江曉泉，楊文寧，森慕黎，羅志強(qiáng)，李雪巖，陳洪嬌，劉 偉，祁東盈，汪國鵬，劉 洋

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488；3.中財(cái)瀚熙(北京)生物科技發(fā)展有限公司，北京 101503)

石榴皮為石榴科植物石榴(PunicagranatumL.)的干燥果皮，具有澀腸止瀉、止血、驅(qū)蟲的功效，用于治療久瀉、久痢、便血、脫肛、崩漏、白帶、蟲積腹痛等病癥[1]?，F(xiàn)代研究表明[2]，石榴皮含有鞣質(zhì)類、黃酮類、酚酸類、生物堿類和氨基酸類等化學(xué)成分，具有抑制大腦內(nèi)脂質(zhì)過氧化、減輕氧化應(yīng)激、改善空間記憶、改善阿爾茲海默癥等作用[3-5]。但尚未有研究對其中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行探究。

血腦屏障是限制中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物發(fā)揮藥效的主要因素之一[6]。中藥在中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)方面具有不良反應(yīng)少、作用溫和持久等優(yōu)勢，但由于中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，難以評估血腦屏障通過效應(yīng)?；诖?，本研究以石榴皮為研究對象，擬基于多成分藥物代謝理論[7]，借助UPLC-Q-Exactive MS檢測手段，首先通過腸灌流和封閉腸環(huán)給藥的方法，考察石榴皮的腸吸收及代謝情況，過濾掉一部分未吸收成分，并鑒定出新生成的代謝產(chǎn)物；在腸代謝成分鑒定的基礎(chǔ)上，模擬口服給藥的方式對大鼠進(jìn)行灌胃，解析血中移行成分；最后，分析鑒定灌胃給藥后大鼠腦脊液樣品中石榴皮的成分及其代謝產(chǎn)物。結(jié)合多成分藥物序貫代謝方法，逐步解析石榴皮及其代謝產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)的移行，靶向識別出石榴皮的入腦成分，希望為闡述石榴皮治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

UltiMate 3000-Q-Orbitrap：美國Fisher公司產(chǎn)品，配有UltiMate 3000 超高效液相色譜儀、Q-Exactive 四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、DAD檢測器、Xcalibur質(zhì)譜工作站；BSA2202S電子分析天平：德國Sartorius公司產(chǎn)品；BT-100-1F蠕動(dòng)泵、LSP02-1B注射泵：保定蘭格恒流泵有限公司產(chǎn)品；KQ5200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；HH-2A電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；1-15PK高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司產(chǎn)品；CM-12水浴氮吹儀：北京成萌偉業(yè)科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 藥物與試劑

石榴皮飲片：購于北京同仁堂長陽藥店有限公司新悅都店，由北京中醫(yī)藥大學(xué)王晶娟教授鑒定為石榴科植物石榴PunicagranatumL.的干燥果皮；甲醇、乙腈(色譜純)，乙腈、甲酸(質(zhì)譜純)：美國賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；磷酸(色譜純)：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品；無水乙醇(分析純)：天津大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；氯化鈉注射液：石家莊四藥有限公司產(chǎn)品；醫(yī)用膠：北京康派特醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；水合氯醛(分析純)：福晨天津化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；肝素鈉注射液：上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；屈臣氏飲用水：廣州屈臣氏食品飲料有限公司產(chǎn)品；Oasis HLB C18固相萃取柱：美國Waters公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠(SPF級，體質(zhì)量220～250 g，合格證號SCXK(京)2019-0010)：購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，已通過北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理部的倫理審批(審批號BUCM-4-2019060515-1028)。將大鼠飼養(yǎng)于晝夜節(jié)律光照條件下(溫度25～27 ℃，相對濕度50%～70%)，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)14天，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1石榴皮提取液的制備 稱取179.99 g石榴皮粉末，加入1.8 L 50%乙醇，室溫浸提30 min，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，于50 ℃水浴揮至近180 mL，得到約1 g/mL石榴皮提取液，稀釋1 000倍，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

