楊雙昱，何志強(qiáng)，曾 全，肖銀波，王 新，楊 莉

（1.四川省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)研究所，成都 610081；2.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充 637009）

花椒是我國西南地區(qū)最主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，隨著花椒產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，種植面積也隨之加大，然而花椒銹病的發(fā)生愈加嚴(yán)重，造成嚴(yán)重減產(chǎn)[1]。戊唑醇、肟菌酯、吡唑醚菌酯是高效、廣譜、低毒殺菌劑，被廣泛用于農(nóng)作物病害的防治[2-4]。上述幾種農(nóng)藥復(fù)配使用能有效擴(kuò)展殺菌譜和減小抗藥性的產(chǎn)生[5-8]，如楊雙昱等[9]使用戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯復(fù)配防治花椒銹病，其作用效果明顯。目前，國內(nèi)外已有關(guān)于戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯在水稻[10-11]、小麥[12]、玉米[13]、核桃[14]、西瓜[15]、茶葉[16]、番茄[17]、蘋果[18]等的分析方法和殘留行為的報(bào)道，但在青花椒葉片和果實(shí)中的殘留行為和安全性研究尚未見報(bào)道。

本研究利用75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑（WG）和30%唑醚·戊唑醇懸浮劑（SC）的復(fù)配混合方式噴施青花椒葉片和果實(shí)，初步探討了戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯在葉片和果實(shí)中的殘留行為，并通過測(cè)定可食部位中目標(biāo)農(nóng)藥的殘留量評(píng)價(jià)其安全性，旨在為制定青花椒的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

試驗(yàn)地點(diǎn)：四川省資陽市樂至縣孔雀鄉(xiāng)馬鞍山村花椒基地；試驗(yàn)材料：九葉青花椒（樹齡為7年）。

1.2 試劑與儀器

75%肟菌·戊唑醇WG（肟菌酯25%，戊唑醇50%），拜耳作物科學(xué)（中國）有限公司；30%唑醚·戊唑醇SC（吡唑醚菌酯10%，戊唑醇20%），陜西上格之路生物科學(xué)有限公司；戊唑醇、肟菌酯、吡唑醚菌酯的標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈均為色譜純，德國默克公司；甲酸（色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；氯化鈉（分析純），四川西隴化工有限公司；超純水，實(shí)驗(yàn)室自備。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧電離源（ESI），美國沃特世公司；JA3003分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；T18 ULTRA-TURRAX高速勻漿機(jī)，德國IKA公司；Neofuge 18R高速離心機(jī)，香港力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)；Milli-Q超純水儀、0.22 μm有機(jī)系濾膜，美國安捷倫公司。

1.3 田間試驗(yàn)處理

將75%肟菌·戊唑醇WG 3 000倍液和30%唑醚·戊唑醇SC 1 500倍液稀釋混合后，每棵樹每次噴藥750 mL，每次施藥間隔期為7 d，共計(jì)施藥3次，施藥方式為葉面噴霧。對(duì)青花椒園進(jìn)行常規(guī)田間管理，椒園行距和株距為3 m×3 m，每1 100棵/hm2，施藥面積為1 000 m2。在第3次施藥后2 h，1、3、5、7、14、21、30 d采集青花椒的葉片或果實(shí)。

1.4 分析方法

1.4.1 樣品前處理

各稱取5.00 g均質(zhì)青花椒葉片和果實(shí)的樣品分別置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈勻漿2 min，隨后加入3～5 g氯化鈉，于8 000 r/min下離心5 min，吸取1 mL上清液，加入1 mL甲醇-水（50∶50，V/V），過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取一定量標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容于50 mL容量瓶中至刻度，制備成質(zhì)量濃度約為1 000 mg/L母液。分別將青花椒葉片和果實(shí)提取液逐級(jí)稀釋至0.01、0.02、0.10、0.20、0.50 mg/L，制備成系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測(cè)。

