侯銘源，梁艷艷，李 可，李亞寧，賈 麗，馬玉忠

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001)

子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后普遍發(fā)生的一種疾病，不僅影響著奶牛的繁殖效益和產(chǎn)奶量，甚至還會(huì)威脅奶牛的生命，對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。細(xì)菌感染是造成奶牛子宮內(nèi)膜炎的重要因素，大腸桿菌是引發(fā)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌之一[1]。由于抗生素具有價(jià)格低、療效好、見(jiàn)效快等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療當(dāng)中，這也導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，給臨床治療帶來(lái)了巨大困難[2]。細(xì)菌耐藥性迅速上升的主要原因是其可以通過(guò)可移動(dòng)遺傳元件(mobile genetic elements,MGEs)水平轉(zhuǎn)移外源性耐藥基因，并整合到自身基因組之中，使耐藥基因在細(xì)菌之間廣泛傳播造成的[3]。目前國(guó)內(nèi)已有學(xué)者對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其耐藥性較為嚴(yán)重，但對(duì)可移動(dòng)遺傳元件的研究較少[4]。

本試驗(yàn)擬通過(guò)采集子宮內(nèi)膜炎病牛的子宮黏液，分離大腸桿菌，對(duì)其進(jìn)行致病性、血清型分析及耐藥性與可移動(dòng)遺傳元件的檢測(cè)，探究河北省奶牛子宮內(nèi)膜炎致病大腸桿菌的流行情況及其耐藥性與耐藥基因的轉(zhuǎn)移規(guī)律，為該病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥敏片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑公司；伊紅美藍(lán)和LB肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)公司；大腸桿菌O抗原單因子血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司。SPF級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 樣品采集無(wú)菌條件下，采集河北省11地、市有代表性的大型奶牛場(chǎng)40頭經(jīng)診斷患有子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮黏液。

1.3 細(xì)菌的分離純化及形態(tài)鑒定將采集的樣品接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床200 r/min培養(yǎng)12 h，使用三線法將培養(yǎng)物劃線接種到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取有綠色金屬光澤的單一菌落純化培養(yǎng)，將純化后的菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡檢。

1.4 大腸桿菌基因組DNA提取及鑒定按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取大腸桿菌的全基因組DNA，設(shè)計(jì)并合成大腸桿菌16S rDNA引物(16S-F:5′-GCGGACGGGTGAGTAATGT-3′，16S-R:F5′-TCATCCTCTCAGACCAGCTA-3′)，對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為20 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，超純水6 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank上的大腸桿菌16S rDNA 序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.5 致病性試驗(yàn)將小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只，雌雄各半。將每株處于對(duì)數(shù)期的菌液稀釋至1.0×109CFU/mL，試驗(yàn)組小鼠每只腹腔注射0.2 mL，對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水。每隔4 h觀察小鼠的情況并記錄。剖檢死亡的小鼠，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.6 血清型鑒定按照大腸桿菌O抗原診斷血清試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)大腸桿菌分離株進(jìn)行血清型鑒定。大腸桿菌分離株于LB培養(yǎng)液中37℃振蕩培養(yǎng)12 h后用玻板凝集試驗(yàn)鑒定其O血清型，使用0.5%石碳酸生理鹽水作為陰性對(duì)照，觀察有無(wú)自凝現(xiàn)象。

1.7 藥敏試驗(yàn)采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)推薦的K-B法進(jìn)行14種常用抗生素的敏感性檢測(cè)，將對(duì)2類以上抗生素耐藥的細(xì)菌判定為多重耐藥菌株。

1.8 耐藥基因檢測(cè)根據(jù)GenBank上引物序列設(shè)計(jì)12種耐藥基因引物，引物序列和退火溫度如表1所示，由生工生物工程(上海)有限公司合成。以待檢測(cè)基因作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。

表1 大腸桿菌耐藥基因引物序列

1.9 可移動(dòng)遺傳元件檢測(cè)設(shè)計(jì)I類整合子、轉(zhuǎn)座子、接合性質(zhì)粒及插入序列標(biāo)記基因引物，引物序列和退火溫度如表2所示，具體操作參考1.8。

