汪緒龍, 姜開元, 劉 洋, 楊文寧, 隋 強(qiáng)

(1.上海工程技術(shù)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,上海 201620; 2.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院,上海 201203; 3.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 102488)

非布司他(Febuxostat,12)為黃嘌呤氧化酶(XOD)的選擇性抑制劑[1-6],臨床用于降低痛風(fēng)患者的血尿酸。與別嘌醇相比,非布司他對(duì)XOD的抑制作用和選擇性更好[1],但仍存在不良反應(yīng)[2]。因此其與靶蛋白在體內(nèi)的相互作用機(jī)制值得深入研究,為后期開發(fā)作用效果更強(qiáng),副作用更小的藥物分子奠定基礎(chǔ)。

Chart 1

近年來,小分子熒光探針在光學(xué)、生物學(xué)、分析領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。在眾多的熒光染料中,硼氟二吡咯化合物(“BODIPY”)因具有熒光量子產(chǎn)率高、高消光系數(shù)、光穩(wěn)定性好、結(jié)構(gòu)易于修飾等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛關(guān)注。例如,熒光試劑BODIPY-FL[7-9]可用于載藥型的熒光探針。5-羥色胺受體“格拉司瓊”與BODIPY-FL通過吲哚基團(tuán)相連后,可轉(zhuǎn)化為一種5-羥色胺探針13,并在細(xì)胞成功顯影[10]。三萜羧酸類化合物與BODIPY-FL通過乙二胺酰胺縮合連接形成探針14;14對(duì)人乳腺腺癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性,但對(duì)其他細(xì)胞系無細(xì)胞毒性[11]。Bruton’s酪氨酸激酶抑制劑(依魯替尼)與BODIPY-FL通過酰胺縮合反應(yīng)轉(zhuǎn)化為依魯替尼熒光探針15,該探針具有較高的選擇性[12]。

在大多數(shù)熒光藥物分子中,熒光染料和藥物分子可通過酰胺鍵和酯鍵兩種方式結(jié)合。非布司他分子結(jié)構(gòu)中噻唑環(huán)上的羧基為與酶結(jié)合的頭部,且與酶結(jié)合最為緊密,不宜與BODIPY-FL結(jié)合。相對(duì)而言,尾部的異丁基與酶結(jié)合較為疏松,可提供疏水環(huán)境[13-14]。非布司他的活性代謝物(中間體10),與非布司他具有相似的活性[15]。因此,設(shè)計(jì)將10與BODIPY-FL以酯鍵結(jié)合得到目標(biāo)化合物(化合物11)。

本文以2-(3-氰基-4-羥基苯基)-4-甲基-1,3-噻唑-5-羧酸乙酯為原料,經(jīng)水解得到中間體10;以二甲基膦乙酸芐酯為原料,經(jīng)Witting反應(yīng)、氫化還原雙鍵、環(huán)合及鈀/碳催化氫化脫芐基等4步反應(yīng),得到中間體BODIPY-FL,最后將BODIPY-FL的羧基和中間體10的羥基酯化縮合得到非布司他熒光分子(Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR, MS(ESI)表征。采用酶促反應(yīng)法測(cè)定了熒光分子對(duì)酶活性的抑制效果[16]。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance NEO 600 MHz型核磁共振儀(TMS 為內(nèi)標(biāo));Alliance 2695/2486/Q-TOF micro型質(zhì)譜儀;TU-1810型紫外-可見分光光度計(jì);Starter 2100型pH計(jì)。

黃嘌呤,阿拉丁試劑(上海)有限公司;黃嘌呤氧化酶,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)化合物3的合成

將二甲基膦乙酸芐酯287.0 g(0.337 mol)溶于500 mL THF中,冰浴降溫至0 ℃,分批加入NaH 4.49 g(0.187 mol),加畢,撤除冰浴,升溫至室溫,攪拌5 min;冷卻至0 ℃,滴加2-吡咯甲醛116.8 g(0.177 mol)的THF(80 mL)溶液,滴畢,撤除冰浴,攪拌下于室溫反應(yīng)90 min。冷卻至0 ℃,加入5%檸檬酸溶液200 mL和水500 mL,用乙酸乙酯(3×400 mL)萃取水層,合并有機(jī)相,依次用水300 mL和鹽水300 mL洗滌,用MgSO4干燥,于37 ℃減壓除去溶劑,粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:石油醚/乙酸乙酯=9/1,V/V)純化得白色固體331.7 g,收率79%, m.p.25～31 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 11.53(s, 1H), 7.52(d,J=15.6 Hz, 1H), 7.40～7.32(m, 5H), 7.04(m, 1H), 6.59(m, 1H), 6.28(d,J=15.6 Hz, 1H), 6.17～6.16(m, 1H), 5.18(s, 2H); MS(ESI)m/z: Calcd for C14H13NO2{[M+Na]+}250.09, found 250.11。

