張強　黃卓然　胡康龍　許超　楊青青　薛濤

摘要：大豆RLPK2基因（GenBank登錄號：AY687391）是一個編碼N末端富含亮氨酸重復序列的類受體蛋白激酶基因。為分析大豆RLPK2基因的功能，該研究以野生型擬南芥和大豆RLPK2基因過表達擬南芥植株為材料，通過農(nóng)桿菌介導法轉化野生型擬南芥，構建了大豆RLPK2基因過表達載體，分析了葉片衰老過程中葉綠素熒光參數(shù)、抗氧化酶活性及衰老相關基因表達量的變化。結果表明：（1）無論是野生型還是轉基因擬南芥，隨著葉片衰老進程的進行，光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的最大光化學效率（Fv/Fm）、PSⅡ實際光化學效率（ΦPSⅡ）、光化學淬滅系數(shù)（qP）和光合電子傳遞速率（ETR）均呈下降趨勢，但后者下降趨勢更明顯;（2）激發(fā)壓（1qP）在葉片衰老前期的變化較為平穩(wěn)，后期則急劇增加，且轉基因型比野生型擬南芥增加更明顯;（3）在葉片衰老的各個時期，轉基因擬南芥葉片丙二醛（MDA）含量均顯著高于野生型，而超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性均顯著低于野生型;（4）實時熒光定量PCR檢測結果表明，RLPK2轉基因擬南芥中衰老標志基因ATSAG12，衰老關鍵轉錄因子ATNAP、ATWRKY6和葉綠素降解關鍵酶編碼基因ATACD1表達量顯著上調(diào)。綜上認為，大豆類受體蛋白激酶基因RLPK2參與調(diào)控植物葉片衰老進程，其表達對葉片衰老具有促進作用。

關鍵詞：大豆RLPK2基因，葉片衰老，激發(fā)壓，抗氧化酶，丙二醛

中圖分類號：Q943;S565.1

文獻標識碼：A

文章編號：10003142（2022）05072909

Overexpressionnofsoybeanreceptorlikeproteinkinase

RLPK2genefromGlycinemaxpromotestransgenic

Arabidopsisthalianaleafsenescence

ZHANGQiang，HUANGZhuoran，HUKanglong，XUChao，YANGQingqing，XUETao*

Abstract：SoybeanRLPK2gene（GenBankaccessionNo.AY687391）isareceptorlikeproteinkinasegenethatencodesaleucinerichrepeat（LRR）receptorkinasetypeproteinencodedwithaNterminal.InordertofurtheranalyzethefunctionofthesoybeanRLPK2gene，theoverexpressionvectoroftheRLPK2genewasconstructedviaagrobacteriummediatedtransformationofArabidopsisthaliana.Inthisstudy，wildtype（WT）andtransgenicA.thalianaplantswereusedasmaterials，andthevariationsinchlorophyllfluorescenceparametersandtheactivitiesofantioxidantenzymesaswellastheexpressionlevelsofsenescenceassociatedgenesintheagingprocessofleaveswereinvestigated.Theresultswereasfollows：（1）BothWTandtransgenicplantstendedtodecreasetheefficiencyofprimaryconversionoflightenergyofphotosystemⅡ（PSⅡ）（Fv/Fm），actualphotochemicalefficiencyofPSⅡ（ΦPSⅡ），photochemicalquenchingcoefficient（qP）andelectrontransportrate（ETR）whilethelattershowedamoreobviousdecreasingpatternasagingprogressed.（2）ThePSⅡexcitationpressure（estimatedas1qP）wasrelativelystableintheearlystageofleafsenescence，andincreasedsharplyinthelaterstageofleafsenescence，whilethetransgenicplantsshowedamoreobviousincreasingtrend.（3）Atdifferentleafsenescencestages，themalondialdehyde（MDA）contentwassignificantlyhigherintransgenicplantsthanthatinWT，whiletheactivitiesofsuperoxidedismutase（SOD），peroxidase（POD）andcatalase（CAT）weresignificantlylowerintransgenicplantsthanthoseinWT.（4）Additionally，therealtimequantitativeRTPCRshowedthattheexpressionlevelsofagingmarkergeneATSAG12，criticalsenescenceassociatedtranscriptionfactorsATNAP，ATWRKY6andchlorophylldegradationkeyenzymeencodinggeneATACD1increasedintransgenicplants.Insummary，transgenicA.thalianaexhibitedfasterleafsenescencecomparedwithWT，andtheexpressionofthesoybeanreceptorlikeproteinkinaseRLPK2geneplayedanimportantroleinpromotingleafsenescence.032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739

