◎ 王孟華，張國龍，金 鑫，蔡衛(wèi)國，竇 天，申志鵬，郭江紅，文 覓

（宜昌三峽普諾丁生物制藥有限公司，湖北 宜昌 443000）

玉米漿（Corn Steep Liquor，CSL）是玉米通過濕法工藝生產(chǎn)淀粉過程中得到的副產(chǎn)物，其含有大量的營養(yǎng)物質，如葡萄糖、半乳糖、蛋白質、磷和各種氨基酸如谷氨酸、組氨酸、精氨酸等[1-2]。玉米漿主要用作水溶性植物蛋白及水溶性維生素、纖維飼料以及發(fā)酵氮源等[3]。在氨基酸發(fā)酵中，玉米漿成本低廉且可以提供氮源和生長因子，因此常被用作酵母粉、豆粕水解液等氮源的替代物，以達到降低生產(chǎn)成本的目的[4-6]。玉米漿中各類元素的種類及含量對異亮氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要影響，而其中的磷元素能夠控制菌體DNA、RNA和蛋白質的合成，也能夠控制菌體中的糖代謝、細胞的呼吸作用，因此具有較高的研究價值[7-8]。 基于此，本文主要針對玉米漿中磷元素的含量對異亮氨酸發(fā)酵效率的影響展開研究。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）保藏號為M2019695。

培養(yǎng)基組成為口服葡萄糖14.0%、硫酸銨3.5%、玉米漿2.0%（河南鑫洋實業(yè)有限責任公司）、磷酸二氫鉀（0%～0.4%）、硫酸鎂0.05%、碳酸鈣3.5%和菲汀（0%～0.5%），調節(jié)pH值為7.0±0.1。

1.2 實驗方法

1.2.1 測定方法

使用HPLC檢測異亮氨酸發(fā)酵液的含量。對5個批次玉米漿中溶磷和總磷含量的測定均采用釩鉬磷酸比色法[9-10]。

1.2.2 色譜條件

緩沖液：0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉，用磷酸調pH至 2.8；流動相：乙腈和緩沖液（2∶98）；檢測波長： UV 210 nm；色譜柱：C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.5 mL·min-1；進樣體積：20 μL[11]。

1.2.3 樣品處理

按配方將物料裝入三角瓶中，于0.04～0.06 MPa、 110～114 ℃濕熱滅菌10～15 min，稍冷后放入無菌室備用。按無菌操作要求，用接種鏟挑取新鮮斜面上的適量菌種，接入制備好的培養(yǎng)基中，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)，（30±2）℃恒溫條件下培養(yǎng)64～80 h后進行產(chǎn)酸測定[12]。

2 結果與分析

2.1 5個批次玉米漿磷含量及對產(chǎn)酸的影響

對5個批次的玉米漿樣品進行了溶磷（無機磷）以及總磷含量的測定，結果見表1。實驗結果顯示 5個批次的玉米漿樣品中溶磷和總磷的含量均不一致，其中樣本3的總磷和溶磷含量最低，溶磷和有機磷之比也最低，為0.75；樣本1的總磷和溶磷含量最高，溶磷和有機磷之比也最高，為2.77。

表1 不同批次玉米漿溶磷及總磷含量表

采用5個玉米漿樣品進行了搖瓶發(fā)酵實驗，搖瓶編號1～5分別添加不同的玉米漿樣品，每個樣品設置3個重復。發(fā)酵結束后，檢測15個異亮氨酸發(fā)酵的搖瓶清液中異亮氨酸含量，結果見表2。實驗結果顯示樣本3的產(chǎn)酸最高，為2.90 g/100 mL，樣本1的產(chǎn)酸最低，為1.88 g/100 mL。

為了進一步探究玉米漿中磷元素含量對產(chǎn)酸的影響，本研究結合表1和表2實驗結果進行了進一步分析，分析結果顯示，當樣本中的溶磷∶有機磷的值降低時，異亮氨酸的產(chǎn)率隨之升高，說明玉米漿中溶磷∶有機磷與異亮氨酸的產(chǎn)量成負相關。

表2 不同批次的玉米漿發(fā)酵產(chǎn)酸表（單位：g/100 mL）

2.2 不同含量的無機磷對產(chǎn)酸的影響

由于5個不同批次的玉米漿樣本中可能還存在其他影響產(chǎn)酸的因素，因此為了減少影響因素并進一步探究無機磷對異亮氨酸產(chǎn)率的影響，設計了不同濃度無機磷（磷酸二氫鉀）添加實驗。實驗中選取產(chǎn)酸最高的樣本3作為玉米漿來源。實驗結果（表3）顯示：當無機磷添加量為0（無機磷∶玉米漿干基）時，異亮氨酸的產(chǎn)率最高，為3.012 g/100 mL；當無機磷添加量達到0.40%時異亮氨酸的產(chǎn)率最低，為1.872 g/100 mL。 并且隨著無機磷的添加，玉米漿中總磷∶玉米漿干基的比例逐漸上升，異亮氨酸的產(chǎn)率逐漸降低，成負相關。其中，當總無機磷∶總有機磷在77%以下時，異亮氨酸的產(chǎn)率較高。