1.4.2腸代謝成分鑒定 腸壁代謝組(腸灌流)：隨機(jī)選取4只禁食(不禁水)12 h的大鼠，腹腔注射10%水合氯醛，腹主動(dòng)脈采血，并于37 ℃水浴加熱，用于補(bǔ)充手術(shù)過程中損失的血液。另取禁食的大鼠，麻醉，沿腹中線剪開腹腔，選擇十二指腸以下約10 cm的空腸作為供試腸段，先用37 ℃生理鹽水緩慢沖出腸內(nèi)容物至流出液澄清，繼續(xù)充入空氣將生理鹽水排凈。將石榴皮提取液注入腸段，末端開口排出，通過注射泵控制流速0.2 mL/min。用37 ℃生理鹽水潤濕的紗布覆蓋在裸露腸段上，保溫?zé)艏訜?。剖離頸靜脈，插入靜脈留滯針，通過蠕動(dòng)泵連接到盛有供血的離心管中；在腸系膜靜脈插入充滿肝素鈉的靜脈留滯針，結(jié)扎周圍多余血管，另一端通過蠕動(dòng)泵收集血液至干凈離心管，結(jié)扎肝門靜脈。開啟蠕動(dòng)泵，以流速0.3 mL/min進(jìn)行頸靜脈輸血，腸系膜靜脈連續(xù)采血2 h后處死大鼠。對照組注射泵給予生理鹽水，其余操作相同。

腸道菌群代謝組(封閉腸環(huán))：大鼠麻醉后選取盲腸以下約8 cm的結(jié)腸作為供試腸段，將石榴皮提取液注入腸腔，當(dāng)藥液到達(dá)腸段末端，用手術(shù)線結(jié)扎，并結(jié)扎藥液進(jìn)口處。結(jié)扎肝門靜脈，頸靜脈供血，腸系膜靜脈采血，其余操作同“腸壁代謝組”。采血2 h后處死大鼠。對照組注射泵給予生理鹽水，其余操作相同。

1.4.3綜合代謝成分鑒定 選取3只SD雄性大鼠，每天早、晚均灌胃2 mL石榴皮提取液，連續(xù)灌胃3天，第4天上午給藥1 h后，腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉處理，采集腦脊液后，腹主動(dòng)脈采血?？瞻捉M給予生理鹽水。

1.4.4血液樣品處理 將收集的血液樣品于4 ℃以4 000 r/min離心10 min，分離得到血漿后，分別用以下2種方法處理：1) 固相萃取柱法：取1.5 mL血漿樣品，加入等體積的4%磷酸溶液混合，渦旋2 min，靜置5 min后上樣于SPE柱，分別使用5%甲醇和水沖洗SPE柱，乙腈-甲醇溶液(90∶10，V/V)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈桑? mL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜，待液相色譜-質(zhì)譜分析。2) 有機(jī)試劑沉淀法：取1 mL血漿樣品，加入等體積的乙腈混合，渦旋2 min，于4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，吸取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，待液相色譜-質(zhì)譜分析。

1.4.5腦脊液樣品處理 向綜合代謝組的腦脊液樣品中加入等體積的乙腈混合，渦旋2 min，于4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，吸取上清液，待液相色譜-質(zhì)譜分析。

1.4.6色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC BEH Shield RP C18柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL；流動(dòng)相：0.1%甲酸(A)-乙腈(B)；梯度洗脫：0～2 min(95%A)，2～17 min(95%～2%A)，17～20 min(2%A)，20～23 min(2%～95%A)，23～25 min(95%A)；柱溫40 ℃。

1.4.7質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI)，正、負(fù)離子檢測模式；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500；噴霧電壓+3.5 kV(正離子模式)、-3.0 kV(負(fù)離子模式)；鞘氣壓力35 Pa；輔助氣壓力15 Pa；輔助氣溫度300 ℃；離子傳輸管溫度350 ℃；Full MS/dd-MS2掃描模式，F(xiàn)ull MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500；碰撞能量20、40、60 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 石榴皮提取液中化學(xué)成分鑒定

石榴皮提取液的總離子流圖示于圖1。利用Thermo Xcalibur Qual Browser軟件與OTCML、HMDB數(shù)據(jù)庫比對，并結(jié)合參考文獻(xiàn)，共鑒定出38個(gè)化合物，結(jié)果列于表1。

注：a.負(fù)離子模式；b.正離子模式圖1 石榴皮提取液的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of Punica granatum L.extract

2.1.1鞣質(zhì)類化合物鑒定 從石榴皮提取液中共鑒別出六羥基聯(lián)苯二甲?；咸烟擒铡彩褴蘸枉吩茖?shí)精等17個(gè)鞣質(zhì)類化合物。下面以安石榴苷和鞣云實(shí)精為例進(jìn)行質(zhì)譜解析。

