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基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物定量方法研究進(jìn)展

2022-06-15 03:43:38樊小雪楚占營(yíng)朱曼曼雷喜梅宋雨蒙武利慶戴新華俞曉平
質(zhì)譜學(xué)報(bào) 2022年3期
關(guān)鍵詞:同位素質(zhì)譜定量

樊小雪,翟 睿,楚占營(yíng),朱曼曼,雷喜梅,宋雨蒙,武利慶,江 游,戴新華,方 向,俞曉平

(1.中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310018;2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院前沿計(jì)量科學(xué)中心,國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管技術(shù)創(chuàng)新中心(質(zhì)譜),北京 100029)

腫瘤標(biāo)志物(TM)是一類可用于指示腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程的生物分子,主要存在于患者的體液(如血液、淋巴液等)和組織中[1],在腫瘤的早期篩查、良惡鑒別、預(yù)后評(píng)估及術(shù)后監(jiān)測(cè)等方面發(fā)揮重要作用[2]。目前,腫瘤標(biāo)志物的主要存在形式為蛋白質(zhì)、核酸、多胺類等。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者,蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物能提供諸多功能信息,并精準(zhǔn)反映相關(guān)細(xì)胞的生理狀態(tài),因而成為研究腫瘤標(biāo)志物的重要載體[3]。但蛋白質(zhì)的豐度動(dòng)態(tài)范圍較寬,且存在復(fù)雜多樣的翻譯后修飾,為蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確定量提出了挑戰(zhàn)[4-5]。

液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)是鑒定和定量生物樣品中蛋白質(zhì)的有力工具,已逐步應(yīng)用于許多醫(yī)學(xué)相關(guān)的研究領(lǐng)域,如治療藥物監(jiān)測(cè)、毒理學(xué)分析及蛋白質(zhì)定量分析等[6]。基于LC-MS技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物定量的方法不依賴于抗體,并且能提供高度的特異性及異構(gòu)體辨別能力,相較于基于抗體的方法(如免疫印跡法[7]、酶聯(lián)免疫吸附法[8]等)有諸多優(yōu)勢(shì),如可以高通量檢測(cè)和量化天然蛋白質(zhì)及翻譯后修飾等[9]。如何在含有高豐度蛋白的復(fù)雜樣品中準(zhǔn)確檢測(cè)和定量蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物是基于LC-MS對(duì)蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物定量的一個(gè)挑戰(zhàn)[10]。研究人員通過不同的設(shè)計(jì)原理開發(fā)出多種定量方法,實(shí)現(xiàn)了高度復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確定量[11-12]。本文將從用于定量蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物的樣品前處理方法及質(zhì)譜掃描策略2個(gè)方面,對(duì)近年來(lái)的主要定量方法進(jìn)行總結(jié)。

1 用于定量蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物的樣品前處理方法

目前,基于LC-MS定量腫瘤標(biāo)志物的前處理策略主要分為非標(biāo)記策略和標(biāo)記策略。根據(jù)引入同位素的方式,標(biāo)記策略分為體內(nèi)標(biāo)記(如細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(SILAC))和體外標(biāo)記(如等重同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)、串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(TMT)等)。

1.1 非標(biāo)記策略

非標(biāo)記策略(lable-free)是一種不需要使用穩(wěn)定同位素標(biāo)簽的技術(shù),通過對(duì)酶解后的肽段進(jìn)行LC-MS/MS大規(guī)模數(shù)據(jù)分析,比較不同樣品中相應(yīng)肽段的信號(hào)強(qiáng)度,從而對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量;也可以通過比較同一肽段質(zhì)譜水平的離子強(qiáng)度或峰面積等進(jìn)行定量[13-14]。與同位素標(biāo)記方法相比,其具有靈活性和成本效益,且不涉及復(fù)雜的標(biāo)記步驟等優(yōu)勢(shì)[15-16]。Yang等[17]采用非標(biāo)記策略,通過鳥槍法定量分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的糖蛋白表達(dá)差異,結(jié)果顯示α-1抗胰蛋白酶是最具潛力的候選生物標(biāo)志物之一。隨后使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)試了70個(gè)獨(dú)立樣本(35例膀胱癌病例),對(duì)候選生物標(biāo)志物A1AT進(jìn)行驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)表明,A1AT檢測(cè)對(duì)膀胱癌的靈敏度為74%,特異性為80%。Song等[18]為了尋找對(duì)胃癌具有早期診斷價(jià)值的新型生物標(biāo)志物,通過非標(biāo)記策略進(jìn)行了大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析,示于圖1,研究結(jié)果確定了537個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(包括280種上調(diào)和257種下調(diào)蛋白質(zhì)),篩選出15個(gè)潛在胃癌生物標(biāo)志物,并提出4種蛋白質(zhì)(ATP5B、ATP5O、NDUFB4、NDUFB8)對(duì)胃癌有較高的診斷能力,為胃癌的治療提供了新靶點(diǎn)。

