孔佳琦，孟憲雙，尚宇瀚，董益陽，馬 強(qiáng)

(1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029；3.北京化工大學(xué)橡膠植物研究中心，北京 100029)

蒲公英屬植物種類繁多[1]，目前研究鑒定過的種主要包括西洋蒲公英(Taraxacumofficinale)、蒙古蒲公英(Taraxacummongolicum)、朝鮮蒲公英(Taraxacumcoreanum)和青膠蒲公英(Taraxacumkok-saghyzRodin,TKS)，其中醫(yī)學(xué)研究論文涉及的蒲公英種多為西洋蒲公英、蒙古蒲公英和朝鮮蒲公英。青膠蒲公英[2]是菊科蒲公英屬多年生植物，原產(chǎn)于哈薩克斯坦、烏茲別克斯坦和中國西北地區(qū)，因其根部含有豐富的膠乳而得到廣泛研究，是具有開發(fā)潛力的產(chǎn)膠植物[3]。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，青膠蒲公英的根部主要用于提取天然橡膠，而其葉并未得到有效利用。目前，青膠蒲公英的葉與經(jīng)提膠后的根均被當(dāng)作廢料處理，附加值較低。

由于中草藥成分復(fù)雜，對其中真正起治療作用的成分往往不夠清晰，從中草藥中發(fā)現(xiàn)新的化學(xué)成分是篩選候選藥物的重要途徑，因此，針對青膠蒲公英中化學(xué)成分的鑒定對于深入開發(fā)其藥用價(jià)值具有重要意義。但由于中草藥基質(zhì)復(fù)雜，且某些成分含量較低，中草藥化學(xué)成分的鑒定工作仍面臨一定困難。目前，質(zhì)譜因高選擇性、高特異性及高靈敏度等特點(diǎn)，在中草藥分析領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[4-8]，尤其是超高效液相色譜與高分辨質(zhì)譜的結(jié)合，將復(fù)雜基質(zhì)組分高效分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析，可獲得高分辨和高靈敏度數(shù)據(jù)，特別適用于中草藥中復(fù)雜成分的鑒定。

本研究擬采用超聲/微波輔助萃取技術(shù)對青膠蒲公英的根和葉進(jìn)行高效萃取后，利用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q/Orbitrap HRMS)的全掃描-數(shù)據(jù)依賴型二級質(zhì)譜掃描模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。為較好兼顧弱極性化合物的檢出，本實(shí)驗(yàn)采用大氣壓化學(xué)電離源(APCI)。數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后，與相關(guān)中藥數(shù)據(jù)庫、在線數(shù)據(jù)庫等比對分析，同時對部分化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行推導(dǎo)，以期為相關(guān)成分結(jié)構(gòu)類似物的快速鑒定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對進(jìn)一步挖掘青膠蒲公英的潛在藥用價(jià)值提供有益參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

UltiMate 3000超高效液相色譜儀、Q Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，配有大氣壓化學(xué)電離源及Xcalibur 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Milli-Q Integral 5超純水系統(tǒng)：美國Merck Millipore公司產(chǎn)品；UWave-2000多功能微波合成萃取儀：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司產(chǎn)品；平行蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI Labortechnik AG公司產(chǎn)品；KQ-500DE型超聲清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；AB204-S型分析天平(感量0.001 g)：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

青膠蒲公英：由黑龍江青膠蒲公英種植基地提供，經(jīng)中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和國家植物基因研究中心(北京)鑒定為菊科蒲公英屬青膠蒲公英(Taraxacumkok-saghyzRodin)的干燥根、葉；甲醇、乙腈(質(zhì)譜級)：美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；甲酸(質(zhì)譜級)：美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY BEH C18柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；柱溫：35 ℃；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～2.0 min(5%B)，2.0～50.0 min(5%～100%B)，50.0～55.0 min(100%B)，55.0～55.1 min(100%～5%B)，55.1～60.0 min(5%B)；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：3 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件 大氣壓化學(xué)電離源；正、負(fù)離子化模式；離子源溫度400 ℃；毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣壓力0.31 MPa；輔助氣流速5 L/min；針電流5 μA；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500；數(shù)據(jù)采集模式：全掃描-數(shù)據(jù)依賴型二級質(zhì)譜掃描模式(Full MS/dd-MS2)采集；全掃描分辨率60 000；離子最大注入時間100 ms；碰撞模式：高能碰撞誘導(dǎo)解離(HCD)，碰撞能量20、40、60 eV，自動增益控制1×106。