化合物M12、M15和M18的準(zhǔn)分子離子分別為m/z1 083.059 8[M-H]-、m/z1 083.058 5[M-H]-、m/z1 083.058 3[M-H]-，Qual Browser軟件給出的精確分子式均為C48H27O30(誤差分別為1.518×10-6、0.281×10-6、0.170×10-6)，二級碎片離子為m/z781[M-H-ellagic acid]-、m/z601[M-H-ellagic acid-162-H2O]-和m/z301[ellagic acid-H]-，表明3個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)中均包含安石榴林和鞣花酸。通過與文獻(xiàn)[8,12-13]比對，推測M12、M15、M18為安石榴苷的3個(gè)同分異構(gòu)體。

化合物M21的準(zhǔn)分子離子為m/z633.073 6[M-H]-，Qual Browser軟件給出的精確分子式為C27H21O18(誤差為2.164×10-6)，二級碎片離子有m/z463[M-H-170]-、m/z301[M-H-170-162]-，分別為失去1分子沒食子酸，1分子沒食子酸和1分子葡萄糖基的碎片離子，此外還產(chǎn)生m/z257、229碎片離子，表明M21中存在六羥基聯(lián)苯二甲酰基基團(tuán)和沒食子酸結(jié)構(gòu)。與文獻(xiàn)[8]對比，推測其為鞣云實(shí)精。

2.1.2黃酮類化合物鑒定 從石榴皮提取液中共鑒定出蘆丁、槲皮素、金絲桃苷等7個(gè)黃酮類化合物。下面以槲皮素為例進(jìn)行質(zhì)譜解析。

化合物M33的準(zhǔn)分子離子為m/z303.050 0[M+H]+，Qual Browser軟件給出的精確分子式為C15H11O17(誤差為0.201×10-6)，二級碎片離子有m/z285[M+H-H2O]+、m/z275[M+H-CO]+、m/z257[M+H-H2O-CO]+、m/z247[M+H-2CO]+、m/z229[M+H-2CO-H2O]+、m/z213[M+H-2CO-O-H2O]+和m/z201[M+H-3CO-H2O]+。經(jīng)與文獻(xiàn)[17]比對，推測該化合物為槲皮素，其裂解途徑示于圖2。

圖2 槲皮素的裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathways of paeoniflorin quercetin

2.1.3酚酸類化合物鑒定 從石榴皮提取液中鑒定出兒茶素、沒食子酸和鞣花酸等9個(gè)酚酸類化合物。下面以沒食子酸、沒食子酸乙酯和鞣花酸及其糖苷為例進(jìn)行質(zhì)譜解析。

化合物M7和M25的準(zhǔn)分子離子分別為m/z169.013 4[M-H]-、m/z197.045 0[M-H]-，Qual Browser軟件給出的精確分子式為C7H5O5和C9H9O5(誤差為1.185×10-6、2.690×10-6)。M7的二級碎片離子有m/z125[M-H-COO]-，為丟失1分子羧基形成的；M25的二級碎片離子m/z169[M-H-C2H4]-為丟失1分子乙基形成的，m/z125[M-H-C2H4-COO]-為丟失1分子乙基、1分子羧基形成的。結(jié)合文獻(xiàn)[9]，推測M7和M25分別為沒食子酸、沒食子酸乙酯，其裂解途徑示于圖3。

圖3 沒食子酸、沒食子酸乙酯的裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathways of gallic acid and ethyl gallate

化合物M23、M27、M29和M31的準(zhǔn)分子離子分別為m/z463.052 2[M-H]-、m/z433.041 5[M-H]-、m/z447.057 3[M-H]-和m/z300.998 7[M-H]-，Qual Browser軟件給出的精確分子式為C20H15O13、C19H13O12、C20H15O12和C14H5O8(誤差為3.311×10-6、3.043×10-6、3.440×10-6和0.806×10-6)。M31的二級碎片離子有m/z300[M-H]-、m/z284[M-H-OH]-、m/z257[M-H-COO]-、m/z229[M-H-COO-CO]-，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，推測化合物M31為鞣花酸，其質(zhì)譜裂解途徑示于圖4?；衔颩23、M27和M29的碎片離子有m/z301、300、257、229等，表明這3個(gè)化合物結(jié)構(gòu)中可能存在鞣花酸，其中m/z301碎片離子分別為[M-H-162]-(M23)，[M-H-132]-(M27)和[M-H-146]-(M29)，結(jié)合文獻(xiàn)[8,13]，推測其分別由M23、M27、M29失去1分子葡萄糖、1分子戊糖、1分子鼠李糖后形成的，即M23、M27、M29分別為鞣花酸葡萄糖苷、鞣花酸戊糖苷和鞣花酸鼠李糖苷。