表2 可移動(dòng)遺傳元件引物序列

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及鑒定將采集到的40個(gè)子宮黏液樣品接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，共分離出疑似大腸桿菌29株(圖1)，鏡檢發(fā)現(xiàn)為粉紅色短小桿菌(圖2)。經(jīng)16S rDNA PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)，同源性為99.00%，確定均為大腸桿菌，分離率為72.50%(29/40)。

圖1 伊紅美藍(lán)瓊脂平板上菌落形態(tài)

圖2 分離菌的形態(tài)(1 000×)

2.2 致病性試驗(yàn)攻毒4 h后，小鼠頭頸部被毛逆亂、精神萎靡、呼吸急促、食欲下降、眼角分泌物增多。攻毒12 h后試驗(yàn)組小鼠開(kāi)始死亡，病死率達(dá)到60.00%～100.00%。剖檢發(fā)現(xiàn)，死亡小鼠腸道充氣腫脹，腸壁變薄，部分小鼠還有腹腔出血的現(xiàn)象。將其臟器觸片染色，油鏡觀察，發(fā)現(xiàn)均有粉紅色短小桿菌，與注射菌液形態(tài)一致，確定為該菌導(dǎo)致的小鼠死亡，表明29株分離菌均對(duì)小鼠有致病力。攻毒24 h后小鼠停止死亡。

2.3 血清型鑒定O抗原血清型鑒定情況見(jiàn)表3，其中O89和O128為優(yōu)勢(shì)血清型，分別為8株27.59%(8/29)和7株24.14%(7/29)。O157、O39型的菌株各1株，其他血清型10株。

表3 29株大腸桿菌血清型的檢測(cè)

2.4 藥敏試驗(yàn)?zāi)退幥闆r見(jiàn)表4，29株大腸桿菌對(duì)新霉素的耐藥率最高，為68.97%(20/29)；對(duì)紅霉素、四環(huán)素、頭孢噻肟及強(qiáng)力霉素的耐藥率分別為51.72%(15/29),44.83%(13/29),41.38%(12/29)和41.38%(12/29)；對(duì)阿米卡星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星及多黏菌素B的耐藥率較低。本試驗(yàn)中大腸桿菌的平均耐藥率為35.63%。

表4 29株大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)

所分離的29株大腸桿菌中有2株對(duì)所有抗生素都沒(méi)有耐藥性，17株大腸桿菌表現(xiàn)出了多重耐藥性，其中多重耐藥的菌株對(duì)四環(huán)素類的強(qiáng)力霉素和四環(huán)素，氨基糖苷類的新霉素，β-內(nèi)酰胺類的頭孢噻肟、氨芐西林、阿莫西林和頭孢拉定耐藥最為普遍，均高于58.82%(10/17)。

2.5 耐藥基因檢測(cè)耐藥基因攜帶情況見(jiàn)表5，29株大腸桿菌中qnrB、tetB、sul2及ErmB基因的檢出率較高，分別為86.21%(25/29)，65.52%(19/29)，62.07%(18/29)和51.72%(15/29)；aaC4、tetA、BlaOXA及cmlA基因的檢出率較低。部分PCR產(chǎn)物結(jié)果見(jiàn)圖3～6。

表5 29株大腸桿菌耐藥基因的檢測(cè)

2.6 可移動(dòng)遺傳元件檢測(cè)可移動(dòng)遺傳元件檢測(cè)攜帶情況見(jiàn)表6，29株大腸桿菌中，tnp513和trbC可移動(dòng)遺傳元件的檢出率分別為89.66%(26/29)，58.62%(17/29)，未檢測(cè)出tnpU基因。部分PCR產(chǎn)物結(jié)果見(jiàn)圖7，8。

M.DL2000 DNA Marker;1～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker;1～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker;1～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker;1～5.被檢菌株

表6 29株大腸桿菌MGEs的檢測(cè)

M.DL2000 DNA Marker;1～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker;1～5.被檢菌株