1.4 供試品制備

將自然干燥的青膠蒲公英根和葉粉碎，過40目篩，準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.01 g)獲得的根和葉粉末，置于不同的三口燒瓶中，分別加入20 mL甲醇，超聲/微波輔助萃取20 min，其中微波功率400 W，超聲功率560 W，溫度50 ℃。將萃取液過濾蒸發(fā)，加入5 mL甲醇超聲復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，取1 mL進(jìn)行測定(n=3)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Thermo Fisher Scientific公司的Trace-Finder 4.1和Compound Discoverer 2.1軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)與OTCML中藥成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。根據(jù)3次平行實(shí)驗(yàn)均檢出的化合物為初步確定檢出物，將其進(jìn)一步與在線數(shù)據(jù)庫(如PubChem、ChemSpider等)比對相符，則為確定檢出物。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

微波/超聲復(fù)合萃取技術(shù)將超聲波振動與開放式微波兩種作用方式相結(jié)合，充分利用超聲波振動的空穴作用及微波的高能作用，克服了微波輔助萃取時溫度上升過快，易造成受熱不均，從而萃取不完全的不足；同時也克服了超聲萃取時間長及需外部加熱等缺點(diǎn)，具有速度快、能耗低、溶劑用量少等優(yōu)勢，有利于極性和熱不穩(wěn)定性組分的萃取[9-11]。本實(shí)驗(yàn)中，青膠蒲公英的根和葉經(jīng)干燥粉碎后，選擇超聲/微波輔助萃取，比較分析了甲醇、異丙醇、水、二氯甲烷、丙酮和乙腈等6種常見溶劑對青膠蒲公英的萃取效果，APCI+和APCI-模式下的總離子流圖分別示于圖1a，1b。二氯甲烷、丙酮和乙腈的萃取效果較差，信號響應(yīng)強(qiáng)度較低；從色譜峰數(shù)量和豐度來看，APCI+模式下，水和異丙醇萃取物分別以極性和疏水性化合物為主，而在APCI-模式下，水和異丙醇萃取物色譜峰的信號強(qiáng)度整體低于甲醇。綜合考慮萃取物色譜峰的數(shù)量、強(qiáng)度及分布，本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為萃取溶劑。

圖1 不同溶劑萃取物在APCI+(a)和APCI-(b)模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of the extracts using different solvents in APCI+ (a) and APCI- (b) modes

2.2 青膠蒲公英化學(xué)成分的鑒定

將UHPLC-Q/Orbitrap HRMS采集獲得的原始數(shù)據(jù)，采用Compound Discoverer 2.1和TraceFinder 4.1軟件進(jìn)行色譜峰對齊和提取，對提取后的準(zhǔn)分子離子及其同位素、碎片離子峰強(qiáng)度等信息進(jìn)行OTCML檢索匹配，依據(jù)匹配度分值(一般要求大于80分)對未知成分進(jìn)行鑒定。為避免噪音等干擾因素，需預(yù)設(shè)峰提取規(guī)則，如質(zhì)量偏差、信噪比及峰強(qiáng)度閾值等。依據(jù)空白溶劑甲醇和500 μg/L杜鵑花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析結(jié)果：峰面積>105及質(zhì)量偏差<5×10-6。因此，為盡可能多地檢出化合物并提高鑒定準(zhǔn)確度，本實(shí)驗(yàn)將峰提取條件設(shè)置如下：質(zhì)量偏差<5×10-6，信噪比(S/N)>10，峰面積>70 000，同時結(jié)合在線數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)檢索，進(jìn)一步對未知物的鑒定進(jìn)行驗(yàn)證。青膠蒲公英中杜鵑花酸依據(jù)一級精確質(zhì)量數(shù)、同位素峰分布以及二級質(zhì)譜圖匹配的鑒定過程示于圖2。采用OTCML檢索以及參考在線數(shù)據(jù)庫等，在青膠蒲公英根和葉中共鑒定了164種化合物，包括氨基酸類、香豆素類、苯丙酸類、黃酮類、生物堿類、倍半萜和萜類[12]等。

注：a.一級精確質(zhì)量數(shù)；b.同位素峰分布；c.二級質(zhì)譜圖比對圖2 杜鵑花酸的鑒定過程Fig.2 Identification process of azelaic acid