圖4 鞣花酸的裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathways of ellagic acid

2.1.4異香豆素類化合物鑒別 從石榴皮提取液中鑒定出3個(gè)異香豆素類化合物，以云實(shí)素為例進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

化合物M24的準(zhǔn)分子離子為m/z247.024 8[M-H]-，Qual Browser軟件給出的精確分子式為C12H7O6(誤差為4.435×10-6)，二級碎片離子有m/z219、201、191、173和117，其中m/z219[M-H-CO]-和m/z191[M-H-2CO]-分別為失去1分子羰基和2分子羰基的碎片離子，與文獻(xiàn)[9]比對，推測該化合物為云實(shí)素。

2.1.5其他類別化合物鑒定 從石榴皮提取液中還鑒定出檸檬酸與熊果酸?；衔颩3的準(zhǔn)分子離子為m/z191.018 9[M-H]-，Qual Browser軟件給出的精確分子式為C6H7O7(誤差為1.419×10-6)，二級碎片離子有m/z129、111、87和85。通過與OTCML數(shù)據(jù)庫對比，推測該化合物為檸檬酸。

化合物M38的準(zhǔn)分子離子為m/z455.353 1[M-H]-，Qual Browser軟件給出的精確分子式為C30H47O3(誤差為1.419×10-6)，二級碎片離子有m/z409[M-H-HCOOH]-和m/z407[M-H-CH4O2]-。通過參考文獻(xiàn)[18]，因其同分異構(gòu)體齊墩果酸無m/z409碎片離子，推斷M38可能為熊果酸。

2.2 原型入血成分鑒定

對腸代謝血漿樣品中原型入血成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，從血漿樣品中共檢測到30個(gè)石榴皮原型入血成分，腸壁代謝組和腸道菌群代謝組的血漿樣品中檢測到的原型入血成分無差別，表明它們可通過腸壁吸收；綜合代謝組血漿樣品中共檢測到7個(gè)原型入血成分，且均為腸吸收入血成分，詳細(xì)情況列于表2。

表2 石榴皮原型入血成分Table 2 Prototype constituents into blood of Punica granatum L.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除鞣花酸、鞣質(zhì)類成分外，黃酮類、酚酸類和異香豆素類等成分均能以原型吸收入血，原型入血成分多達(dá)30個(gè)，但綜合代謝組血漿樣品的原型入血成分僅有7個(gè)。這可能是因?yàn)楣辔附o藥量較少，部分含量低的入血成分不足以被檢測到；此外，由于灌胃后定點(diǎn)采血，部分成分因吸收慢尚未進(jìn)入血液，或成分吸收、代謝、排泄快，以代謝產(chǎn)物形式存在于血液循環(huán)中或排出體外，導(dǎo)致血液中檢測不到原型入血成分。

通過腸道灌流和封閉腸環(huán)的方法能夠過濾掉一部分未被吸收的成分，降低綜合代謝成分鑒定的工作量，同時(shí)也是對定點(diǎn)灌胃采血遺漏成分的補(bǔ)充，可提高血中移行成分鑒定的全面性和準(zhǔn)確性。

2.3 代謝產(chǎn)物鑒定

在腸壁代謝組與腸道菌群代謝組血漿樣品中鑒定出12個(gè)相同的代謝產(chǎn)物，列于表3，兩組代謝產(chǎn)物結(jié)果基本無差異。目前尚未見關(guān)于腸壁細(xì)胞對石榴皮代謝作用的研究，除腸道菌群外，腸壁代謝作用對石榴皮代謝極為重要，但由于實(shí)驗(yàn)只能定性判斷代謝成分，不排除灌流實(shí)驗(yàn)中有殘存的腸道菌群介導(dǎo)代謝的可能。

在腸壁代謝組、腸道菌群代謝組和綜合代謝組血漿樣品中共鑒定出18種代謝產(chǎn)物，包括山柰酚、沒食子酸甲酯、鞣花酸的甲基化和葡萄糖醛酸化或糖苷化、尿石素A及其硫酸化物、尿石素C和尿石素D的甲基化物與糖基化物，詳細(xì)信息列于表3。除山柰酚外，主要代謝成分是通過安石榴苷、安石榴林等鞣質(zhì)類代謝產(chǎn)生，結(jié)合文獻(xiàn)[9,19]分析其代謝方式，示于圖5。以安石榴苷為代表的石榴皮鞣質(zhì)類成分主要代謝途徑包括水解、還原、甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化。

圖5 石榴皮中主要鞣質(zhì)類成分代謝途徑Fig.5 Metabolic pathways of the main tannins in Punica granatum L.