Keywords：soybeanRLPK2gene，leafsenescence，excitationpressure，antioxidantenzyme，malondialdehyde（MDA）

作為進行光合作用的主要器官，葉片的生長發(fā)育優(yōu)劣直接影響作物的生長、產(chǎn)量及品質。葉片衰老是葉片生長發(fā)育進程中的最終階段，它不是葉片細胞的簡單死亡過程，而是一種主動的、受細胞內(nèi)部遺傳程序控制的、器官水平上動態(tài)的細胞程序性死亡過程，并且受到外部多種環(huán)境因素（光照、水分、溫度、礦質元素和微生物）及內(nèi)部發(fā)育信號（激素、遺傳和基因調(diào)控）的協(xié)調(diào)控制（初夢圓和于延沖，2019）。此外，葉片衰老還與Ca2+、糖、活性氧（relativeoxygenspecies，ROS）水平和內(nèi)源激素的變化等因素密切相關（張藝函等，2019）。葉片衰老主要表現(xiàn)為光合同化能力下降，細胞結構的退化，光合色素包括葉綠素和類胡蘿卜素的降解，蛋白質和核酸降解，ROS與丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量增加，水解酶及生長抑制因子持續(xù)增長等，這些特征在多種植物中已有描述（Wooetal.，2013;Wangetal.，2016）。葉片衰老能夠增強植物對生存環(huán)境的適應性，從而有利于其生存和延續(xù)。但對農(nóng)作物的生長而言，植物過早衰老引起的葉片同化功能的減退也極大地影響和限制了農(nóng)作物產(chǎn)量潛力的發(fā)揮，導致作物品質及產(chǎn)量的損失。因此，對葉片衰老機理的研究不僅在揭示植物的生態(tài)適應等方面具有一定意義，還在糧食生產(chǎn)上抑制早衰具有重要意義。大豆在我國播種面積僅次于玉米、水稻、小麥和馬鈴薯，是第五大糧食作物，其含有豐富的植物蛋白質，同時又可用來榨油，因此是我國重要的油料作物。相關研究表明，葉片早衰嚴重影響著大豆正常的生長發(fā)育，并會引起產(chǎn)量及品質的下降（呂林濤，2018）。鑒定大豆葉片衰老相關基因及其功能對于提高大豆的優(yōu)質高產(chǎn)和育種改良具有重要的科學意義和深遠的應用價值。

