李程，閆柯，霍斌亮，李文翰，趙剛

結(jié)直腸癌是當前癌癥死亡主因之一，目前化療仍是晚期結(jié)直腸癌首要治療手段，但5年生存率僅10%左右[1-2]?？煽康脑u估技術(shù)對改善結(jié)直腸癌患者預后、指導制定治療方案、延長患者生存期具有重要作用。臨床研究證實，基因突變是結(jié)直腸癌發(fā)病的分子生物學重要驅(qū)動機制，且持續(xù)存在的基因突變可驅(qū)動結(jié)直腸癌克隆進化[3]。組織活檢是臨床評估腫瘤組織形態(tài)及細胞克隆進化情況的“金標準”，但其可重復性差，而液體活檢是近年新興癌癥檢查技術(shù)，同時中外學者最新研究表明，腫瘤所釋放的循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)與腫瘤組織內(nèi)DNA呈高度一致性[4-5]?；诖?，現(xiàn)觀察結(jié)直腸癌不同病理特征患者化療前后循環(huán)腫瘤DNA水平變化，并構(gòu)建預后預測的列線圖模型，為臨床完善相關(guān)評估機制提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年4月—2019年9月陜西省人民醫(yī)院腫瘤外科收治的結(jié)直腸癌患者144例作為觀察組，同期結(jié)直腸良性瘤患者72例作為對照Ⅰ組，健康體檢者72例作為對照Ⅱ組。觀察組男83例，女61例，年齡29～73(51.46±9.38)歲；體質(zhì)量指數(shù)18～25(21.16±1.25)kg/m2；飲食習慣：喜肥甘77例，喜清淡36例，均衡31例；吸煙105例，飲酒83例。對照Ⅰ組男40例，女32例，年齡27～75(52.58±9.20)歲；體質(zhì)量指數(shù)18～25(21.21±1.30)kg/m2；飲食習慣：喜肥甘37例，喜清淡19例，均衡16例；吸煙52例，飲酒40例。對照Ⅱ組男41例，女31例，年齡28～73(50.91±8.34)歲；體質(zhì)量指數(shù)18～24(21.08±1.28)kg/m2；飲食習慣：喜肥甘29例，喜清淡22例，均衡21例；吸煙50例，飲酒42例。3組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、飲食習慣、吸煙、飲酒等基礎(chǔ)資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(KY20160325098)，受試者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：觀察組經(jīng)病理檢查確診[6]；TNM分期為Ⅲb～Ⅳ期；卡氏評分(KPS)>70分；首次確診，入組前未經(jīng)相關(guān)治療；均接受化療；預計生存期>3個月；心、肺、肝、腎臟器功能正常。(2)排除標準：存在化療禁忌證者；有惡性腫瘤史；同時性多原發(fā)性腫瘤。

1.3 化療方法 結(jié)直腸癌患者144例均根據(jù)病理特征常規(guī)選擇XELOX方案或FOLFOX4方案化療，3周為1個療程，均進行3個療程，化療后隨訪2年，統(tǒng)計觀察組患者生存情況。

1.4 觀測指標與方法

1.4.1 ctDNA水平檢測：以EDTA抗凝管采集3組人員清晨空腹肘靜脈血4 ml，顛倒混勻，移至離心管，并加等體積磷酸鹽緩沖液，常溫離心，去除上清液，沉淀置于裂解緩沖液內(nèi)，37 ℃水浴1 h；移液管取蛋白酶K 20 μl加入1.5 ml微量離心管內(nèi)[范德(北京)生物科技有限責任公司]，再加溫浴后的標本5 μl，加PBS調(diào)容至220 μl，加緩沖液AL 200 μl，振蕩，孵育10 min(56℃)，加乙醇200 μl，混勻，移液槍(上海恒奇儀器儀表有限公司移液槍)移取混合液至DNeasy Mini spin column，離心，棄上清液，將DNeasy Mini spin column移至2 ml新收集管，加緩沖液AW1，離心1 min(8 000 rpm)，棄采集管，并移至2 ml新收集管，加適量AW2，離心3 min(14 000 rmp)，棄采集管，再次移至新微量離心管(2 ml)，移液槍取緩沖液AE 200 μl加入DNeasy membrane，室溫孵育1 min，離心1 min(8 000 rpm)，洗脫，收集ctDNA。取樣本1 μl于260 nm波長紫外線可見光度計(上海精密科學儀器有限公司UV-5500型)下測吸光度值，參照吸光度標準曲線獲得ctDNA水平。