2.3 氨基酸及維生素的鑒定

青膠蒲公英根和葉中均鑒定出L-脯氨酸、L-纈氨酸和L-酪氨酸等多種氨基酸，且部分氨基酸在正、負(fù)電離模式下均出峰(如L-蘇氨酸)。L-脯氨酸(C5H9NO2)在APCI+模式下的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z116.070 61，其碎片離子為m/z70.065 13，與其脫羧后的碎片離子[M+H-COOH]+的m/z70.065 15一致。L-酪氨酸(C9H11NO3)在APCI+模式下的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z182.081 17，可能有2種裂解途徑：一是發(fā)生重排反應(yīng)，生成m/z123.043 96碎片離子，與[M+H-C2OH-NH3]+的m/z一致；二是先丟失甲酸分子產(chǎn)生[M+H-HCOOH]+(m/z136.075 74)，隨后丟失NH3生成[M+H-HCOOH-NH3]+(m/z119.049 11)，最終發(fā)生中性丟失(CO)得到m/z91.054 18。而在APCI-模式下，L-色氨酸的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z203.082 58，可通過碎裂產(chǎn)生[M-H-COOH-NH2]-(m/z142.066 13)、[M-H-COOH-NH2-C2H2]-(m/z116.050 56)和[C2H4NO2]-(m/z74.024 76)等碎片離子。

在青膠蒲公英根和葉的甲醇提取物中鑒定到的維生素類包括煙酸、煙酰胺、維生素D2和維生素D3。以煙酸為例，其在APCI+模式下準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z124.039 20，碎片離子為脫羧生成的[M+H-CO2]+(m/z80.049 39)。

2.4 核苷類化合物的鑒定

在青膠蒲公英中鑒定出胞嘧啶、腺嘌呤、胞苷、腺苷、尿苷、鳥苷和巴豆苷等核苷類化合物。胞苷在APCI+模式下的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z244.092 45，通過丟失1分子核糖可得到[M+H-C5H8O4]+(m/z112.050 41)，該碎片離子進(jìn)一步丟失NH3可產(chǎn)生[M+H-C5H8O4-NH3]+(m/z95.023 72)碎片離子。鳥苷(C10H13N5O5)在APCI-模式下的準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z282.084 26，同樣可通過脫掉1分子核糖產(chǎn)生[M-H-C5H8O4]-(m/z150.042 04)和[C5HN4O]+(m/z133.015 55)碎片離子。胞嘧啶在APCI+模式下的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z112.050 40，在給予合適的能量后，丟失NH3生成[M+H-NH3]+碎片離子(m/z95.023 83)。腺嘌呤在APCI-模式下生成的準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z134.047 18，經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離可獲得[C4H2N3]-(m/z92.025 44)和[C4H3N4]-(m/z107.036 30)。綜上所述，核苷類物質(zhì)的質(zhì)譜裂解規(guī)律主要是準(zhǔn)分子離子脫去核糖，或進(jìn)一步發(fā)生碎裂丟失NH3等生成其他碎片離子。

2.5 黃酮類化合物的鑒定

在青膠蒲公英中鑒定出9種黃酮類化合物，分屬黃酮類、黃酮醇類、查爾酮類和異黃酮類。其中，木犀草素、羥基芫花素、5-羥基-6,7-二甲氧基黃酮和高車前素屬于黃酮類，龍血素A歸屬為查爾酮類，非瑟酮和山奈酚屬于黃酮醇類，而鳶尾甲黃素B和鳶尾黃素屬于異黃酮類。同屬一類的化合物母核相同，裂解規(guī)律相似，主要發(fā)生脫去CO、CO2、H2O等基團(tuán)的反應(yīng)及重排反應(yīng)。例如，在APCI+模式下，龍血素A的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z287.127 32，其碎片離子包括[M+H-CH3OH]+(m/z255.101 29)、[M+H-2CO]+(m/z227.106 45)和[C7H5O2]+(m/z121.064 67)，符合黃酮類的一般碎裂途徑。而鳶尾甲黃素B在APCI+模式下的分子離子[M+H]+為m/z331.081 12，由于其分子結(jié)構(gòu)中含甲基，裂解過程中可能通過丟失甲基產(chǎn)生[M+H-CH3]+(m/z316.054 40)，也可能通過其他裂解方式生成如[M+H-H2O]+(m/z313.034 48)、[M+H-OCH3-OH-C2H2]+(m/z259.205 60)、[C7H5O2]+(m/z121.101 20)等特征碎片離子[13]。