植物類受體蛋白激酶（receptorlikeproteinkinase，RLKs）具有特殊的蛋白質結構，在植物中普遍存在，占植物蛋白激酶總量的60%，是植物中較大的基因家族之一，參與細胞信號轉導途徑過程，并在植物的生長發(fā)育和環(huán)境的適應過程中具有重要作用（Shiu&Bleecker，2001）。其中，富含亮氨酸重復序列（leucinerichrepeat，LRRs）型類受體蛋白激酶是RLKs中最大的一個亞家族（Coletteetal.，2011）。迄今為止，LRRsRLKs蛋白的結構特點和表達模式在擬南芥（阿依江·哈拜克等，2014）、煙草（曾建斌，2011）、花生（莊瑞蓉等，2018）、馬鈴薯（謝潔等，2019）等植物中均有研究。相關研究表明，LRRRLKs在植物整個生長發(fā)育過程中具有重要作用（Diévart&Clark，2004）。謝潔等（2019）發(fā)現(xiàn)馬鈴薯LRR類受體蛋白激酶SCLRRK1在低溫條件下表達受到抑制，證實其參與低溫脅迫響應過程。Zhou等（2016）發(fā)現(xiàn)LRRRLKs型基因調(diào)節(jié)擬南芥花藥的發(fā)育過程。作為LRRRLKs家族中被研究較為廣泛的一員，BAK1在油菜素內(nèi)酯（BR）信號轉導途徑（Heetal.，2007）、植物先天免疫反應（韋莉等，2019）、細胞死亡調(diào)控（Zhouetal.，2019）等方面發(fā)揮作用。大豆RLPK2基因（GenBank登錄號：AY687391）是植物分子遺傳學研究組李小平副教授前期以大豆科豐34為材料篩選到的一個編碼N末端富含亮氨酸重復序列的類受體蛋白激酶基因，前期研究結果發(fā)現(xiàn)人工誘導衰老處理顯著提高了該基因在大豆初生葉片中的轉錄水平，初步分析顯示該基因可能參與大豆葉片衰老的調(diào)控過程。本研究在此基礎上構建了大豆RLPK2基因過表達載體并轉化野生型擬南芥，對轉基因擬南芥葉片衰老進程進行分析，進一步揭示該基因在植物葉片衰老中的功能，以期為延緩葉片衰老從而提高大豆作物產(chǎn)量和改善作物品質提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料及培養(yǎng)方法

本試驗所使用的擬南芥（Arabidopsisthaliana）為哥倫比亞野生型（WT）擬南芥（Columbia0）。培養(yǎng)環(huán)境條件如下：溫度為20～25℃，光暗周期為16h光照/8h黑暗，光照強度為100SymbolmA@

mol·m2·s1，相對濕度為80%。

1.2總RNA的提取和反轉錄

采用QIAGEN的植物RNA提取試劑盒RNeasyPlantMiniKit按照操作說明提取大豆品種科豐34葉片總RNA，經(jīng)微量紫外分光光度計（Merinton，美國）檢測其純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，利用Thermo公司提供的cDNA試劑盒按照反轉錄說明書合成cDNA第一條鏈。

1.3RLPK2全長cDNA引物設計及RTPCR基因擴增

利用PrimerPremier5.0軟件設計RLPK2基因的特異性引物，根據(jù)Gateway技術構建表達載體的要求，在引物5′端加上AAAAAGCAGGCTCG，引物序列如下：

RLPK2OXF：5′AAAAAGCAGGCTCGATGAGA

TCAGTAAGTTCCCCTG3′;

RLPK2OXR：5′AGAAAGCTGGGTTTTAATCT

CTCTTCTCCAAGTAAGAAG3′。

采用高保真PhusionDNA聚合酶進行PCR擴增。反應程序：94℃預變性30s，35個循環(huán)（94℃30s，62℃30s，72℃30s），循環(huán)結束后72℃10min延伸反應，4℃保溫。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，回收特異性目標條帶，送樣測序，選取測序正確的克隆進行后期載體的構建。

1.4RLPK2過表達載體構建、擬南芥遺傳轉化及純合體篩選032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739

通過農(nóng)桿菌介導法將重組植物過表達載體pB2GW7轉入野生型擬南芥，并將收取的種子種在含有20mg·L1的Basta的1/2MS培養(yǎng)基上篩選陽性植株，提取T3代轉基因植株總RNA，反轉錄成cDNA，利用特異性引物對轉基因植株進行RTqPCR鑒定，選取其進行后續(xù)表型實驗。

1.5葉綠素熒光參數(shù)測定

使用便攜式葉綠素熒光測定儀（PAM2500，德國）測定100SymbolmA@

mol·m2·s1光強下植株葉片的穩(wěn)態(tài)熒光Fs、最大熒光Fm′和最小熒光Fo′后，將葉片暗適應30min后，測定初始熒光Fo和暗下最大熒光Fm。根據(jù)測定的熒光參數(shù)計算得出光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）最大光化學效率Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm，實際光化學量子效率ΦPSⅡ=（Fm′-Fs）/Fm′，光化學淬滅系數(shù)qP=（Fm′-Fs）/（Fm′-Fo′），光合電子傳遞速率ETR=ΦPSⅡ×PPFD×A×0.5，式中：PPFD是光輻射通量;A是葉片吸收光能系數(shù)。

