楊秀芳 簡偉華 丁俊彩 陳 康 施尚文

1 中山市人民醫(yī)院新生兒科(中山 528403) 2 中山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心(中山 528403)

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是一種新生兒危重的疾病，是引起新生兒死亡的主要原因之一，部分病例出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，包括腸穿孔、腹膜炎、感染性休克、敗血癥、腸狹窄、腸梗阻、腸瘺、短腸綜合征、多器官功能衰竭，甚至死亡[1-2]。為了有效預(yù)防和及時(shí)阻斷NEC病情的進(jìn)展，研究NEC的發(fā)病機(jī)制迫在眉睫。目前，國內(nèi)外學(xué)者曾提出腸道菌群失衡、炎癥損傷等學(xué)說[3]。由于新生兒胃腸道發(fā)育尚不成熟，分娩方式、喂養(yǎng)方式、抗生素使用等多種因素均可對(duì)新生兒腸道菌群產(chǎn)生影響。早產(chǎn)兒由于剖宮產(chǎn)、人工喂養(yǎng)、圍產(chǎn)期及生后應(yīng)用抗生素等不利因素，腸道菌群定植延遲，更易出現(xiàn)腸道微生態(tài)失調(diào)，導(dǎo)致NEC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。研究發(fā)現(xiàn)[4]，早產(chǎn)、非母乳喂養(yǎng)、炎癥、細(xì)菌移位及腸道缺血-再灌注損傷等多種高危因素引起腸道炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終形成NEC，病理特征為小腸、大腸的片狀缺血壞死，炎癥是其核心發(fā)病機(jī)制。另國內(nèi)外研究結(jié)果顯示，NEC小鼠脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可直接誘導(dǎo)Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)炎癥發(fā)生，導(dǎo)致腸道炎癥損傷[5]。但目前國內(nèi)外對(duì)腸道菌群-LPS-TLR4通路與NEC關(guān)系的臨床研究較少。本研究通過檢測新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎患兒的腸道菌群變化和外周血單核細(xì)胞TLR4及外周血炎癥指標(biāo)的變化，以探討腸道微生態(tài)-LPS-TLR4通路在NEC炎癥損傷中的作用，為將來如何靶向阻斷NEC的炎癥通路，以及應(yīng)用糞便移植重建腸道菌群來治療NEC等進(jìn)一步的研究打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究收集2019年3月1日—2021年1月31日在中山市人民醫(yī)院新生兒監(jiān)護(hù)室確診為NEC新生兒11例為實(shí)驗(yàn)組，NEC的診斷及分期參照改良的Bell分級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。NEC 是新生兒期嚴(yán)重的胃腸道疾病，臨床上主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、腹脹、便血，可出現(xiàn)休克或多器官功能衰竭，腹部X線檢查以腸壁積氣為特征。NEC分期依據(jù)改良的Bell-NEC 分級(jí)法，分為Ⅰ～Ⅲ期(Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb)。隨機(jī)選取30例同期在新生兒科病房住院喂養(yǎng)順利，排除NEC及敗血癥診斷的新生兒為對(duì)照組。經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)研究批準(zhǔn)，并征得患兒家長同意，患兒家屬均簽署知情同意書，自愿加入該臨床研究。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測糞便的腸道菌群 采集2組新生兒的糞便標(biāo)本，進(jìn)行Real-time PCR表達(dá)譜分析，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腸道菌群的差異。檢測方法:①標(biāo)本采集，②提取糞便中的DNA，③鑒定DNA的質(zhì)粒，④分析腸道桿菌的定量。在潔凈的玻片上直接用未稀釋的大便進(jìn)行涂片，大便要求新鮮，涂片均勻后自然干燥，固定后進(jìn)行革蘭染色，用顯微鏡觀察，對(duì)比2組腸道菌群的差異。

1.2.2 檢測外周血炎癥指標(biāo)和外周血單核細(xì)胞的TLR4水平 應(yīng)用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集兩組新生兒外周血1 mL，然后放于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆脵z測。采用美國BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀檢測外周血單核細(xì)胞的TLR4水平，每份血液標(biāo)本有2支試管，其中1支試管加入FITC-CD14單抗和PE-TLR4單抗，另1支試管加入PBS液，充分搖勻，4 ℃靜置30 min，然后加入2 mL紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，輕柔震蕩混勻，避光室溫(20～25 ℃)靜置15～20 min，加入1 mL鞘液，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加入250 mL鞘液上流式細(xì)胞儀，檢測TLR4+和CD14+單核細(xì)胞百分率來表示TLR4水平，全血雙色免疫熒光直接標(biāo)記法，F(xiàn)ITC-CD14單抗和PE-TLR4單抗購自美國Abcam公司。同時(shí)取外周靜脈血2 mL檢測兩組患兒的降鈣素原(procalcitonin,PCT)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、血清淀粉樣蛋白A(serum amploid A,SAA)等炎癥指標(biāo)，對(duì)比2組外周血單核細(xì)胞TLR4和炎癥指標(biāo)水平，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料檢測數(shù)據(jù)正態(tài)性分布及方差齊性，根據(jù)條件選擇t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組基本資料情況