2 結(jié) 果

2.1 3組ctDNA水平比較 觀察組、對照Ⅰ組、對照Ⅱ組ctDNA水平分別為(142.58±45.59)μg/L、(78.69±24.76)μg/L和(38.65±11.35)μg/L，3組比較觀察組>對照Ⅰ組>對照Ⅱ組，差異均有統(tǒng)計學意義(F/P=229.968/<0.001)。

2.2 觀察組不同病理特征患者化療前/后ctDNA水平比較 不同腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期患者化療前/后ctDNA水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；不同組織學類型患者化療前/后ctDNA水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 觀察組不同病理特征患者化療前/后ctDNA水平比較

2.3 影響結(jié)直腸癌患者預后的單因素分析 隨訪2年，144例患者脫落8例，有效隨訪136例，生存54例，病死82例。結(jié)直腸癌患者預后與性別、體質(zhì)量指數(shù)、飲食習慣、不良生活習慣、化療方案無關(guān)(P>0.05)；結(jié)直腸癌患者年齡≥50歲、腫瘤直徑>5 cm、分化程度低、浸潤深度突破漿膜層、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期T4、化療前/后ctDNA水平≥142.58/86.59 μg/L者生存率低(P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者預后情況比較 [例(%)]

2.4 影響結(jié)直腸癌患者預后的多因素分析 將表2中P<0.05項目作為自變量(年齡<50歲=1，≥50歲=2；腫瘤直徑≤5 cm=1，>5 cm=2；分化程度低=1，中—高分化=2；浸潤深度未突破漿膜層=0，突破漿膜層=1；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：否=0，是=1；T分期T1～T3=1，T4=2)，預后(生存=0，病死=1)作為因變量，納入Cox回歸模型，結(jié)果顯示，分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期、化療后ctDNA水平均是結(jié)直腸癌預后的獨立影響因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響結(jié)直腸癌患者預后的Cox回歸模型分析

2.5 結(jié)直腸癌預后的列線圖模型構(gòu)建 應用Cox回歸模型篩選出的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期、化療后ctDNA水平構(gòu)建結(jié)直腸癌患者預后列線圖預測模型，一致性指數(shù)為0.892。校正曲線分析顯示，預測模型預測病死風險與實際病死風險吻合度較高，見圖1、2。

圖1 結(jié)直腸癌患者預后列線圖預測模型

3 討 論

目前結(jié)直腸癌已成為世界第三大惡性腫瘤[7]。據(jù)統(tǒng)計，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率約占全球24.3%，且其發(fā)病率在大城市以年均4%～5%的速度遞增[8-9]。但結(jié)直腸癌并非絕對絕癥，其中1/3可預防，1/3可達臨床治愈，還有1/3通過有效治療可提升生存質(zhì)量，延長生存期[10]。但如何評估結(jié)直腸癌患者病情轉(zhuǎn)歸，指導完善治療方案是困擾臨床的一大難題。