1.6MDA含量和抗氧化酶活性測定

取樣葉0.1g在液氮中充分研磨后立即轉入含有1mL50mmol·L1磷酸緩沖溶液（pH7.8，含1mmol·L1EDTA和1%PVP）的離心管中，在4℃下15000g離心15min，取上清液棄沉淀，再15000g離心5min，回收上清液用于MDA含量和抗氧化酶活性的測定?？寡趸富钚缘臏y定參照文獻（陳斌等，2015）。超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測采用氮藍四唑（NBT）光化還原法;過氧化物酶（POD）活性檢測采用愈創(chuàng)木酚法;過氧化氫酶（CAT）活性檢測活性采用H2O2分解法測定。MDA含量的測定參考中國科學院上海植物生理研究所（1999）的方法。

1.7轉RLPK2基因擬南芥中衰老相關基因表達

RNA提取步驟同上，其反轉錄及定量PCR體系的配制均依據(jù)QuantRTPCRkit（SYBRGreen）的說明書操作，具體數(shù)據(jù)分析參照Xue等（2017）步驟進行。

1.8數(shù)據(jù)分析

所得試驗數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel2019軟件和IBMSPSS22.0軟件進行處理，采用studentt檢驗方法檢驗不同處理之間的差異顯著性（P<0.05，差異顯著）。采用SigmaPlot14.5軟件完成作圖。

2結果與分析

2.1超表達RLPK2基因促進轉基因擬南芥衰老

選取篩選得到的2個T3代純系進行表型分析，首先通過RTPCR比較分析野生型及兩個轉基因系OX1和OX2中的RLPK2的基因表達量。結果顯示野生型中未檢測到該基因，而兩個轉基因株系中均有顯著的擴增條帶，表明兩個轉基因純系確為RLPK2的超表達株系（圖1）。比較生長4周時的野生型及轉基因株系的擬南芥表型，可見兩轉基因株系擬南芥的抽苔和開花時間較野生型明顯提前（圖1），表明RLPK2促進擬南芥衰老進程。

2.2MDA含量

在三個不同發(fā)育時期，轉RLPK2基因擬南芥植株葉片的MDA含量顯著高于WT擬南芥（圖2）。MDA是自由基作用于細胞膜脂發(fā)生過氧化反應的最終產(chǎn)物之一，能在一定程度上反映氧化脅迫是否發(fā)生以及發(fā)生的程度。結果表明，超表達RLPK2基因可以引起擬南芥發(fā)生氧化脅迫。

2.3抗氧化酶系

為深入分析RLPK2基因過表達對植株細胞抗氧化性狀的影響，分別檢測了三個不同發(fā)育時期WT和RLPK2轉基因擬南芥植株葉片的SOD、POD和CAT酶活性，結果如圖3所示。由圖3可知，在同一生長發(fā)育時期轉基因擬南芥植株葉片的SOD、POD和CAT酶活性顯著低于WT。試驗結果表明，超表達RLPK2基因使胞內(nèi)ROS清除系統(tǒng)的功能降低，從而導致膜系統(tǒng)受到傷害，并進一步造成膜結構和功能的破壞。

2.4葉綠素熒光

如圖4所示，無論是WT還是RLPK2轉基因擬南芥植株在衰老的前期和中期葉片F(xiàn)v/Fm幾乎未變，然而在衰老末期，衰老導致了擬南芥葉片F(xiàn)v/Fm明顯降低，且轉基因擬南芥下降的更加明顯。在擬南芥葉片衰老過程中還有一個明顯的PSⅡ激發(fā)壓上升階段，且轉基因擬南芥比WT擬南芥上升更明顯，表明前者比后者電子流受阻嚴重。此外，PSⅡ光合電子傳遞量子效率ΦPSⅡ、光化學淬滅系數(shù)qP和光合電子傳遞速率ETR在擬南芥葉片衰老過程中均呈降低趨勢，且轉基因擬南芥下降更明顯，表明在生育后期衰老過程中，轉基因型比野生型葉片的PSⅡ功能下降更快，并且具有較低的光能利用效率。