1.2 標(biāo)記策略

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)

細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(SILAC)定量的基本原理是采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的必需氨基酸取代細(xì)胞培養(yǎng)基中相應(yīng)的氨基酸,細(xì)胞經(jīng)5~6個(gè)細(xì)胞周期后,被同位素標(biāo)記的氨基酸完全替代了原有氨基酸,參與細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)過程;將標(biāo)記細(xì)胞與非標(biāo)記細(xì)胞的裂解蛋白按細(xì)胞數(shù)或蛋白量等比例混合,經(jīng)分離純化后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜圖中2個(gè)同位素肽段的峰面積比進(jìn)行相對(duì)定量[19]。本方法的優(yōu)勢(shì)是允許樣品在細(xì)胞裂解消化成肽之前混合、標(biāo)記效率高(可達(dá)100%)且標(biāo)記效果穩(wěn)定、靈敏度高、可直接實(shí)施定量,具有較高的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。但SILAC技術(shù)是細(xì)胞層次的,對(duì)組織的定量難度較大且成本較高[20]。SILAC可用于分析惡性腫瘤的整體蛋白質(zhì)組表達(dá)變化、闡明各種癌癥惡性轉(zhuǎn)化的潛在機(jī)制、研究藥物或其他治療引起的蛋白質(zhì)組學(xué)變化等[21]。Lau等[22]通過對(duì)SILAC和穩(wěn)定同位素二甲基標(biāo)簽法進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)SILAC更具重現(xiàn)性,且適用于大樣本的蛋白質(zhì)定量研究。Yeh等[23]采用SILAC和iTRAQ對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)galectin-1可能是預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌(HCC)患者對(duì)索拉非尼治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物,并有望幫助HCC分期及指導(dǎo)個(gè)性化治療。Clark等[24]通過三重SILAC定量分析策略,揭示了與非小細(xì)胞肺癌外泌體相關(guān)的蛋白表達(dá)譜,表明這些外泌體在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用,并確定了幾種潛在的候選生物標(biāo)志物,示于圖2。

圖2 三重SILAC定量分析策略示意圖[24]Fig.2 Schematic diagram of triple SILAC quantitative[24]