2.6 香豆素類化合物的鑒定

在青膠蒲公英中共鑒定出19種香豆素類化合物[14]，由于結(jié)構(gòu)類似，它們在電離過程中的裂解行為也基本相同。在APCI-模式下，香豆素類化合物的裂解途徑(以七葉苷為例)示于圖3。香豆素母核上若存在取代基，則取代基在電離過程中易丟失。此外，還存在中性丟失，如失去CO、H2O和CO2，生成一系列m/z159、147、131、119、103、91等共同碎片離子。分別以異補(bǔ)骨脂素和8-甲氧基呋喃香豆素為例，異補(bǔ)骨脂素在APCI+模式下的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z187.038 77，碎片離子包括m/z159.043 91、143.085 42、131.049 01，所得碎片離子信息符合香豆素類化合物的一般裂解規(guī)律，其中，m/z159.043 91、143.085 42和131.049 01分別為[M+H-CO]+、[M+H-CO2]+和[M+H-2CO]+碎片離子，可與文獻(xiàn)[15]報(bào)道相互印證；8-甲氧基呋喃香豆素在APCI+下的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z217.049 22，碎片離子包括[M+H-CH3]+(m/z202.076 49)、[M+H-2CO]+(m/z161.059 49)和[M+H-CO2-CO-OCH3]+(m/z115.054 07)，經(jīng)鑒定同樣符合上述香豆素類化合物的一般裂解規(guī)律。

圖3 APCI-模式下七葉苷的質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 Proposed fragmentation pathways of esculin in APCI- mode

2.7 萜類及甾醇類化合物的鑒定

青膠蒲公英中含有豐富的萜類化合物。本研究共鑒定出2種單萜化合物、1種二萜化合物、15種倍半萜類化合物和14種五環(huán)三萜類化合物。萜類化合物的質(zhì)譜裂解方式主要發(fā)生中性丟失和Diels-Alder反應(yīng)。樟腦屬于單萜，在APCI+模式下形成的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z153.127 52，進(jìn)而通過裂解產(chǎn)生[M+H-H2O]+(m/z135.116 88)、[M+H-H2O-C2H4]+(m/z107.085 60)、[M+H-H2O-C3H4]+(m/z95.085 62)和[M+H-H2O-C3H6]+(m/z93.069 99)等碎片離子。二萜類化合物松香酸分子結(jié)構(gòu)中含有3個六元環(huán)，當(dāng)施加能量誘導(dǎo)解離時，六元環(huán)碎裂可產(chǎn)生[M+H-C6H14-CO2]+(m/z149.132 16)和[C9H13]+(m/z121.101 25)碎片離子。

從青膠蒲公英樣品中鑒定出的倍半萜類化合物包含愈創(chuàng)木烷型倍半萜(去氫木香內(nèi)酯、含笑內(nèi)酯和姜黃醇等)、桉烷型倍半萜(青蒿酸、雙青蒿酸、甘松新酮[16]和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ等)和吉瑪烷型倍半萜(姜黃酮、林丹內(nèi)酯和小白菊內(nèi)酯等)。其中，愈創(chuàng)木烷型倍半萜姜黃醇在APCI+模式下產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z237.184 45，通過解離可獲得[M+H-H2O]+碎片離子(m/z219.175 40)；吉瑪烷型倍半萜小白菊內(nèi)酯[17]的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z249.147 93，通過在醚鍵處丟失1分子H2O可產(chǎn)生 [M+H-H2O]+碎片離子(m/z231.137 42)，進(jìn)而發(fā)生中性丟失，得到[M+H-H2O-CO]+(m/z203.142 56)，或經(jīng)過碰撞產(chǎn)生[C13H13O]+(m/z185.131 91)和[C8H9]+(m/z105.069 73)碎片離子；桉烷型倍半萜類化合物白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在APCI+模式下產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z249.148 27，其可能的裂解途徑示于圖4。青蒿素是一種倍半萜類化合物，以青蒿素[18]為例，探究此類倍半萜在APCI+模式下的離子化方式，其準(zhǔn)分子離子[M+H]+為m/z283.153 53，可能的裂解途徑示于圖5。