2.5超表達RLPK2基因對擬南芥衰老相關基因表達的影響

為進一步研究RLPK2基因異源過表達對轉基因擬南芥中各衰老相關基因和衰老轉錄因子表達量的影響，本研究利用RTPCR檢測衰老標志基因ATSAG12，衰老關鍵轉錄因子ATNAP、ATWRKY6和葉綠素降解關鍵基因ATACD1的表達變化情況。與WT擬南芥相比，RLPK2基因異源過表達顯著促進了上述衰老相關基因的表達（圖5）。

3討論

除了作為信號分子介導植物對各種外界刺激的響應之外，ROS還在植物的正常生長發(fā)育與分化以及細胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）等方面具有重要作用（Mittleretal.，2011;Perez&Brown.，2014;Wangetal.，2020）。O2-和H2O2是植物體內(nèi)主要的活性氧自由基，作為強氧化劑攻擊細胞膜中的不飽和脂肪酸或生物大分子物質導致其透性增加，而MDA是細胞膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其積累會對細胞造成一定的傷害，其含量的變化是細胞質膜損傷程度的重要標志之一，同時也是衡量植物器官衰老時或在逆境條件下細胞膜結構完整性的較好指標（Slamaetal.，2015;夏冬冬等，2018）。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著葉片衰老進程的進行，野生型和轉基因擬南芥葉片MDA含量呈增加的趨勢，表明兩者細胞膜脂過氧化程度逐漸增加，細胞由完整變得破裂，造成細胞衰老和死亡。MDA含量增加可能與活性氧清除系統(tǒng)能力下降有關。在本研究中，盡管SOD酶活性在擬南芥葉片衰老過程中有所提高，但是由于POD酶和CAT酶活性降低，導致了其體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)能力下降，從而引起ROS大量累積，導致MDA含量增加;在擬南芥衰老的各個時期，在轉基因株系葉片中SOD、POD和CAT酶活性均顯著低于野生型，因而導致轉基因株系葉片MDA含量均相應地顯著高于野生型。在植物葉片衰老過程中伴隨著與光合作用光反應有關組分的降解（如葉綠素、類胡蘿卜、葉黃素及Cytf等）（Hikosakaetal.，1996;Murchieetal.，1999），同時也伴隨著與光合作用暗反應有關過程的衰退（如Rubisco活性下降、Rubisco降解及氣孔導度下降等）（Onoetal.，2013;Majeranetal.，2019）以及光合速率的下降。相關研究發(fā)現(xiàn)，衰老引起葉綠體的結構、大小以及類囊體膜的完整性發(fā)生變化（Hashimotoetal.，1989），正是這種變化最終導致葉片衰老過程中PSI和PSⅡ的活性都下降。然而相對而言，PSⅡ對衰老更為敏感（Grover&Mohanty，1993）。PSⅡ的葉綠素熒光動力學參數(shù)可直觀反映植物葉片光合作用過程中光系統(tǒng)對光能的吸收、轉化、耗散及分配等。作為其中一個比較重要的葉綠素熒光參數(shù)，F(xiàn)v/Fm是暗適應下PSⅡ反應中心完全開放時032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739