1.2.2等重同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量 等重同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)[25]是基于iTRAQ標(biāo)簽的一種定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),iTRAQ試劑是一種可與肽段氨基反應(yīng)的等重同位素標(biāo)簽,包含報(bào)告基團(tuán)、肽反應(yīng)基團(tuán)和平衡基團(tuán)。一組iTRAQ試劑可同時(shí)標(biāo)記4個(gè)或8個(gè)蛋白質(zhì)樣品,將標(biāo)記的樣品混合后進(jìn)行LC-MS/MS分析[26-27]。在一級(jí)質(zhì)譜中,不同樣品中的相同肽段與相同質(zhì)量數(shù)的iTRAQ試劑的反應(yīng)產(chǎn)物具有相同的質(zhì)荷比,表現(xiàn)為同一個(gè)峰。而在二級(jí)質(zhì)譜中,iTRAQ標(biāo)簽的平衡基團(tuán)斷裂后,不同樣品的報(bào)告基團(tuán)表現(xiàn)出不同的質(zhì)荷比,通過二級(jí)質(zhì)譜中各報(bào)告基團(tuán)峰的信號(hào)強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)肽段的相對(duì)定量,并回溯到蛋白質(zhì)水平。iTRAQ技術(shù)具有很高的靈敏度和蛋白質(zhì)覆蓋率[28],可用于研究癌癥的發(fā)生、發(fā)展以及復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制[29-30],在腫瘤標(biāo)志物的定量方面有多種應(yīng)用,如追蹤癌癥術(shù)后早期復(fù)發(fā)的血清蛋白質(zhì)組學(xué)[31]、分析定量癌癥的候選生物標(biāo)志物[32]等。Wang等[33]采用基于iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析不同HCC亞型的分子特征,成功篩選出57種差異表達(dá)的蛋白質(zhì),它們?cè)谀[瘤組織和非腫瘤組織之間的表達(dá)程度顯著不同,且與腫瘤大小密切相關(guān)。此外,Hsu等[34]使用基于iTRAQ標(biāo)簽的LC-MS/MS技術(shù)在1 763個(gè)蛋白質(zhì)中鑒定并驗(yàn)證了6種潛在的肺腺癌生物標(biāo)志物(ERO1L、PABPC4、RCC1、RPS25、NARS、TARS),這些蛋白質(zhì)在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌中的表達(dá)比相鄰正常組織增加了1.5倍,且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),早期肺腺癌患者的ERO1L過表達(dá)與較差的生存率呈正相關(guān)。Xing等[35]基于iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法系統(tǒng)地比較了單一和多發(fā)病變的原發(fā)性肝癌之間的總體蛋白質(zhì)組概況,與非癌組織相比,多發(fā)病變和單一病變的HCC組織中分別有107和330個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)異常;同時(shí)表明,兩者的發(fā)生和發(fā)展可能存在不同的分子機(jī)制,HSD17B13和HK2蛋白可能是單一和多發(fā)病變的原發(fā)性肝癌的潛在生物標(biāo)志物,示于圖3。Xia等[36]采用iTRAQ結(jié)合二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(2D LC-MS/MS)法鑒定出惡性間皮瘤患者和健康對(duì)照組間的145種差異蛋白,提出FLNA、FBLN1和TSP-1可能是診斷惡性間皮瘤及篩選高危人群的潛在蛋白質(zhì)類候選標(biāo)志物,并表明使用iTRAQ分析血清蛋白質(zhì)組是發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的可行策略。

圖3 基于iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法系統(tǒng)地比較單一和多發(fā)病變的原發(fā)性肝癌之間的總體蛋白質(zhì)組[35]Fig.3 Validation of the differentially expressed proteins in the primary HCC with single and multiple lesions[35]

1.2.3串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽 與iTRAQ標(biāo)簽技術(shù)相似,串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(TMT)包括報(bào)告基團(tuán)、肽反應(yīng)基團(tuán)、平衡基團(tuán)3部分,反應(yīng)基團(tuán)與肽段的氨基發(fā)生特異性共價(jià)結(jié)合反應(yīng),將TMT試劑連接到肽段上。該技術(shù)最多可使用16個(gè)同位素標(biāo)簽來(lái)標(biāo)記多肽的氨基。TMT技術(shù)具有高靈敏度、高通量等優(yōu)點(diǎn),可用于多種肽的分離[37-38]、腫瘤及其鄰近組織中肽/蛋白質(zhì)的定量[39]等。Huang等[40]使用10個(gè)同位素標(biāo)簽標(biāo)記了6種乳腺腫瘤細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì),并通過Q Exactive HF質(zhì)譜對(duì)樣品進(jìn)行分析,共鑒定出8 706個(gè)蛋白質(zhì)和28 186個(gè)磷酸肽,示于圖4。2017年,Stewart等[41]使用TMT鑒定了5 535個(gè)蛋白質(zhì),表明TMT能夠作為定量腫瘤標(biāo)志物的方法。Dai等[42]在乳頭狀甲狀腺癌(PTC)和侵入性表型(IPTC)上進(jìn)行基于TMT標(biāo)記的質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn),鑒定并定量與PTC和IPTC組相同的4 607個(gè)蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)了一些候選的生物標(biāo)志物,為研究甲狀腺癌的侵襲過程提供了新見解,為甲狀腺癌的治療提供了新思路。Zhou等[43]收集了15名早期胃癌患者和15名健康對(duì)照者的血漿樣本,經(jīng)選擇性去除高豐度蛋白質(zhì)后,用LC-MS/MS結(jié)合TMT對(duì)血漿樣品進(jìn)行分析,共鑒定出2 040個(gè)蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)11個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì),為早期胃癌的診斷提供了潛在的標(biāo)志物,也為進(jìn)一步探索胃癌的發(fā)病機(jī)制提供了線索。

