～MJF106），葉中分離獲得62株（MYF1～MYF62），菌株培養(yǎng)于PDA和PDB培養(yǎng)基中。供試細(xì)胞株為人肺腺癌細(xì)胞NICH1975、人乳腺癌細(xì)胞MCF7、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、人宮頸癌細(xì)胞Hela、人肝癌細(xì)胞株HepG2和小鼠單核巨噬細(xì)胞Raw264.7。其中，NICH1975和MCF7采用RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，其他細(xì)胞株采用DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。以上細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.2培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH自然。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH自然。RPMI1640完全培養(yǎng)基：RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基900mL，胎牛血清100mL，雙抗10mL，混合均勻。DMEM高糖完全培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基900mL，胎牛血清100mL，雙抗10mL，混合均勻，4℃冰箱保存、備用。

1.3主要儀器和設(shè)備

DHZ052D型恒溫?fù)u床（上海博彩生物科技有限公司）、DHP9052型恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、Heidolph型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德祥科技有限公司）、SpectraMaxi3x型多功能酶標(biāo)儀（美谷分子儀器（上海）有限公司）、二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermofisherScientific）。

1.4內(nèi)生真菌的培養(yǎng)及提取物的制備

挑取分離所得的馬利筋內(nèi)生真菌到新鮮PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，活化后的內(nèi)生真菌接種于PDB培養(yǎng)基中，28℃、150r·min1搖床培養(yǎng)8d，過(guò)濾菌絲，收集發(fā)酵液并用乙酸乙酯萃取3次，萃取物于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮得提取物浸膏，將提取物浸膏用DMSO溶解配成初始濃度200mg·mL1的母液，4℃冰箱保存、備用。

1.5腫瘤細(xì)胞毒活性測(cè)定

采用SRB法（Skehanetal.，1990）進(jìn)行腫瘤細(xì)胞毒活性測(cè)定，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞株NICH1975、MCF7、HCT116、Hela和HepG2按4×104個(gè)·mL1接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，加入100μL不同濃度（40、20、10、5、2.5、1.25μg·mL1）提取物，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)3個(gè)對(duì)照孔，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，棄培養(yǎng)上清，每孔加入4℃預(yù)冷的10%的TCA100μL，4℃固定1h后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然風(fēng)干。每孔加入4mg·mL1的SRB溶液100μL，室溫染色15min，棄上清液，用1%醋酸洗滌5次，空氣干燥，每孔加入100μL的Tris（10mmol·L1）溶液，室溫下放置5min，于560nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。按以下公式計(jì)算各菌株提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，半數(shù)抑制濃度IC50值采用Origin軟件計(jì)算。697B9528-575B-4F9E-B926-7C77DA6C1103

I（%）=（Ay-Ac）/Ac×100。

式中：I代表抑制率;Ay代表給藥組OD值;Ac代表對(duì)照組OD值。

1.6抗炎活性測(cè)定

1.6.1細(xì)胞活力測(cè)定采用SRB法（Skehanetal.，1990）檢測(cè)各提取物對(duì)Raw264.7細(xì)胞活力的影響，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按每孔3×105個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，設(shè)置內(nèi)生真菌提取物組和對(duì)照組，提取物組加入50μL不同濃度（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μg·mL1）提取物和50μLDMEM高糖完全培養(yǎng)基，對(duì)照組加入100μL培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加藥后，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，SRB法檢測(cè)Raw264.7細(xì)胞活力。

1.6.2LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞中NO測(cè)定采用Griess法（Kimetal.，2020）進(jìn)行NO檢測(cè)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7細(xì)胞按每孔3×106個(gè)接種于96孔板中，每孔100μL。將細(xì)胞分為空白組（DMEM培養(yǎng)基）、模型組（1.5μg·mL1LPS+DMEM培養(yǎng)基）和內(nèi)生真菌提取物組[1.5μg·mL1LPS+各濃度提取物（2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625μg·mL1）]，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加藥后，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)上清，采用Griess法檢測(cè)培養(yǎng)上清中NO水平。

1.6.3LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞中IL6、IL1β和TNFα的測(cè)定按1.6.2的方法對(duì)Raw264.7細(xì)胞進(jìn)行處理，按照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細(xì)胞介素6（IL6）、白細(xì)胞介素1β（IL1β）水平，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清中各種炎癥因子的含量。

