高 蕊，張海濤，石俊超，張 競，馬 瑩，徐榮藝，賀文琦，陸慧君*

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院/人獸共患病研究所，吉林 長春 130062；2.吉林省輝南縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,吉林 通化 135100)

骨腫瘤是發(fā)生于骨的一種罕見的異質(zhì)性腫瘤，人發(fā)生的骨腫瘤大多數(shù)為良性，極少數(shù)為惡性。惡性骨腫瘤稱為骨癌，骨癌在所有癌癥中占比不足1%，它可以發(fā)生在身體的任何一塊骨頭，但最常見于骨盆及四肢的長骨[1]。在犬類動物，骨的原發(fā)性腫瘤可能來源于骨組織、軟骨、纖維組織、脂肪組織或血管組織。其中，骨和軟骨來源的腫瘤最為常見。到目前為止，犬的原發(fā)性骨腫瘤在寵物中發(fā)病率最高，而且大多數(shù)是惡性的。犬惡性骨腫瘤包括骨肉瘤、軟骨肉瘤、纖維肉瘤、脂肪肉瘤和血管肉瘤等，在這些惡性腫瘤中，骨肉瘤占85%，軟骨肉瘤約占骨原發(fā)腫瘤的10%，發(fā)病率僅次于骨肉瘤,骨脂肪肉瘤與纖維肉瘤在犬骨腫瘤中不常見[2]。

骨血管肉瘤(bone hemangiosarcoma,BHSA)是發(fā)生于人和動物的一種相對罕見的高侵襲性的原發(fā)性骨腫瘤，病死率高，通常預(yù)后不良，因此快速準(zhǔn)確的診斷結(jié)果對于指導(dǎo)臨床十分關(guān)鍵。而通常在臨床影像學(xué)檢查中，無法區(qū)分BHSA和骨肉瘤(osteosarcoma)，須通過病理組織學(xué)分析及免疫組織化學(xué)鑒別診斷進(jìn)行確診。本研究通過對臨床貴賓犬病例進(jìn)行影像學(xué)檢查、臨床腫瘤病理組織學(xué)特征觀察及免疫組織化學(xué)鑒別診斷，確診為犬骨血管肉瘤。研究結(jié)果為該病的臨床治療方案及預(yù)后評估提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 案例情況4歲齡雄性貴賓犬，已去勢。左側(cè)后肢腫脹，走路跛行，于2020年10月入院就診。

1.2 試驗(yàn)材料及主要設(shè)備見表1。

表1 試驗(yàn)材料及主要設(shè)備

1.3 石蠟切片的制作及觀察取3塊樣本組織置于10%福爾馬林固定液中固定24 h；固定好的組織塊縱切，置于包埋盒中；將組織塊在不同梯度的乙醇溶液中脫水30 min，然后依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液各30 min；再分別放入3個(gè)65℃石蠟溶液中，40 min 后取出，放于包埋機(jī)中進(jìn)行包埋；將石蠟塊切成厚度為3、5 μm的薄片，置于42℃的水浴鍋中，待切片展平后貼于載玻片上，放入烘箱中烤30 min；將3 μm的石蠟切片脫蠟，復(fù)水，蘇木素、伊紅染色后，經(jīng)梯度酒精脫水二甲苯透明后，滴加中性樹膠封片，自然晾干24 h。

1.4 免疫組織化學(xué)染色將5 μm的切片脫蠟水化，自來水漂洗2次，進(jìn)行抗原修復(fù)，在組織區(qū)域加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min，PBS溶液沖洗；加入羊非免血清室溫孵育10 min，PBS溶液沖洗；加一抗孵育(表2)，PBS溶液沖洗3次；加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠抗體，室溫孵育10 min，PBS溶液沖洗3次，加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，室溫孵育10 min，PBS溶液沖洗3次，DAB顯色，待有陽性信號出現(xiàn)，入水終止顯色。入蘇木素復(fù)染，脫水，封片。