(2)化合物4的合成

將化合物3 10.0 g(0.0440 mol)溶于80 mL 乙酸乙酯中,加入10%Pd/C 0.600 g,常壓氫化反應(yīng)24 h。過濾除去Pd/C,于37 ℃減壓下除去溶劑,粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:石油醚/乙酸乙酯=95/5,V/V)純化得無色油狀物43.80 g,收率38%;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 10.47(s, 1H), 7.37～7.23(m, 5H), 6.52(m, 1H), 5.80(m, 1H), 5.68(m, 1H), 5.03(s, 2H), 2.76(m, 2H), 2.59(m, 2H); MS(ESI)m/z: Calcd for C14H15NO2{[M+Na]+}252.11, found 252.26。

(3)化合物6的合成

將化合物4 3.00 g(0.0131 mol)和3,5-二甲基-1H-吡咯-2-甲醛51.68 g(0.0136 mol)溶于80 mL PhCF3中,冰浴降溫至0 ℃,緩慢滴加POCl34.50 g(0.0293 mol),滴畢,撤除冰浴,升溫至室溫,攪拌3 h;冷卻至0 ℃,緩慢滴加BF3·Et2O 10.9 g(0.0768 mol)和DIEA(N,N-二異丙基乙胺)11.3 g(0.0874 mol),滴畢,撤除冰浴,攪拌下于室溫反應(yīng)12 h。冷卻至0 ℃,加入飽和NaHCO3溶液30 mL,用乙酸乙酯(2×100 mL)萃取水層,用鹽水100 mL 洗滌,用Na2SO4干燥,于37 ℃減壓除去溶劑,粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:石油醚/乙酸乙酯=19/1,V/V)純化得紅色固體62.20 g,收率44%, m.p.115～120 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.63(s, 1H), 7.34～7.25(m, 5H), 7.03(d,J=6.0 Hz, 1H), 6.32(d,J=6.0 Hz, 1H), 6.26(s, 1H), 5.08(s, 2H), 3.10(t,J=11.4 Hz, 2H), 2.76(dd,J=12.6 Hz, 10.8 Hz, 2H), 2.43(s, 3H), 2.21(s, 3H); MS(ESI)m/z: Calcd for C21H21BF2N2O2{[M+Na]+}405.17, found 404.98。

(4)化合物7的合成

將化合物61.67 g(4.37 mmol)溶于100 mL MeOH中,加入10%Pd/C 0.200 g常壓氫化反應(yīng)3 h。過濾除去Pd/C,于35 ℃減壓下除去溶劑,粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:三氯甲烷/甲醇=19/1,V/V)純化得黑亮紅色固體BODIPY-FL(7)0.800 g,收率63%, m.p.110～113 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 12.29(s, 1H), 7.71(s, 1H), 7.10(d,J=4.2 Hz, 1H), 6.36(d,J=4.2 Hz, 1H), 6.31(s, 1H), 3.08(t,J=7.8 Hz, 2H), 2.65(t,J=7.8 Hz, 2H), 2.48(s, 3H), 2.27(s, 3H); MS(ESI)m/z: Calcd for C14H15BF2N2O2{[M+Na]+}315.12, found 315.14。

(5)化合物10的合成

將2-(3-氰基-4-羥基苯基)-4-甲基-1,3-噻唑-5-羧酸乙酯161.00 g(3.46 mmol)溶于20 mL無水乙醇中,加入1 mol/L NaOH 10.4 mL(10.4 mmol)于60 ℃反應(yīng)2 h。停止加熱,降至室溫,加入水20 mL,用1mol/L HCl調(diào)pH為3.5左右,用乙酸乙酯(3×40 mL)萃取水層,合并有機(jī)相,用Na2SO4干燥,于37 ℃減壓除去溶劑,得淡黃色固體100.800 g,收率88%, m.p.230～234 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.17(d,J=2.4 Hz, 1H), 8.08(dd,J=2.4 Hz, 3.6 Hz, 1H), 7.13(d,J=8.8 Hz, 1H), 2.64(s, 3H); MS(ESI)m/z: Calcd for C12H8N2O3S{[M+H]+}261.03, found 260.99。