1.4.3 儀器條件

色譜條件。液相色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量：1 μl；柱溫：30℃；流速：0.30 mL/min。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件。掃描方式：電噴霧離子源ESI＋；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：30 V；離子源溫度：150℃；脫溶劑溫度：500℃；脫溶劑氣流量：850 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），見表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，按式（1）分析青花椒葉片和果實(shí)中的農(nóng)藥殘留消解情況，采用式（2）計(jì)算所試藥劑的半衰期。

式中：Ct為施藥后第t d的農(nóng)藥殘留量，mg/kg；C0為原始沉積量，mg/kg；k為降解速率常數(shù)；t為施藥后時(shí)間，d。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗(yàn)證

如表3所示，在0.01～0.5 mg/L范圍內(nèi)，3個(gè)目標(biāo)化合物在青花椒葉片或果實(shí)基質(zhì)提取液中的峰面積（y）與其進(jìn)樣質(zhì)量濃度（x）間的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。

表3 目標(biāo)化合物的線性方程和相關(guān)系數(shù)

如表4所示，當(dāng)青花椒葉片中的添加水平為0.02、0.50、1.00 mg/kg時(shí)，平均回收率為90.4%～95.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.6%～5.1%；當(dāng)青花椒果實(shí)中的添加水平為0.02、0.10、0.50 mg/kg時(shí)，平均回收率為89.1%～95.4%，RSD值為1.7%～4.7%。建立的分析方法靈敏度、重復(fù)性等均可以滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求[14]。典型色譜見圖1。

表4 目標(biāo)化合物在不同樣品中的添加回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

圖1 戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯定量離子色譜圖

2.2 戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯在青花椒葉片及果實(shí)中的消解

在第3次施藥后，以不同時(shí)間段青花椒葉片和果實(shí)中戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯的殘留量作消解動(dòng)態(tài)曲線，得出3種有效成分的殘留量隨時(shí)間增加而降低并最終趨于穩(wěn)定。戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯的消解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。其中，戊唑醇的半衰期為3.8～4.4 d；肟菌酯的半衰期為3.4～3.9 d，吡唑醚菌酯的半衰期為4.1～4.4 d（表5）。

表5 戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯在青花椒葉片和果實(shí)中的消解動(dòng)態(tài)

結(jié)合圖2和圖3可知，青花椒葉片和果實(shí)中戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯的殘留量均在施藥21 d后開始趨于穩(wěn)定，3種藥劑在青花椒葉片中的殘留量大于在果實(shí)中。青花椒果實(shí)中戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯的最終殘留量均達(dá)到最低定量限0.02 mg/kg。

圖2 葉片中戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯的消解動(dòng)態(tài)曲線

圖3 果實(shí)中戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯的消解動(dòng)態(tài)曲線

3 結(jié)論

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜殘留分析方法檢測(cè)了青花椒葉片和果實(shí)中戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯的殘留量，該方法的靈敏度和準(zhǔn)確度達(dá)到農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。在本研究施藥劑量下，青花椒果實(shí)中戊唑醇、肟菌酯和吡唑醚菌酯的殘留量均達(dá)到最低定量限0.02 mg/kg。雖然我國GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中目前并沒有明確規(guī)定3種有效成分在花椒葉片和果實(shí)中的最大殘留限量，但參照本次試驗(yàn)結(jié)果，可初步判斷青花椒果實(shí)中的殘留量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求，處于可接受的安全水平。

此外，結(jié)合本團(tuán)隊(duì)先前的藥效試驗(yàn)[9]和本次殘留試驗(yàn)結(jié)果，推薦將75%肟菌·戊唑醇WG（3 000倍液）與30%唑醚·戊唑醇SC（1 500倍液）混合后，采用每棵樹每次用藥量750 mL（樹齡7年），以葉面噴霧方式（施藥隔期7 d）進(jìn)行青花椒銹病的防治。