表2 一抗使用條件

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)檢查結(jié)果膝關(guān)節(jié)間隙不對稱， 側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨質(zhì)破壞呈蟲蝕樣改變，內(nèi)側(cè)骨皮質(zhì)消失，骨膜新骨形成，遠(yuǎn)端骨皮質(zhì)不連續(xù)(圖1)。

A.骨盆腹脊位，膝關(guān)節(jié)間隙不對稱；B.腿部側(cè)位，側(cè)股骨遠(yuǎn)端，骨質(zhì)破壞呈蟲蝕樣改變，內(nèi)側(cè)骨皮質(zhì)消失，骨膜新骨形成，遠(yuǎn)端骨皮質(zhì)不連續(xù)； C.骨盆側(cè)位

2.2 大體病變檢查結(jié)果送檢組織塊為左側(cè)后肢采樣骨組織和骨髓，共3塊，肉眼觀察組織塊顏色呈暗紅色，無包膜包被，直徑均小于2 cm，切面呈暗紅色，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)(圖2)，其大小分別為2.0 cm×1.0 cm×1.0 cm，1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm和0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。

A.送檢組織表面呈暗紅色，無包膜包被，直徑均小于2 cm；B.切面呈暗紅色，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)

2.3 病理組織學(xué)檢查結(jié)果送檢組織塊具有相似的病理組織學(xué)變化。低倍鏡下，大部分正常骨組織結(jié)構(gòu)已經(jīng)消失(圖3A)，剩下一些殘存的骨小梁及軟骨組織(圖3B)，骨髓腔及周圍骨組織被大量雜亂生長的腫瘤細(xì)胞所代替，并侵犯臨近軟組織(圖3C)。同時(shí)，腫物區(qū)域及周圍伴有大面積出血(圖3D)。高倍鏡下，腫瘤細(xì)胞或致密排列或形成管腔結(jié)構(gòu)，管腔內(nèi)部充滿紅細(xì)胞(圖3E)。腫瘤細(xì)胞主要呈梭狀或不規(guī)則狀，細(xì)胞邊界不清晰，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性染色，并可見明顯的核仁(圖3F)，偶有雙核及多核細(xì)胞出現(xiàn)(圖3G，箭頭所指)，有絲分裂較為常見(圖3H，箭頭所指)。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞質(zhì)Factor Ⅷ、CD31均呈強(qiáng)陽性染色，說明該腫瘤為血管內(nèi)皮細(xì)胞來源(圖4)。

A.正常骨組織結(jié)構(gòu)消失； B.殘存的骨小梁及軟骨組織；C.骨髓腔內(nèi)外組織被大量雜亂生長的腫瘤細(xì)胞所代替，且臨近軟組織也被腫瘤細(xì)胞侵犯； D.大面積出血區(qū)域；E.腫瘤細(xì)胞或致密排列或形成管腔結(jié)構(gòu)，管腔內(nèi)部充滿紅細(xì)胞；F.腫瘤細(xì)胞形態(tài)各異，大小不一，主要呈梭狀或不規(guī)則狀，并可見明顯的核仁；G.雙核及多核細(xì)胞出現(xiàn)；H.偶見有絲分裂

2.4 綜合診斷臨床影像學(xué)檢查顯示左后肢膝關(guān)節(jié)間隙不對稱，未見明顯軟組織腫大；側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨質(zhì)破壞呈蟲蝕樣改變，內(nèi)側(cè)骨皮質(zhì)消失，骨膜新骨形成，遠(yuǎn)端骨皮質(zhì)不連續(xù);病理組織學(xué)檢查顯示浸潤的腫瘤細(xì)胞中有多個(gè)大小不一的血管間隙，故初步診斷為血管肉瘤；進(jìn)一步利用血管內(nèi)皮標(biāo)記物Factor Ⅷ和CD31進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，顯示兩種染色腫瘤細(xì)胞均呈陽性。因此，該病例經(jīng)臨床檢查、病理組織學(xué)觀察以及免疫組織化學(xué)染色，確診為骨血管肉瘤。