表3 玉米漿中添加無機磷后的發(fā)酵產(chǎn)酸表

2.3 不同含量的有機磷對產(chǎn)酸的影響

為了進一步探究有機磷的含量對異亮氨酸產(chǎn)率的影響，設計了不同濃度的有機磷（菲?。┨砑訉嶒?。實驗結果（表4）顯示當玉米漿中有機磷的添加量在0%～0.2%（有機磷∶玉米漿干基）時，異亮氨酸的產(chǎn)酸量逐漸上升，且添加量在0.2%時產(chǎn)酸達到峰值， 2.951 g/100 mL；當進一步增大有機磷的添加量，異亮氨酸的產(chǎn)率則逐漸降低。因此在玉米漿中添加少量的無機磷能夠在一定程度上促進異亮氨酸的產(chǎn)酸量，并且添加0.2%的有機磷，即總無機磷∶總有機磷為66.71%時是最佳的有機磷添加量。

表4 玉米漿中添加有機磷的發(fā)酵產(chǎn)酸表

3 討論

磷是微生物生長繁殖和合成代謝產(chǎn)物所必需的成分。賈志偉[7]研究了磷配比對抗生素發(fā)酵的影響，顯示出配比的重要性。劉鵬等[13]在對紅霉素發(fā)酵工藝的研究中發(fā)現(xiàn)磷元素能夠影響菌絲生長，進而影響發(fā)酵效價。通過對不同玉米漿批次自身含有的磷元素的測定（表1），實驗結果顯示不同批次的玉米漿中磷元素的含量也不一致，這可能是受到原料玉米的質量、生長環(huán)境等因素的影響。在不同批次玉米漿對異亮氨酸產(chǎn)酸量的影響實驗中（表2）發(fā)現(xiàn)當玉米漿中的溶磷∶有機磷的值降低時，異亮氨酸的產(chǎn)率隨之升高，說明玉米漿中溶磷∶有機磷與異亮氨酸的產(chǎn)量成負相關。其中樣本3的溶磷∶有機磷最低，其產(chǎn)酸也最高。因此，在玉米漿的采購過程中，可以將磷元素含量作為玉米漿質量的重要考察指標，選擇發(fā)酵用玉米漿中磷含量以2%～3%（干基）較好，其中含有的溶磷∶有機磷的比值較低更適合用于異亮氨酸的發(fā)酵。

無機磷源主要是磷酸鹽的化合物，如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等。因此，研究中以磷酸二氫鉀作為原料進行了玉米漿中無機磷的添加。實驗結果顯示（表3）隨著無機磷的添加，玉米漿中總磷∶干基的比例逐漸上升，異亮氨酸的產(chǎn)率逐漸降低，二者成負相關。其中，當總無機磷∶總有機磷在77%以下時，異亮氨酸的產(chǎn)率較高。因此，在異亮氨酸的發(fā)酵過程中，當玉米漿自身含有的無機磷元素較高時，可以減少甚至不添加無機磷，將總無機磷∶總有機磷的值維持在77%以下時有利于異亮氨酸的發(fā)酵與產(chǎn)率。

玉米漿中的有機磷是以菲?。ㄖ菜徕}鎂或植酸鈣）的形式存在，有的玉米淀粉廠先從玉米漿中提出菲汀后再用菲汀濾液蒸發(fā)濃縮制成玉米漿，實際上是去除了有機磷，不利于發(fā)酵。因此，在發(fā)酵過程中可以適當添加一定的有機磷元素，促進發(fā)酵的產(chǎn)率。有機磷添加實驗結果顯示（表4），在玉米漿中添加少量的無機磷能夠在一定程度上促進異亮氨酸的產(chǎn)率，并且添加0.2%的有機磷，即總無機磷∶總有機磷為66.7%時是最佳的有機磷添加量。因此，在異亮氨酸的發(fā)酵配料過程中，應注意檢測培養(yǎng)基中的無機磷∶有機磷的值，將其維持在66.7%左右，這將在一定程度上促進異亮氨酸的產(chǎn)率。

4 結論

本研究從5個批次的玉米漿出發(fā)，對其本身含有的無機磷和有機磷元素進行了測定，并進行了發(fā)酵實驗驗證其對異亮氨酸產(chǎn)率的影響。在篩選出了一個產(chǎn)酸最高的玉米漿批次后又進行了無機磷與有機磷的添加實驗。實驗結果顯示，當玉米漿中的總無機磷∶總有機磷為60%～70%時最佳，當超出這一范圍時應當在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加無機磷或有機磷元素，從而提高異亮氨酸的產(chǎn)率。這將指導在異亮氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)過程中玉米漿的選擇與采購。

由于玉米漿中所含元素過多，對發(fā)酵的影響因素也不僅僅局限于磷元素的含量，因此未來還可以進一步對玉米漿中各類元素進行研究，以求找到最適用于異亮氨酸發(fā)酵的玉米漿指標。同時，不同的菌種所需要的磷元素的含量也存在一定的差異。本研究只針對特定異亮氨酸生產(chǎn)菌種進行了研究，因此未來還可以針對不同的菌種進行磷元素含量的影響研究。