1.7α葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

參照鄭喜等（2015）方法，將內(nèi)生真菌提取物和阿卡波糖用pH6.8的磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度，α葡萄糖苷酶凍干粉配成濃度為0.8U·mL1溶液，底物（PNPG）配成濃度2.5mmol·L1溶液。設(shè)置對(duì)照組（磷酸鹽緩沖液+酶液+底物）、空白對(duì)照組（磷酸鹽緩沖液）、樣本測(cè)定組（磷酸鹽緩沖液+提取物+酶液+底物）、樣本對(duì)照組（磷酸鹽緩沖液+提取物）和陽(yáng)性對(duì)照組（磷酸鹽緩沖液+阿卡波糖+酶液+底物），依次加入20μL提取物或阿卡波糖（5、2.5、1.25、0.625mg·mL1）、20μL磷酸鉀緩沖液、20μLα葡萄糖苷酶，37℃恒溫孵育15min后，加入20μL2.5mmol·L1的PNPG，37℃恒溫反應(yīng)15min，再加入80μL0.1mol·L1的NaCO3溶液終止反應(yīng)，于405nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值A(chǔ)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按以下公式計(jì)算抑制率，并用Origin軟件計(jì)算IC50值。

I（%）=[1-（Ast-Asc）/（Ac-Ab）]×100。

式中：I代表抑制率;Ast代表樣本測(cè)定組OD值;Asc代表樣本對(duì)照組OD值;Ac代表對(duì)照組OD值;Ab代表空白對(duì)照組OD值。

1.8DPPH自由基清除活性測(cè)定

參照Guo等（2020）方法進(jìn)行測(cè)定，將內(nèi)生真菌提取物和維生素C用無(wú)水乙醇稀釋至所需濃度，DPPH用無(wú)水乙醇配成0.2mmol·L1的溶液。分別將100μL各濃度測(cè)試提取物溶液（800、400、200、100、50μg·mL1）和100μLDPPH溶液加入到96孔板中，輕輕混勻，室溫下避光靜置反應(yīng)30min后于517nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度As，同時(shí)測(cè)定100μLDPPH溶液與100μL無(wú)水乙醇混合后的吸光度Ab，以及200μL無(wú)水乙醇的吸光度值A(chǔ)ref。按以下公式計(jì)算提取物對(duì)DPPH自由基的清除率，并用Origin軟件計(jì)算IC50值。

I（%）=[（As-Aref）-（Ab-Aref）]/（Ab-Aref）×100。

式中：I代表DPPH自由基清除率;As代表測(cè)試樣本和DPPH混合溶液OD值;Ab代表DPPH和無(wú)水乙醇混合溶液OD值;Aref代表無(wú)水乙醇OD值。

1.9活性菌株的鑒定

參照譚小明等（2014）的方法進(jìn)行活性菌株鑒定，將純化好的活性菌株菌絲（0.5～1g）在液氮中迅速研磨成粉，參照天根真菌DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取真菌DNA。同時(shí)，采用通用引物ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）和ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）按以下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃，4min;95℃，30s，56℃，30s，72℃，1min，30個(gè)循環(huán);72℃，10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并委托擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，反饋序列通過(guò)NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行比對(duì)，確定活性菌株種屬。

2結(jié)果與分析

2.1馬利筋內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞生存率的影響

采用SRB法測(cè)定168株馬利筋內(nèi)生真菌抗腫瘤活性，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，9株內(nèi)生真菌提取物表現(xiàn)出廣譜而顯著細(xì)胞毒作用，其中以MYF16活性最強(qiáng)，活性強(qiáng)于順鉑。大部分活性菌株對(duì)NICH1975、HCT116和Hela較MCF7和HepG2敏感，具有更好的抑制作用;菌株MJF33對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞較為敏感，其IC50為0.147μg·mL1，而對(duì)其他4株腫瘤細(xì)胞的IC50>10μg·mL1;從菌株分布來(lái)看，活性菌株主要集中于馬利筋的莖，有8株，而葉中僅獲得1株活性菌株MYF16;來(lái)源于莖中的內(nèi)生真菌活性弱于葉中內(nèi)生真菌，可能跟宿主馬利筋抗腫瘤活性成分主要集中于葉有關(guān)。