A.Factor Ⅷ呈胞漿染色；B.CD31為血管內(nèi)皮染色

3 討論

血管肉瘤是起源于血管內(nèi)皮細(xì)胞的惡性間充質(zhì)腫瘤，在犬發(fā)病率最高，患病率在0.30%～1.98%之間。血管肉瘤可在任何組織中出現(xiàn)，幾乎影響所有犬種，在大中型犬中最為常見，德國牧羊犬、金毛獵犬、拉布拉多獵犬和雪納瑞犬等多發(fā)[3]。在骨組織中，血管肉瘤最常發(fā)生的部位是脛骨近端或遠(yuǎn)端、橈骨、股骨和肱骨。BHSA患犬年齡范圍較廣，平均年齡為6歲，且雄性犬易發(fā)病[4]。該腫瘤具有侵襲性，可引起疼痛、跛行、軟組織腫脹和骨破壞等臨床癥狀，極易出現(xiàn)病理性骨折[2]。

在本病例研究中，1例4歲齡雄性貴賓犬，消瘦、左后肢關(guān)節(jié)部腫脹、跛行，通過影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)患犬的左后肢膝關(guān)節(jié)間隙不對稱，側(cè)股骨遠(yuǎn)端骨質(zhì)破壞呈蟲蝕樣改變，內(nèi)側(cè)骨皮質(zhì)消失，骨膜新骨形成，遠(yuǎn)端骨皮質(zhì)不連續(xù)，這是導(dǎo)致犬后肢腫脹和跛行的原因。根據(jù)臨床檢查結(jié)果，臨床醫(yī)生懷疑該犬患有骨癌，進(jìn)而對患部骨組織及骨髓取樣進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。肉眼觀察送檢組織塊表面及切面呈暗紅色，提示有出血，該病變與鏡下觀察到的大面積出血相吻合。通過病理組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)患犬正常骨組織結(jié)構(gòu)被破壞，骨髓腔內(nèi)及骨組織中有大量異常增殖的腫瘤細(xì)胞浸潤生長。腫瘤細(xì)胞形態(tài)各異，大小不一，呈梭形或多邊形，腫瘤細(xì)胞排列呈兩種形式：部分呈致密、實(shí)性排列；部分呈管腔狀排列，且管腔內(nèi)有紅細(xì)胞存在。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞有絲分裂較常見。根據(jù)這些特征，判斷該腫瘤細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞來源，通過HE 染色結(jié)果初步診斷為骨血管肉瘤。

腫瘤鑒別診斷常用的方法是免疫組織化學(xué)染色?？乖诮M織切片中被特異性抗體識別，通過抗原抗體結(jié)合及顯色反應(yīng)，顯示細(xì)胞或組織中的化學(xué)成分，然后利用顯微鏡進(jìn)行觀察?，F(xiàn)常用CD31和Factor Ⅷ作為HSA的特異性標(biāo)記物。CD31又稱血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1，是一種跨膜糖蛋白[5]。CD31分子通常表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及部分淋巴細(xì)胞亞群表面。在內(nèi)皮細(xì)胞連接處表達(dá)量最高[6]。在免疫組化中，CD31可用于證明內(nèi)皮細(xì)胞組織的存在，用于評估腫瘤血管生成，證明血管瘤和血管肉瘤。具有較強(qiáng)的特異性和靈敏性。Factor Ⅷ相關(guān)抗原亦可作為血管肉瘤的特異性標(biāo)記物，其存在于內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞中，F(xiàn)actor Ⅷ相關(guān)抗原(vWF)是血管肉瘤和淋巴管肉瘤中內(nèi)皮細(xì)胞分化的一個(gè)非常特殊的標(biāo)記，但是在惡性程度極高的血管肉瘤中敏感性低[1,7]。因此，為進(jìn)一步確診，聯(lián)合使用血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD31及Factor Ⅷ對該腫瘤進(jìn)行組織化學(xué)染色，兩者均呈陽性表達(dá)，表明腫物為血管內(nèi)皮來源。最終，該病例經(jīng)臨床檢查、病理組織學(xué)分析以及免疫組織化學(xué)綜合診斷，確診為BHSA。目前，國內(nèi)尚未見有犬BHSA病例報(bào)道，本研究首次報(bào)道了貴賓犬患骨血管肉瘤的病例，為動物臨床腫瘤性疾病的診斷提供參考資料。