圖4 酶切6種乳腺癌細(xì)胞裂解液中的蛋白提取物,酶切后的肽段用10種同位素標(biāo)簽標(biāo)記,隨后在質(zhì)譜儀上分析樣品[40]Fig.4 Protein extracts from the 6 types of breast cancer cell lysates were digested,and the digested peptides were labeled with 10 isotopic labels,and then the samples were analyzed on a mass spectrometer[40]

1.2.4穩(wěn)定同位素編碼親和標(biāo)簽 穩(wěn)定同位素編碼親和標(biāo)簽(ICAT)最早由Gygi及其同事提出[44],主要用于定量比較從同一生物系統(tǒng)的2個(gè)不同樣本(狀態(tài))中提取的目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。ICAT試劑由半胱氨酸反應(yīng)基團(tuán)、中間的連接子和親和標(biāo)簽3部分組成,其分為輕標(biāo)(不含氘)和重標(biāo)(含8個(gè)氘)2種形式[45]。ICAT標(biāo)簽[46]首先選擇性地標(biāo)記含半胱氨酸的肽段,經(jīng)LC-MS/MS分析,比較不同ICAT試劑標(biāo)記的1對(duì)肽段的信號(hào)強(qiáng)度比例,定量計(jì)算其所對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的相對(duì)豐度。但I(xiàn)CAT無(wú)法檢測(cè)缺乏半胱氨酸殘基、強(qiáng)疏水性及翻譯后修飾的肽,且用氘代ICAT試劑標(biāo)記的多肽容易發(fā)生色譜峰分離,導(dǎo)致峰間比例不一致。Stewart等[47]使用ICAT比較順鉑敏感和耐藥卵巢癌細(xì)胞系之間的差異蛋白組,發(fā)現(xiàn)63個(gè)蛋白質(zhì)在順鉑敏感細(xì)胞中過表達(dá),58個(gè)蛋白質(zhì)在順鉑耐藥細(xì)胞中過表達(dá),表明一些蛋白質(zhì)可能參與細(xì)胞對(duì)順鉑的反應(yīng),并可能作為卵巢癌的標(biāo)記物及藥物靶標(biāo)。Kang等[48]采用ICAT和串聯(lián)質(zhì)譜法分析6例乳腺癌患者和6例健康女性的血漿蛋白組,共識(shí)別和定量了155個(gè)蛋白質(zhì),其中33個(gè)蛋白質(zhì)在乳腺癌患者和健康女性的血漿之間表現(xiàn)出超過1.5倍的豐度變化,并通過實(shí)驗(yàn)將生物素酶確立為一種潛在的乳腺癌生物標(biāo)志物。

2 LC-MS定量質(zhì)譜掃描策略

蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量通常高達(dá)數(shù)萬(wàn)甚至數(shù)十萬(wàn),在質(zhì)譜分析之前需進(jìn)行酶解,最終從肽段的測(cè)量結(jié)果回溯到蛋白質(zhì)含量。這一步驟使樣品分析的復(fù)雜性劇增,一級(jí)質(zhì)譜信息不足以對(duì)肽段進(jìn)行定性,因而多級(jí)質(zhì)譜掃描策略成為目前定量分析生物樣品的有效方法。常用的定量質(zhì)譜掃描策略主要包括多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)、平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(PRM)、數(shù)據(jù)獨(dú)立采集(DIA)等[49],示于圖5。

圖5 MRM,PRM,DIA的工作原理[49]Fig.5 MRM,PRM,DIA working principle[49]

2.1 多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)