(6)化合物11的合成

將BODIPY-FL(7)0.100 g(0.340 mmol)溶于5 mL超干的二氯甲烷中,氮?dú)獗Ｗo(hù),冰浴降溫至0 ℃,緩慢滴加草酰氯80.214 g(1.69 mmol),滴加1滴DMF,加畢,撤除冰浴,升溫至室溫,攪拌30 min,于32 ℃減壓除去溶劑,得到中間體9。將中間體9溶于20 mL超干二氯甲烷中,冰浴降溫至0 ℃,滴加化合物10 88.0 mg(0.340 mmol)的DMF(2 mL)和DIEA 0.194 g(1.50 mmol)溶液,滴畢,撤除冰浴,攪拌下于室溫反應(yīng)2 h。冷卻至0 ℃,緩慢滴加7%HCl 20 mL,用二氯甲烷(2×40 mL)萃取水層,合并有機(jī)相,用Na2SO4干燥,于34 ℃減壓除去溶劑,粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:二氯甲烷/甲醇=40/1,V/V)純化得橙色固體1130.0 mg,收率16%, m.p.161～166 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.33(d,J=1.8 Hz, 1H), 8.19(m, 1H), 7.44(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.13(s, 1H), 6.90(d,J=3.6 Hz, 1H), 6.38(d,J=4.2 Hz, 1H), 6.15(s, 1H), 3.46(t,J=7.2 Hz, 2H), 3.19(t,J=7.8 Hz, 2H), 2.82(s, 3H), 2.60(s, 3H), 2.28(s, 3H); MS(ESI)m/z: Calcd for C26H21BF2N4O4S{[M+Na]+}557.13, found 557.22。

1.3 體外活性測(cè)試

(1)實(shí)驗(yàn)步驟

取200 μL黃嘌呤氧化酶(50 nM,PBS稀釋)加入2 mL EP管中,分別加入200 μL系列不用濃度非布司他熒光探針,室溫預(yù)溫孵5 min后加入600 μL 底物黃嘌呤(62.5 μmol,PBS稀釋)啟動(dòng)反應(yīng),反應(yīng)5 min,于298 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ),一式兩份,反應(yīng)體系中DMSO含量低于0.1%。以只有底物黃嘌呤的緩沖液作為空白組,記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并計(jì)算抑制率。

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用Graphpad Prism 8.3.0軟件對(duì)抑制劑濃度和相應(yīng)的抑制率進(jìn)行擬合,應(yīng)用四參數(shù)Logistic模型,求解得到非布司他熒光探針的IC50為8.3 nM。

抑制劑濃度/nmol

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

化合物3發(fā)生氫化反應(yīng)時(shí),有雙鍵和芐基兩個(gè)反應(yīng)位點(diǎn),為了避免芐基脫除,合成化合物4時(shí)在反應(yīng)體系中加入微量的Ph2S(二苯硫醚)使Pd/C毒化,但是,存在副產(chǎn)物和反應(yīng)不完全,導(dǎo)致收率低。為了解決這一問題,篩選不同反應(yīng)條件,如氫化溶劑、反應(yīng)壓力和反應(yīng)體系有無Ph2S,研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)選用乙酸乙酯為反應(yīng)溶劑、常壓和反應(yīng)體系無Ph2S時(shí),收率有所提高。設(shè)計(jì)采用氯化亞砜來制備中間體9,但實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)減壓濃縮不易除去多余的氯化亞砜且容易使中間體9降解,因此,改用低沸點(diǎn)的草酰氯來制備中間體9,避免產(chǎn)物的降解,成功得到的目標(biāo)化合物(化合物11)。相對(duì)于其他通過酰胺縮合或者通過其他基團(tuán)連接得到的熒光分子,本文通過BODIPY-FL與化合物10直接酯化,得到了非布司他熒光藥物分子,盡量減少干擾化合物10的生物活性。

2.2 體外活性

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在該酶促反應(yīng)體系條件下,非布司他的IC50值約為2 nM[17],此次測(cè)得的非布司他熒光藥物分子的IC50值為8.3 nM,說明接入熒光基團(tuán)后其與黃嘌呤氧化酶的親和力略有下降,但依然具有很強(qiáng)的親和力,可以作為探針分子用于后期研究非布司他與XOD在體內(nèi)靶蛋白處的動(dòng)態(tài)結(jié)合與解離過程。

以二甲基膦乙酸芐酯為原料,經(jīng)Witting反應(yīng)、氫化還原雙鍵、環(huán)合及鈀/碳催化氫化脫芐基四步反應(yīng),得到BODIPY-FL熒光染料,進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成了非布司他熒光藥物分子,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。測(cè)定了該熒光藥物分子對(duì)XOD的抑制效果,結(jié)果表明合成的非布司他熒光藥物分子能與XOD緊密結(jié)合,親和力大。這種基于熒光探針構(gòu)建具有診斷和靶向治療作用的藥物分子,可為后期研究非布司他與靶蛋白在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)結(jié)合過程提供參考。