圖2 結(jié)直腸癌患者預后列線圖預測模型的校正曲線

近年隨分子生物學研究深入，不斷有研究提出基因檢測在腫瘤診斷及病情評估中存在獨特優(yōu)勢[11-12]。循環(huán)游離DNA是無細胞狀態(tài)的一種胞外DNA，除少部分來自正常細胞DNA外，大部分來自腫瘤細胞。ctDNA相對于組織學活檢能從循環(huán)血內(nèi)易分離，具有無創(chuàng)、便捷等優(yōu)勢，且ctDNA來自于各處病灶，能為臨床提供實時、全面的病情評估信息[13]。Benesová等[14]研究指出，轉(zhuǎn)移性大腸癌患者ctDNA普遍陽性，且水平與患者實際臨床狀態(tài)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腫瘤患者ctDNA呈升高趨勢，且惡性患者升高更顯著，與以往研究結(jié)果一致[15-16]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，化療前后ctDNA水平與腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、T分期均有關(guān)系。分析原因可能是：(1)隨腫瘤直徑增大，惡性細胞增殖活躍，同時凋亡細胞增加，而“清道夫”細胞無法及時有效清除急劇增加的惡性細胞及凋亡細胞時，直接造成ctDNA顯著升高[17]；(2)T分期較高及突破漿膜層的患者，可能同時存在多處微小轉(zhuǎn)移灶，而微小轉(zhuǎn)移灶內(nèi)惡性細胞凋亡、裂解也會增加外周血ctDNA水平[18]；(3)多項研究已證實，低分化組織內(nèi)多分布脈管癌栓，而一定程度上脈管癌栓在增加微小轉(zhuǎn)移灶的同時可影響病灶局部血流供給，導致惡性細胞凋亡釋放ctDNA入血[19]。上述研究提示，ctDNA可能與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)，或可為臨床提供預后預測信息。

相關(guān)研究也指出，結(jié)直腸癌患者預后是一個多因素綜合作用的結(jié)果。蔣蘇靜[20]以SEER數(shù)據(jù)庫中698例原發(fā)性十二指腸腺癌患者為研究對象發(fā)現(xiàn)，年齡、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其預后不良的獨立影響因素；韓晶等[21]未發(fā)現(xiàn)年齡與結(jié)直腸癌根治性切除術(shù)預后有關(guān)，組織學類型、TNM分期是此類患者預后的獨立影響因素。本研究對化療結(jié)直腸癌患者研究發(fā)現(xiàn)，不同預后患者間年齡、腫瘤直徑、分化程度等存在差異，但組織學類型與預后無相關(guān)性，與上述研究存在一定異同，此特征可能與樣本量選取、病例個體差異等因素有關(guān)，上述研究均說明單純從病理特征層面可能難以為臨床提供準確的預后預測信息。本研究采用Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、化療后ctDNA水平均是結(jié)直腸癌預后的獨立影響因素，且化療后隨ctDNA水平增加，病死風險隨之增加。進一步構(gòu)建結(jié)直腸癌患者預后的列線圖預測模型發(fā)現(xiàn)，當?shù)头只?、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T4期單獨存在時結(jié)直腸癌患者隨訪期病死風險尚不足10%，而化療后ctDNA水平≥86.59 μg/L單獨存在時隨訪期病死風險接近20%。初看此數(shù)據(jù)與臨床不符，主要是因本研究選取病例為晚期結(jié)直腸癌患者，此階段患者病情特征復雜，往往低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T4期及ctDNA高水平同時存在，臨床在預后評估中應注重ctDNA水平的檢測。結(jié)直腸癌患者預后列線圖預測模型的校正曲線與標準曲線一致性指數(shù)為0.892，客觀說明此列線圖預測模型具有較高實用價值。

綜上，結(jié)直腸癌患者ctDNA水平與病理特征有關(guān)，且采用列線圖模型預測此類患者預后時ctDNA水平優(yōu)勢顯著，或能成為臨床完善結(jié)直腸癌患者預后評估機制的有力補充。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

李程：提出研究思路，設(shè)計研究方案，課題設(shè)計，論文撰寫，論文修改；閆柯：實施研究過程，資料搜集整理；霍斌亮：論文審核；李文翰、趙剛：進行統(tǒng)計學分析，資料搜集整理