多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)也稱為選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM),通過對(duì)特異性母離子進(jìn)行信號(hào)掃描,去除不符合要求的離子信號(hào)干擾,從而降低背景噪音、提高信噪比。MRM利用三重四極桿(QqQ)質(zhì)譜優(yōu)異的重復(fù)性、靈敏度和選擇性,可有效區(qū)分蛋白質(zhì)亞型、翻譯后修飾及突變形式[50-51]。MRM具有臨床及臨床前研究所需的重現(xiàn)性高、定量精度高、生物分子分析速度快等優(yōu)點(diǎn)[52-53],在分析目標(biāo)肽段時(shí)通常需要使用已知質(zhì)量的同位素標(biāo)記肽段或蛋白質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)加入待測(cè)樣本中,通過質(zhì)譜儀測(cè)定同位素豐度比例,計(jì)算出目標(biāo)蛋白質(zhì)含量[54],并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品中的特定蛋白質(zhì)進(jìn)行絕對(duì)定量[55]。由于MRM僅能測(cè)量已知的蛋白質(zhì),不能做篩選性的分析,因此必須優(yōu)化特定的操作條件[56]。目前,MRM技術(shù)已經(jīng)參與了十幾種血漿生物標(biāo)志物的鑒定和驗(yàn)證[57]。Naboulsi等[58]采用非標(biāo)記策略結(jié)合MRM方法分析了一個(gè)由50名患者組成的隊(duì)列,證明了Versican核心蛋白(VCAN)與高分化低分期的HCC顯著相關(guān),首次證實(shí)了VCAN可作為早期HCC診斷的潛在生物標(biāo)志物。Kim等[59]通過添加穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)作為內(nèi)標(biāo),使用單克隆抗體富集甲胎蛋白(AFP),使用具有高親和力的LCA凝集素分離AFP-L3,之后進(jìn)行去糖基化、胰蛋白酶消化及脫鹽,比較MRM-MS與液相結(jié)合分析法(LiBA)的檢測(cè)結(jié)果,證實(shí)采用MRM-MS方法檢測(cè)AFP及AFP-L3的假陰性率較低,更適合肝癌的早期檢測(cè),示于圖6。Kim等[60]應(yīng)用LC-SRM對(duì)非小細(xì)胞肺癌的95種潛在腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行分析,證實(shí)共有17個(gè)蛋白質(zhì)可作為有效的腫瘤標(biāo)記物,其中zyxin(ZYX)被確定為非小細(xì)胞肺癌的潛在早期診斷標(biāo)志物。

圖6 通過測(cè)定AFP和AFP-L3比較MRM-MS法和LiBA法[59]Fig.6 Comparation of MRM-MS method and LiBA method by measuring AFP and AFP-L3[59]

2.2 平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)