3 討論

牛子宮內(nèi)膜炎的病原菌大腸桿菌耐藥性的上升不僅會(huì)使治療時(shí)間和成本增加，影響奶牛的生命健康，還有可能通過(guò)人與動(dòng)物直接或間接的接觸將耐藥性傳播給人類，給人類健康帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。細(xì)菌自身突變獲得耐藥性是一個(gè)漫長(zhǎng)且不可傳播的過(guò)程，通過(guò)MGEs在細(xì)菌之間水平傳播是耐藥基因擴(kuò)散的主要途徑[7]。探究奶牛子宮內(nèi)致病性大腸桿菌的耐藥性及其傳播規(guī)律對(duì)抑制耐藥菌的傳播具有重大意義。

本試驗(yàn)選取40頭子宮內(nèi)膜炎病牛的子宮黏液樣本，分離出了29株大腸桿菌，進(jìn)而用其進(jìn)行小鼠的攻毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組小鼠均有死亡，表明分離到的菌株均有致病性。通過(guò)血清型鑒定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)血清為O89和O128。李巧玲等[8]在流產(chǎn)的藍(lán)狐陰道內(nèi)分離的大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清為O89，與本試驗(yàn)結(jié)果相似，說(shuō)明血清型為O89的大腸桿菌可能是宮內(nèi)重要致病菌。

通過(guò)對(duì)耐藥表型的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)共有17株大腸桿菌表現(xiàn)為多重耐藥，占總體的58.62%(17/29)，新霉素68.97%(20/29)和紅霉素51.72%(15/29)耐藥率最高，β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性普遍較高，分析可能是β-內(nèi)酰胺類抗生素使用過(guò)多造成，同是氨基糖苷類抗生素的新霉素和阿米卡星的耐藥表型具有顯著性差異，孫慧琴等[9]的試驗(yàn)中也出現(xiàn)了相似結(jié)果。

為進(jìn)一步研究為何對(duì)同一類的抗生素的敏感度有巨大差異，本試驗(yàn)從分子水平繼續(xù)研究，對(duì)12種耐藥基因和6種MGEs進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果顯示所有耐藥基因均被檢出，MGEs中除了tnpU基因外均被檢出，這與王衛(wèi)華等[10]的結(jié)果相似。耐藥基因中qnrB的檢出率最高，為86.21%，其次檢出率超過(guò)50%的基因還有tetB、sul2和ErmB，分別對(duì)應(yīng)著喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，這四類抗生素的耐藥率除喹諾酮類以外均高于平均值35.63%，說(shuō)明耐藥基因在一定程度上可以反應(yīng)耐藥表型的敏感度，但不完全一致，這可能與細(xì)菌的多重耐藥機(jī)制相關(guān)，這與劉勃興等[11]的觀點(diǎn)相一致。研究表明，MGEs可能是耐藥大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類等抗生素耐藥的重要原因，這與本試驗(yàn)的結(jié)果相似[12]。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，攜帶可移動(dòng)遺傳原件越多的細(xì)菌，細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥率越高，這與王雪等[13]的研究結(jié)果相類似。但耐藥率較高的細(xì)菌，其可移動(dòng)原件的檢出率不一定高，這有可能是部分未檢測(cè)的可移動(dòng)原件存在于細(xì)菌體內(nèi)，傳播耐藥性。

吳同壘等[14]研究表明，2017-2018年河北秦皇島地區(qū)的牛源大腸桿菌平均耐藥率為29.10%，與本試驗(yàn)結(jié)果相近。苑曉萌等[15]研究表明，山東地區(qū)的牛源大腸桿菌平均耐藥率為16.90%，遠(yuǎn)低于本試驗(yàn)結(jié)果。說(shuō)明不同地區(qū)牛源大腸桿菌的耐藥表型相差較大。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)患有子宮內(nèi)膜炎奶牛進(jìn)行了子宮黏液樣品的大腸桿菌分離鑒定試驗(yàn)，分析了河北地區(qū)牛子宮內(nèi)大腸桿菌的致病性及其耐藥性及耐藥基因水平傳播情況，為臨床防治致病性大腸桿菌所致的奶牛子宮內(nèi)膜炎提供了依據(jù)。