對(duì)比2組新生兒的基本資料，實(shí)驗(yàn)組11例中男孩6例，女孩5例，發(fā)病平均日齡10天，胎齡33周±3天，平均體質(zhì)量(1.8±0.3)kg，其中NEC的Ⅰa期2例，Ⅰb期3例，Ⅱa期3例，Ⅱb期2例，Ⅲa期 1例，其中對(duì)照組30例中男孩16例，女孩14例，胎齡34周±4天，平均體質(zhì)量(2±0.4)kg。

2.2 2組患兒的糞便腸道菌群對(duì)比

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組患兒進(jìn)行糞便腸道菌群檢測，結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)組變形菌門占82%(9/11)，厚壁菌門占9%(1/11)，放線菌門占9%(1/11)，對(duì)照組變形菌門占20%(6/30)，厚壁菌門占73%(22/30)，放線菌門占7%(2/30)，2組患兒的糞便腸道菌群分布有差異(χ2=11.521，P<0.05)，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組糞便菌群的構(gòu)成比 例(%)

2.3 2組患兒外周血單核細(xì)胞的TLR4水平對(duì)比

本研究通過流式細(xì)胞分析儀和全血雙色免疫熒光直接標(biāo)記法，檢測TLR4+和 CD14+單核細(xì)胞百分率來表示TLR4水平，見圖1。結(jié)果顯示：把實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組新生兒外周血單核細(xì)胞的TLR4水平互相比較，其中實(shí)驗(yàn)組新生兒外周血單核細(xì)胞TLR4水平為(50.12±9.89)%，對(duì)照組新生兒外周血單核細(xì)胞TLR4水平為(18.23±5.31)%，實(shí)驗(yàn)組外周血單核細(xì)胞TLR4水平高于對(duì)照組，2組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.332，P<0.001)。

2.4 2組患兒的血清炎癥指標(biāo)對(duì)比

實(shí)驗(yàn)組患兒外周血PCT、CRP、IL-6和SAA等炎癥指標(biāo)高于對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 2組炎癥指標(biāo)差異比較

3 討 論

新生兒NEC是新生兒一種嚴(yán)重的疾病，對(duì)早產(chǎn)兒更是災(zāi)難性疾病，一旦發(fā)生將明顯提高早產(chǎn)兒的死亡率，部分存活下來的患兒出現(xiàn)嚴(yán)重腸道并發(fā)癥和營養(yǎng)不良等不良后果。NEC的病因和發(fā)病機(jī)理還不確切，但是研究普遍認(rèn)為NEC是個(gè)多因素的疾病，其發(fā)生與早產(chǎn)、胎盤早剝出血、缺氧窒息、臍血管置管、低體溫、動(dòng)脈導(dǎo)管開放、配方奶滲透壓過高、奶量增加過快、腸道感染、紅細(xì)胞增多癥、血小板增多、貧血、輸血、青紫型先心病等有關(guān)。NEC的發(fā)病機(jī)制可能與消化道內(nèi)微生物失衡，尤其是細(xì)菌定植失調(diào)有關(guān)。NEC一般在生后第8～10 天后發(fā)生，正是消化道發(fā)生微生物多樣性變化和出現(xiàn)厭氧菌定植之時(shí)。腸道微生態(tài)失調(diào)，益生菌的破壞和潛在致病菌的過度生長是早產(chǎn)兒NEC發(fā)生的重要原因[7]。研究發(fā)現(xiàn)[8]，革蘭陰性桿菌如大腸埃希菌、克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌、艱難梭菌等為NEC患兒糞便培養(yǎng)的主要菌種，而足月順產(chǎn)兒則以乳桿菌和雙歧桿菌為主的消化道微生物種類。體外細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)腸道微生態(tài)-LPS-TLR4通路參與了多種炎癥性腸道疾病、肝臟疾病等[9-11]。TLR4是Toll樣受體的主要類型，是一種天然免疫受體，它是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中脂多糖的受體，一旦暴露，TLR4與LPS結(jié)合可啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起大量炎性介質(zhì)的釋放，從而導(dǎo)致消化道的炎癥損傷。本研究通過觀察NEC患兒的腸道菌群分析及外周血白血胞TLR4，炎癥指標(biāo)的變化，從而了解多種NEC的致病因素導(dǎo)致的腸道菌群失衡、LPS-TLR4通路激活是否在NEC炎癥損傷的機(jī)制中起到重要作用，從而為將來改善NEC的預(yù)后打下理論的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示NEC患兒的腸道菌群以變形菌門為主，與國內(nèi)外的研究報(bào)道相符[12-13]，其中Pammi等學(xué)者的Meta分析結(jié)果顯示，患NEC的早產(chǎn)兒的腸道菌群出現(xiàn)特征性改變，其中變形菌門的相對(duì)豐度增加，而厚壁菌門放射線菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度則減少。本研究中NEC患者伴外周血單核細(xì)胞TLR4和外周血炎癥指標(biāo)升高，近年來研究報(bào)道[14]發(fā)現(xiàn)TLR4與NEC密切相關(guān)，損傷的主要機(jī)制之一可能是TLR4被LPS激活致炎癥損傷，這與本研究的結(jié)果一致。目前關(guān)于腸道微生態(tài)-LPS-TLR4通路與新生兒NEC癥損傷的研究較少，本研究結(jié)果顯示早產(chǎn)兒患NEC時(shí)主要腸道菌群構(gòu)成發(fā)生改變，以變形桿菌為主，且伴TLR4和外周血炎癥水平升高，可見腸道微生態(tài)-LPS-TLR4通路可能與新生兒NEC炎癥損傷相關(guān)，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。