近年來(lái),高分辨質(zhì)譜發(fā)展迅速,其具有掃描速率快、動(dòng)態(tài)范圍寬、定量精確等優(yōu)點(diǎn)[61]。平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(PRM)是一種衍生于MRM的靶向蛋白質(zhì)定量技術(shù),具有Orbitrap質(zhì)量分析器高分辨、高精度及四極桿高選擇性的特點(diǎn)[62],已成為MRM的強(qiáng)大替代技術(shù)。與MRM相同,PRM首先以四極桿(Q1)作為過濾器來(lái)篩選目標(biāo)肽段的前體離子,前體離子在Q2中碎裂之后,所有產(chǎn)物離子被收集在軌道阱(Orbitrap)中進(jìn)行高分辨和高精度掃描,以獲得MS2譜圖[63]。由于PRM可以同時(shí)監(jiān)控所有碎片離子,使其不再需要識(shí)別和驗(yàn)證特定離子,從而獲得了更快、更簡(jiǎn)單的工作流程。PRM技術(shù)不僅具有SRM/MRM的定量分析能力,還具有定性分析能力,因此更適用于對(duì)蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行定性、定量分析[64-65]。Kim等[66]認(rèn)為,PRM可以準(zhǔn)確定量肺癌患者和健康對(duì)照者血漿中血清淀粉樣蛋白A的特定亞型,在區(qū)分健康和疾病方面具有高精確度。Sathe等[67]通過使用高分辨質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(TMT)技術(shù)識(shí)別阿爾茨海默氏癥的潛在腦脊液生物標(biāo)志物,隨后使用PRM對(duì)已知的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證,共識(shí)別出2 327個(gè)蛋白質(zhì),其中139個(gè)在阿爾茲海默癥患者的腦脊液中變化明顯。這些蛋白質(zhì)有望用于監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和藥物治療,一旦在大型研究中得到驗(yàn)證,還可用于阿爾茲海默癥的早期檢測(cè)。Hao等[68]為了驗(yàn)證用以區(qū)分髓母細(xì)胞瘤患者與對(duì)照患者的潛在尿蛋白生物標(biāo)志物,采用基于TMT技術(shù)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法分別鑒定手術(shù)前后髓母細(xì)胞瘤患者和健康人群尿液蛋白質(zhì)組中的差異蛋白,使用PRM方法在112個(gè)樣本中驗(yàn)證了17種潛在生物標(biāo)志物,其中CADH1、FGFR4和FIBB的組合可用于區(qū)分髓母細(xì)胞瘤患者和健康人群,這些發(fā)現(xiàn)將有助于尿液蛋白質(zhì)組學(xué)在篩查和監(jiān)測(cè)髓母細(xì)胞瘤中的應(yīng)用,示于圖7。

圖7 通過PRM驗(yàn)證髓母細(xì)胞瘤尿蛋白生物標(biāo)志物[68]Fig.7 Validation of medulloblastoma urine protein biomarkers by PRM[68]

2.3 數(shù)據(jù)非依賴采集

近年來(lái),數(shù)據(jù)非依賴采集(DIA)技術(shù)備受關(guān)注,它是基于靜電場(chǎng)軌道阱Orbitrap的一種全息式質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式[69],可以識(shí)別更多的肽段,且串聯(lián)質(zhì)譜后有更好的重復(fù)性、準(zhǔn)確性及精密度[70-71]。在一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)后,DIA會(huì)對(duì)特定質(zhì)荷比范圍內(nèi)的所有母離子進(jìn)行碎裂,采集所有母離子的碎片離子,并快速依次掃描相鄰母離子范圍內(nèi)的所有碎片離子,從而對(duì)蛋白進(jìn)行定性和定量分析。DIA無(wú)需選擇離子即可對(duì)所有離子進(jìn)行檢測(cè),使其在較寬的質(zhì)荷比范圍內(nèi)碎裂,提供更寬的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍,提高鑒定的重現(xiàn)性、靈敏度和準(zhǔn)確性,有效地增強(qiáng)了蛋白質(zhì)組的覆蓋率,極大縮短了每個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間,適合大樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)研究;但DIA模式產(chǎn)生的碎片離子譜圖過于復(fù)雜,可能丟失部分肽段及碎片離子的對(duì)應(yīng)關(guān)系,對(duì)其結(jié)果的解析產(chǎn)生一定困難[72]。Rauniyar等[73]利用DIA及PRM技術(shù)證明載脂蛋白A-IV(ApoA-IV)可作為卵巢癌的腫瘤標(biāo)志物,對(duì)卵巢癌的早檢及靶向治療具有積極意義。靶向卵巢癌蛋白質(zhì)組分析表明,ApoA-IV作為卵巢癌腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果比免疫測(cè)定更可靠,示于圖8。Song等[74]在LC-MS平臺(tái)上構(gòu)建了一個(gè)DIA工作流程,以揭示透明細(xì)胞癌(ccRCC)和相鄰正常組織之間失調(diào)的蛋白質(zhì),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)436個(gè)蛋白質(zhì)在ccRCC組織中失調(diào),同時(shí)表明這些失調(diào)的蛋白質(zhì)可能是ccRCC診斷的潛在生物標(biāo)志物。

圖8 在Thermo Fisher Scientific Orbitrap Fusion Tribrid質(zhì)譜儀上采用DIA/PRM技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行分析[73]Fig.8 Analysis of the experimental group and the control group by DIA/PRM technologyon the Thermo Fisher Scientific Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer[73]