2.2MJF53對(duì)LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞中IL6、IL1β和TNFα的影響697B9528-575B-4F9E-B926-7C77DA6C1103

通過(guò)建立炎癥細(xì)胞模型，測(cè)定各內(nèi)生真菌代謝物對(duì)Raw264.7細(xì)胞中NO的影響，發(fā)現(xiàn)菌株

MJF53在濃度小于2.5μg·mL1時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，且能濃度依賴性抑制NO的分泌（圖1：a，b）。進(jìn)一步測(cè)定MJF53對(duì)LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞中IL6、IL1β和TNFα的影響，發(fā)現(xiàn)該菌株提取物在濃度2.5μg·mL1時(shí)能選擇性抑制IL1β的產(chǎn)生，而對(duì)TNFα和IL6的分泌無(wú)影響（圖1：c，d），推測(cè)MJF53可能通過(guò)選擇性抑制促炎因子IL1β分泌上游相關(guān)信號(hào)通路從而抑制炎癥發(fā)生。

2.3馬利筋內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)α葡萄糖苷酶活性的影響

通過(guò)α葡萄糖苷酶抑制活性篩選獲得7株對(duì)α葡萄糖苷酶具有較好抑制活性的內(nèi)生真菌，抑制作用呈濃度依賴性，在濃度5mg·mL1時(shí)對(duì)α葡萄糖苷酶表現(xiàn)出顯著抑制作用，抑制率>70%，各活性菌株IC50值均小于4mg·mL1。其中，MYF16和MYF55對(duì)α葡萄糖苷酶的抑制活性最強(qiáng)，其IC50值分別為1.996和1.823mg·mL1，抑制活性接近阿卡波糖。結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

2.4馬利筋內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除活性的影響

采用DPPH法對(duì)168株內(nèi)生真菌提取物進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在濃度800μg·mL1時(shí)，有19株內(nèi)生真菌提取物對(duì)DPPH自由基的清除率均在50%以上，其中11株清除率在80%以上，菌株MYF9、MYF19和MJF84表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，IC50分別為13.562、17.776和12.395μg·mL1。從菌株分布來(lái)看，DPPH自由基清除活性菌株有13株分布于馬利筋的莖中，6株分布于葉中。結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

2.5活性菌株ITS鑒定結(jié)果

NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)活性菌株序列相似度均接近100%，主要分布于鏈格孢屬（Alternariasp.）、刺盤(pán)孢屬（Colletotrichumsp.）、鐮刀菌屬（Fusariumsp.）、間座殼屬（Diaporthesp.）、踝節(jié)菌屬（Talaromycessp.）和新殼梭孢屬（Neofusicoccumsp.）6個(gè)屬，結(jié)果見(jiàn)表6。從表6可以看出，活性菌株主要集中分布于鏈格孢屬和間座殼屬2個(gè)屬，其中9株屬于鏈格孢屬，5株屬于間座殼屬，其他4個(gè)屬僅有8株，鏈格孢屬和間座殼屬可能是馬利筋優(yōu)勢(shì)活性菌株種屬。

3討論與結(jié)論

藥用植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、種類多樣和生物活性廣泛的次生代謝產(chǎn)物，是活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源（Geethanjalietal.，2019）。在與宿主長(zhǎng)期共寄生過(guò)程中宿主可能將其遺傳物質(zhì)或信息傳遞給其內(nèi)生真菌，使之具有和宿主相同或類似的代謝途徑，導(dǎo)致內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似生物活性的物質(zhì)。馬利筋作為傣藥被廣泛用于癌癥、哮喘、強(qiáng)心、炎癥、風(fēng)濕、發(fā)燒、腹瀉、淋病和心血管等疾病的治療（蔣洪和宋緯文，2017;李岡榮，2017），提示其具有多種生物活性，以抗腫瘤和抗炎活性引起廣泛關(guān)注。前期研究我們發(fā)現(xiàn)馬利筋具有顯著而廣譜的抗腫瘤活性，通過(guò)激活p38和JNKMAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)NICH1975細(xì)胞凋亡介導(dǎo)抗腫瘤（Zhengetal.，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)MYF16具有顯著而廣譜的生物活性，其抗腫瘤活性尤為顯著，對(duì)NICH1975最強(qiáng)，推測(cè)MYF16可能產(chǎn)生宿主馬利筋相同或相似生物活性的物質(zhì)，研究結(jié)果與前期報(bào)道的紅豆杉內(nèi)生真菌能產(chǎn)紫杉醇（Stierleetal.，1993;Somjaipengetal.，2015）以及喜樹(shù)內(nèi)生真菌產(chǎn)喜樹(shù)堿（Ranetal.，2017）相似。因此，活性菌株MYF16可作為目標(biāo)菌株進(jìn)一步深入探討其活性代謝產(chǎn)物及抗腫瘤作用機(jī)制。