圖4 APCI+模式下白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的質(zhì)譜裂解途徑Fig.4 Proposed fragmentation pathways of atractylenolide Ⅲ in APCI+ mode

圖5 APCI+模式下青蒿素的質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 Proposed fragmentation pathways of artemisinin in the APCI+ mode

五環(huán)三萜類化合物的常見類型包括齊墩果烷型、羽扇豆烷型和烏蘇烷型，它們的分子結(jié)構(gòu)類似，其六元環(huán)3號位的取代基一般為羥基、羰基或羧基，17號位的取代基一般為羥基或羧基，因此它們具有相似的碎裂模式。在APCI+下，五環(huán)三萜類化合物一般會脫去3號位或17號位上的取代基，然后并列六元環(huán)斷裂產(chǎn)生一系列共同碎片離子(z=1)，如C30H49(m/z409)、C23H23(m/z299)、C23H21(m/z297)、C20H29(m/z269)、C18H27(m/z219)、C18H25(m/z217)、C15H23(m/z203)、C14H23(m/z191)、C14H21(m/z189)、C8H13(m/z109)、C8H11(m/z107)、C7H11(m/z95)和C6H9(m/z81)等[19]。對每類五環(huán)三萜類化合物選取1個代表化合物進(jìn)行裂解規(guī)律的推導(dǎo)，其結(jié)果示于圖6。

圖6 APCI+模式下五環(huán)三萜類成分的質(zhì)譜裂解途徑Fig.6 Proposed fragmentation pathways of pentacyclic triterpenoids in APCI+ mode

此外，通過數(shù)據(jù)庫比對可知，從青膠蒲公英樣品中鑒定出的4種甾醇類化合物分別為豆甾醇、澤瀉醇A、β-谷甾醇和菜油甾醇。甾醇類化合物與五環(huán)三萜類化合物類似，APCI+電離過程中首先在含—OH或者—COOH處加H生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子，隨后可發(fā)生脫水反應(yīng)，并進(jìn)一步產(chǎn)生類似于五環(huán)三萜類化合物中六元環(huán)碎裂后生成的一系列碎片離子。例如，β-谷甾醇的準(zhǔn)分子離子為[M+H]+(m/z415.392 88)，碎片離子為[M+H-H2O]+(m/z397.382 45)、[C12H15]+(m/z161.132 68)、[C11H15]+(m/z147.116 23)和[C9H11]+(m/z119.085 44)。

2.8 有機(jī)酸化合物的鑒定

有機(jī)酸多為碳環(huán)芳香族酸酚性化合物，這類化合物在植物中廣泛存在，并具有一定的抗菌、抗炎、抗氧化等作用[20-21]。在青膠蒲公英根和葉樣品中共鑒定出44種有機(jī)酸成分，其二級質(zhì)譜的碎裂模式包括失去苯環(huán)取代基、脫羧、脫水和碳鏈碎裂等。以杜鵑花酸為例，推測非芳香酸可能的裂解途徑，其結(jié)果示于圖7。以新綠原酸[22]為例，推斷碳環(huán)芳香族酸酚性化合物可能的裂解規(guī)律，其結(jié)果示于圖8。

圖7 APCI+模式下杜鵑花酸的質(zhì)譜裂解途徑Fig.7 Proposed fragmentation pathways of azelaic acid in APCI+ mode

圖8 APCI-模式下新綠原酸的質(zhì)譜裂解途徑Fig.8 Proposed fragmentation pathways of neochlorogenic acid in APCI- mode

3 結(jié)論

本研究采用UHPLC-Q/Orbitrap HRMS技術(shù)，在APCI正、負(fù)電離模式下對青膠蒲公英根和葉中的未知化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，根據(jù)化合物的一級精確質(zhì)量數(shù)、同位素峰分布及二級質(zhì)譜碎片等關(guān)鍵信息，與中藥數(shù)據(jù)庫OTCML進(jìn)行比對分析，并參考在線數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，共鑒定出164種化合物，包括黃酮類、香豆素類、萜類、有機(jī)酸類、生物堿類、木質(zhì)素類等多種成分。此外，對部分鑒定化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行推導(dǎo)，有助于新化合物的發(fā)現(xiàn)，同時為深入挖掘青膠蒲公英的潛在藥用價(jià)值提供了理論基礎(chǔ)。