2.4 SWATH技術(shù)

SWATH是一種靶向DIA技術(shù),其原理是將整個(gè)質(zhì)譜掃描范圍分割成多個(gè)區(qū)段,通過超高速掃描獲得掃描范圍內(nèi)全部離子的所有碎片信息。本質(zhì)上,MRM和PRM以前體離子為目標(biāo),僅收集目標(biāo)離子碎片產(chǎn)物的信號(hào),而SWATH-MS可以收集所有前體離子的信號(hào),并通過提取目標(biāo)肽段產(chǎn)生的數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)靶向分析[75],其優(yōu)勢(shì)是降低了獲得的片段信號(hào)的復(fù)雜性、具有優(yōu)秀的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性,在識(shí)別低豐度蛋白質(zhì)時(shí)具有更高的靈敏度[76]。因此,SWATH技術(shù)在評(píng)估整個(gè)蛋白質(zhì)組變化、分析特定的翻譯后修飾(如磷酸化、糖基化等)以及建立蛋白-蛋白相互作用(PPI)動(dòng)態(tài)圖譜中有很好的表現(xiàn)[77]。但在使用SWATH-MS進(jìn)行定量分析時(shí),來(lái)自對(duì)照組的每個(gè)樣本在質(zhì)譜儀中單獨(dú)運(yùn)行期間的差異可能會(huì)影響生物標(biāo)志物的相對(duì)定量和鑒定;較大的掃描寬度導(dǎo)致數(shù)據(jù)和噪聲的復(fù)雜性增加、選擇性顯著降低,使得從復(fù)雜圖譜中提取靶向肽段仍具有挑戰(zhàn)性[78]。Chen等[79]運(yùn)用SWATH-MS成功量化前列腺癌組織樣本中的N-連接糖肽,以識(shí)別可能指示侵襲性前列腺癌的差異表達(dá)糖蛋白。Gao等[80]采用SWATH-MS方法對(duì)4 216個(gè)蛋白進(jìn)行定量,示于圖9,結(jié)果表明,HCC組織中有191個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào),147個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào),揭示了HCC中復(fù)雜的代謝過程,包括戊糖磷酸途徑的改變、絲氨酸、甘氨酸和肌氨酸的生物合成/代謝、糖酵解、糖質(zhì)新生、脂肪酸生物合成和脂肪酸β-氧化,為發(fā)現(xiàn)HCC新藥物靶點(diǎn)或診斷性生物標(biāo)志物提供了數(shù)據(jù)參考。

圖9 肝癌組織與非肝癌組織的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析[80]Fig.9 Quantitative proteomic analysis of HCC and non-HCC tissues[80]

3 結(jié)束語(yǔ)

對(duì)蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確定量有助于人們認(rèn)識(shí)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,對(duì)惡性腫瘤的早期檢測(cè)、良惡鑒別等具有十分重要的意義。近年來(lái),生物質(zhì)譜的快速發(fā)展極大推動(dòng)了蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物的研究進(jìn)程。質(zhì)譜技術(shù)在分辨率、質(zhì)量精度和測(cè)序速度方面的發(fā)展為快速準(zhǔn)確分析癌癥蛋白質(zhì)組提供了可能。但生物樣品的高度復(fù)雜性使蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物的準(zhǔn)確定量存在很多困難,在臨床中大范圍地應(yīng)用LC-MS技術(shù)定量分析蛋白質(zhì)類腫瘤標(biāo)志物還有待深入推進(jìn)。開發(fā)高效快速的前處理方法及準(zhǔn)確可靠的質(zhì)譜掃描策略,從而發(fā)現(xiàn)更高靈敏度和特異性的腫瘤標(biāo)志物,是推進(jìn)惡性腫瘤早期檢測(cè)以及制定個(gè)性化治療方案的基礎(chǔ)。隨著儀器自動(dòng)化技術(shù)的不斷成熟,以癥狀為導(dǎo)向的診療方法將逐步向早期篩查和精準(zhǔn)醫(yī)療轉(zhuǎn)變,為惡性腫瘤患者提供新的生機(jī)。

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