的最大光化學效率，代表了植物潛在的最大光合能力，正常生理狀態(tài)下其數(shù)值通常介于0.80～0.85之間，并且基本上不受物種的影響。在植物體遭受到光抑制、逆境脅迫或者發(fā)生某些與光合相關的基因突變時，F(xiàn)v/Fm會發(fā)生顯著性變化（肖華貴等，2013）。前人在研究不同種類作物衰老進程時均發(fā)現(xiàn)，盡管作物葉片衰老過程中光合作用能力下降，但是衰老并未引起PSⅡFv/Fm明顯下降（高海濤等，2010;武永勝等，2010）。因此，有學者根據(jù)這一數(shù)據(jù)認為植物葉片衰老過程中PSⅡ活性并未發(fā)生相應變化。本研究結果表明，在衰老的前期和中期，衰老確實未導致擬南芥葉片F(xiàn)v/Fm明顯下降;然而在衰老的末期，衰老導致了擬南芥葉片F(xiàn)v/Fm明顯降低，且轉基因擬南芥下降得更加明顯。PSⅡ激發(fā)壓（1qP）是對PSⅡ的電子接受體QA的氧化還原狀態(tài)的估計值，其反映了PSⅡ的氧化還原狀況以及能量供應和利用之間的平衡，能量平衡是通過光合電子傳遞鏈組分的氧化還原狀態(tài)所介導的（Huneretal.，1998）。前人研究發(fā)現(xiàn)PSⅡ激發(fā)壓（1qP）可能分別介導了自然衰老和缺氮引起的早衰（Tangetal.，2015;Wangetal.，2015）。Misra等（2011）認為PSⅡ激發(fā)壓可以用作監(jiān)測衰老開始的傳感器。Ou等（2003）研究發(fā)現(xiàn)超高產(chǎn)水稻劍葉衰老的過程中有一個明顯的PSⅡ激發(fā)壓上升的階段，顯示光合電子流傳遞受阻。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)在擬南芥葉片衰老過程中有一個明顯的PSⅡ激發(fā)壓上升的階段，且轉基因型比野生型擬南芥上升更加明顯，表明轉基因型比野生型擬南芥電子流受阻程度更嚴重。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在擬南芥葉片衰老過程中，PSⅡ光合電子傳遞量子效率ΦPSⅡ、光化學淬滅系數(shù)qP和光合電子傳遞速率ETR均降低，且轉基因擬南芥下降更加明顯，這一結果表明在生育后期衰老的過程中，轉基因株系較野生型葉片的PSⅡ功能下降更快，并且具有較低的光能利用效率。

本研究通過實時定量RTPCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)RLPK2基因超表達導致葉綠素降解關鍵酶編碼基因ACD1表達量增加，這暗示了超表達RLPK2基因導致轉基因擬南芥葉綠素降解速率加快，光合作用能力下降?，F(xiàn)有研究表明，擬南芥中衰老標志基因ATSAG12編碼半胱氨酸蛋白酶僅在只依賴于葉齡發(fā)育信號而導致的衰老過程中表達，且表達量不受其他脅迫信號的影響（張藝函等，2019）。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在衰老中期才能在野生型和轉基因擬南芥株系中檢測到該基因的表達，且超表達RLPK2基因顯著促進其表達量，揭示RLPK2基因在葉片衰老過程中響應葉齡發(fā)育信號。在葉片衰老過程中，WRKY和NAC等轉錄因子家族成員中大部分成員表達量上調(diào)，參與調(diào)控葉片衰老過程，在葉片衰老過程中具有關鍵作用（Shahetal.，2014）。在本研究中，超表達RLPK2基因顯著促進ATWRKY6和ATNAP表達量的提升，表明RLPK2基因可能通過調(diào)節(jié)這些葉片衰老的關鍵轉錄因子而參與到葉片衰老的調(diào)控。

4結論

大豆RLPK2受體蛋白激酶基因可參與植物葉片衰老調(diào)控過程，其過表達株系可通過調(diào)控衰老進程中抗氧化酶活性的變化，增加過氧化物的積累，導致PSⅡ功能衰退較快，以及調(diào)控衰老相關基因如衰老標志基因ATSAG12、衰老關鍵轉錄因子ATNAP、ATWRKY6和葉綠素降解關鍵酶編碼基因ATACD1的表達，從而促進受體植株的早衰，但其調(diào)控衰老的機制尚有待于進一步研究。

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（責任編輯李莉）

收稿日期：2020-10-11

基金項目：安徽省自然科學基金（1608085MC49）;安徽省高校自然科學基金（KJ2018A0403）;資源植物生物學安徽省重點實驗室項目。

第一作者：張強（1976-），博士，副教授，研究方向為逆境植物生理生態(tài)學，（Email）zhangq@foxmail.com。

通信作者：薛濤，博士，副教授，主要從事生物化學與分子生物學研究，（Email）xuetao_26@163.com。032BA245-D028-4DA2-A536-F4FF14202739