NLRP3炎癥小體的激活在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中具有重要作用（Maoetal.，2017）。ATP等信號(hào)分子

促進(jìn)胞內(nèi)鉀離子外流介導(dǎo)NLRP3、ASC和caspase1組裝成蛋白嵌合體，進(jìn)而激活caspase1自身剪切產(chǎn)生p20和p10兩個(gè)亞基，介導(dǎo)促炎因子IL1β和IL18剪切成熟釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生（丁楊和胡容，2018）。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株MJF53在2.5μg·mL1時(shí)無(wú)明顯毒性且能有效抑制LPS誘導(dǎo)的Raw264.7中促炎因子NO和IL1β的分泌，推測(cè)該菌株可能產(chǎn)生抑制IL1β分泌的抗炎活性成分，通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體激活抑制IL1β剪切成熟釋放介導(dǎo)抗炎作用，具體的抗炎機(jī)制及體內(nèi)抗炎作用需要進(jìn)一步深入確證。

藥用植物中蘊(yùn)藏著豐富多樣的內(nèi)生真菌，內(nèi)生真菌是天然活性化合物的重要來(lái)源。ITS鑒定發(fā)現(xiàn)，22株活性菌株分屬于鏈格孢屬、刺盤(pán)孢屬、鐮刀菌屬、間座殼屬、踝節(jié)菌屬和新殼梭孢屬6個(gè)屬，其中9株屬于鏈格孢屬，5株屬于間座殼屬，廣譜活性菌株MYF16、MJF53和MJF64也分屬于這2個(gè)屬。由此推測(cè)，鏈格孢屬和間座殼屬可能是馬利筋優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌，結(jié)果與譚小明等（2015）報(bào)道的鏈格孢屬、鐮刀菌屬、刺盤(pán)孢屬等真菌是藥用植物的優(yōu)勢(shì)菌群相符。此外，內(nèi)生真菌資源多樣性與宿主植物所處的環(huán)境密切有關(guān)，劉蕓等（2010）研究表明虎杖組織中內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量與季節(jié)密切相關(guān);賈敏等（2014）研究發(fā)現(xiàn)不同

地域銀杏內(nèi)生真菌的種類差別很大。因此，為了獲得更加豐富的馬利筋活性內(nèi)生真菌資源，可以選擇不同季節(jié)、多個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行采樣后對(duì)不同部位進(jìn)行分離、鑒定。

綜上所述，本研究篩選獲得多株具有抗腫瘤、抗炎、抑制α葡萄糖苷酶和清除DPPH自由基等活性的菌株，為從馬利筋內(nèi)生真菌中深入發(fā)掘抗腫瘤、抗炎、降糖和抗氧化活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)，對(duì)于開(kāi)發(fā)傣藥馬利筋植物資源和拓展傣藥馬利筋應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。

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（責(zé)任編輯蔣巧媛）

收稿日期：2021-03-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81960745）;云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目（2019FB123）;云南省科技廳-云南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)聯(lián)合專項(xiàng)（2018FF001[077]），2018FF001[009]）

第一作者：殷娜（1994-），碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬镒饔眉皺C(jī)制，（Email）2711732008@qq.com。

通信作者：鄭喜，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴幒臀⑸锾烊划a(chǎn)物藥理，（Email）Zhengxi138@163.com。697B9528-575B-4F9E-B926-7C77DA6C1103