代謝產(chǎn)物中含有多種鞣花酸和鞣質(zhì)類成分的代謝產(chǎn)物，這與藥典[1]含量測定考察項(xiàng)相符，表明鞣花酸及鞣質(zhì)類是保證藥效的重要成分。據(jù)文獻(xiàn)[9,19-20]報(bào)道，石榴皮中的鞣質(zhì)類成分在腸道菌群作用下能代謝生成尿石素類成分，與其前體化合物相比更容易被吸收，且被證實(shí)在體內(nèi)外具有抗炎、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和保護(hù)胃腸道等多種活性[21-22]。綜合代謝組血漿中檢測到了尿石素C、尿石素C葡萄糖醛酸化物、尿石素C雙葡萄糖醛酸化物、尿石素A、尿石素A硫酸化物、尿石素A葡萄糖醛酸化物；在腸壁代謝組和腸道菌群代謝組的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了甲基尿石素D葡萄糖醛酸化物、尿石素A葡萄糖醛酸化物。綜合代謝組檢測到的尿石素類成分較腸代謝組多，這可能與生成尿石素代謝物所需的時(shí)間較長有關(guān)，綜合代謝組連續(xù)灌胃給藥3天，尿石素類成分被檢測到的幾率更高；此外，由于灌胃給藥時(shí)體內(nèi)腸道封閉，此時(shí)的厭氧環(huán)境更利于腸道菌群生長。

2.4 入腦成分鑒定

對綜合代謝組腦脊液樣品進(jìn)行鑒定，共檢測到6個(gè)成分。檸檬酸和鞣花酸均能以原型入腦；此外，2個(gè)甲基鞣花酸同分異構(gòu)體、二甲基鞣花酸和二甲基鞣花酸葡萄糖醛酸化物也能在腦脊液中檢測到。腦脊液樣品的質(zhì)譜結(jié)果顯示，檢測到的化合物響應(yīng)值均較小，大部分入腦成分無二級結(jié)構(gòu)。在腸代謝組、綜合代謝組血中移行成分鑒定結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)腦脊液樣品中不同成分的分子離子峰和保留時(shí)間進(jìn)行鑒別，可有效提高質(zhì)譜解析的效率和鑒定結(jié)果的全面性、準(zhǔn)確性。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鞣花酸可有效逆轉(zhuǎn)創(chuàng)傷性腦損傷引起的記憶障礙[24]，并能抑制細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)，下調(diào)JNK/p38MAPK活性，對缺氧缺血性腦損傷起到神經(jīng)保護(hù)作用[25]。此外，鞣花酸及其甲基衍生物是有效的自由基清除劑[26]，其甲基衍生物還可誘導(dǎo)神經(jīng)球干細(xì)胞向神經(jīng)元分化[27]，表明篩選出的入腦成分是石榴皮發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用的重要成分。

3 結(jié)論

將序貫代謝法與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合，研究了石榴皮中發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。從石榴皮提取液中鑒定出38個(gè)化學(xué)成分，其中30個(gè)成分經(jīng)腸吸收以原型入血；并檢測到18個(gè)代謝產(chǎn)物，主要為安石榴苷、安石榴林等鞣質(zhì)類經(jīng)水解、還原、甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化等反應(yīng)產(chǎn)生。篩選出6個(gè)入腦成分，檸檬酸、鞣花酸以原型入腦，經(jīng)代謝生成的2個(gè)甲基鞣花酸同分異構(gòu)體、二甲基鞣花酸和二甲基鞣花酸葡萄糖醛酸化物也能透過血腦屏障入腦。該研究基于多成分藥物代謝理論，將序貫代謝法與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合，靶向識別出石榴皮及其代謝產(chǎn)物中入腦成分，為多成分藥物治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了思路。