JEONGHYEON等[4]在2020年報(bào)道了1例患有原發(fā)性BHSA的4歲齡哈士奇犬，病理組織學(xué)觀察看到腫瘤細(xì)胞幾乎完全浸潤于遠(yuǎn)端指骨，輕度浸潤于中端趾骨，并侵犯鄰近軟組織。增生的腫瘤細(xì)胞呈梭形，且有明顯的出血，血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD31呈彌漫性強(qiáng)陽性，F(xiàn)actor Ⅷ出現(xiàn)散在染色，此報(bào)道與本病例中所觀察到的病理組織學(xué)有相似特征。然而，由于缺乏對該貴賓犬肝、脾、肺或心臟等器官的相關(guān)臨床信息，所以無法確定該貴賓犬所患的BHSA是否為原發(fā)性。通常，BHSA在出現(xiàn)臨床癥狀前可破壞大面積的骨組織[3]，這時(shí)大多數(shù)腫瘤已經(jīng)通過血液轉(zhuǎn)移到其他部位，肺臟是最常見轉(zhuǎn)移部位，但本病例術(shù)后并未對肺臟，血液進(jìn)行進(jìn)一步的檢查，因此，也無法確定腫瘤是否轉(zhuǎn)移。

目前，手術(shù)仍是治療犬BHSA的主要方式，截肢術(shù)已經(jīng)在許多BHSA病例中使用，但是對提高存活時(shí)間效果有限，極少的患犬在術(shù)后可存活6～8個(gè)月；由于手術(shù)的局限性，化療已經(jīng)發(fā)展為治療BHSA的重要輔助手段，常用的藥物包括長春新堿、環(huán)磷酰胺等[4]。除化療外，術(shù)后支持性藥物有頭孢菌素類抗生素、曲馬多、西咪替丁、阿霉素等[1,3,7-8]。目前關(guān)于BHSA也有一些新的治療方法，如吸入化療、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑與化療聯(lián)合使用等。

在人類醫(yī)學(xué)方面，BHSA占原發(fā)性骨腫瘤的0.23%、占惡性骨腫瘤的0.43%，男性較多見，50%的病例發(fā)生在頭頸部的皮膚和軟組織處，其次為骨盆、四肢長管狀骨[9-10]。人BHSA常表現(xiàn)為運(yùn)動障礙，局部出現(xiàn)疼痛與腫脹[11-13]。病理組織學(xué)特征為分化良好的腫瘤細(xì)胞可形成血管結(jié)構(gòu)，分化較差的腫瘤細(xì)胞常伴有明顯的出血和壞死[14-15]。這與犬BHSA有相似的臨床癥狀及病理組織學(xué)變化。由于犬惡性腫瘤與人的大多數(shù)惡性腫瘤(如非霍奇金淋巴瘤、骨血管肉瘤、黑色素瘤、前列腺癌、頭頸癌、肺癌、乳腺癌等)具有很多相似的特點(diǎn)，包括病理組織形態(tài)、腫瘤遺傳學(xué)、腫瘤的生物學(xué)行為以及對治療的反應(yīng)等。因此，本研究結(jié)果也可為人類腫瘤的研究提供一定的參考價(jià)值。

(感謝臺灣大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院劉振軒教授協(xié)助診斷及對文稿的指導(dǎo)意見)