李靜 楊琴 張雪峰 楊吉明 唐丹丹

肺泡上皮細(xì)胞是肺臟結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)，其炎性反應(yīng)和凋亡在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，抑制肺泡上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)和凋亡對(duì)急性肺損傷的治療尤為重要。藍(lán)莓又被稱為藍(lán)漿果、越桔等，除富含多糖、氨基酸、維生素和膳食纖維等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，還富含花色苷。藍(lán)莓花色苷是一種天然的多酚類物質(zhì)，具有抗氧化[1]、抑菌[2]、抗腫瘤[3]等生物活性。研究顯示，藍(lán)莓花色苷可通過(guò)降低對(duì)H2O2引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕H2O2所致血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷[4]；藍(lán)莓花色苷可降低腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中炎性因子TNF-α、IL-1和IL-6的表達(dá)，降低大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷發(fā)揮較好的保護(hù)作用[5]。然而，藍(lán)莓花色苷能否影響肺上皮細(xì)胞損傷還未知。miR-141是一種微小RNA(miRNA)，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激等生理或病理過(guò)程，在腫瘤[6]、腸炎[7]、糖尿病腎病[8]等多種疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用。有報(bào)道稱，miR-141在肺炎組織及脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5中表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-141可有效提高LPS誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞活力，并抑制細(xì)胞凋亡及IL-1β、IL-6和TNF-α炎性因子的表達(dá)，miR-141可作為肺炎治療的分子靶標(biāo)[9]。因此，本研究建立LPS誘導(dǎo)的人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B損傷模型，觀察了藍(lán)莓花色苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞炎性因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響及其能否通過(guò)調(diào)控miR-141發(fā)揮作用，以期為其用于急性肺損傷的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 BEAS-2B細(xì)胞系，武漢普諾賽生命科技有限公司；藍(lán)莓花色苷，陜西承乾生物科技有限公司；LPS，美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)液、Annexin V-FITC/PI試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶；胎牛血清(FBS)，杭州四季青；LipofectamineTM 2000試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)試劑盒，南京建成；miR-141模擬物(mimics)、模擬對(duì)照序列(miR-NC)、miR-141抑制劑(anti-miR-141)、抑制劑陰性對(duì)照序列(anti-miR-NC)和PCR引物，上海生工；兔抗人活化的半胱天冬酶9(cleaved-caspase9)、活化的半胱天冬酶3(cleaved-caspase3)抗體，中國(guó)Abcam公司；miRNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒，大連寶生物。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:在超凈工作臺(tái)內(nèi)復(fù)蘇BEAS-2B細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液于普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)期BEAS-2B細(xì)胞接種至6孔板中(5.0×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)12 h后，用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染miR-141 mimics、miR-NC、anti-miR-141、anti-miR-NC。轉(zhuǎn)染12 h后，換新培養(yǎng)液。再培養(yǎng)24 h，RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-141表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，并收集細(xì)胞備用。

1.2.2 細(xì)胞分組處理:未轉(zhuǎn)染的BEAS-2B細(xì)胞接種至6孔板中(5.0×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液，分為對(duì)照組(Con組)、LPS組、LPS+藍(lán)莓花色苷低劑量組、LPS+藍(lán)莓花色苷中劑量組和LPS+藍(lán)莓花色苷高劑量組，其中Con組細(xì)胞加常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，LPS組細(xì)胞加含10 μg/ml[10]LPS的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，LPS+藍(lán)莓花色苷低劑量組、LPS+藍(lán)莓花色苷中劑量組和LPS+藍(lán)莓花色苷高劑量組細(xì)胞分別加含10、20、40 μg/ml[4]藍(lán)莓花色苷與10 μg/ml LPS的培養(yǎng)液共同培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染miR-141 mimics、miR-NC、anti-miR-141、anti-miR-NC的BEAS-2B細(xì)胞均接種至6孔板中(5.0×105個(gè)/孔)，培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液。其中轉(zhuǎn)染miR-141 mimics、miR-NC的細(xì)胞處理同LPS組，并記為L(zhǎng)PS+miR-141組、LPS+miR-NC組。轉(zhuǎn)染anti-miR-141、anti-miR-NC的細(xì)胞處理同LPS+藍(lán)莓花色苷高劑量組，記為L(zhǎng)PS+藍(lán)莓花色苷+anti-miR-141組、LPS+藍(lán)莓花色苷+anti-miR-NC組。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-6和IL-1β水平:將收集的各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液離心(3 500 r/min、5 min)，取上清，分別參照IL-6和IL-1β試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)上清中其表達(dá)量。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:將收集的各組細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液清洗2次，加500 μl結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞。然后利用Annexin V-FITC/PI試劑盒，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白表達(dá):將收集的各組細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液清洗2次，RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白。經(jīng)BCA法定量、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，分別于cleaved-caspase9(1∶1 000)、cleaved-caspase3(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 500)一抗孵育液中4℃過(guò)夜。洗膜后，再于山羊抗兔二抗(1∶3 000)孵育液中，室溫孵育1 h。加化學(xué)發(fā)光試劑避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析cleaved-caspase9、cleaved-caspase3相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

1.2.6 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-141表達(dá):將收集的各組細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液清洗2次，miRNA抽提試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95℃5 min，95℃10 s，60℃45 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-141上游5’-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3’，下游5’-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3’；內(nèi)參U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。2-△△Ct法計(jì)算miR-141相對(duì)于U6的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 藍(lán)莓花色苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，肺上皮細(xì)胞經(jīng)10 μg/ml的LPS誘導(dǎo)后，IL-6和IL-1β表達(dá)升高(P<0.05)；藍(lán)莓花色苷降低了LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞表達(dá)IL-6和IL-1β(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見(jiàn)表1。

表1 藍(lán)莓花色苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響

2.2 藍(lán)莓花色苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，肺上皮細(xì)胞經(jīng)10 μg/ml的LPS誘導(dǎo)后，凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase9和cleaved-caspase3的表達(dá)升高(P<0.05)；藍(lán)莓花色苷降低了LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved-caspase9和cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 藍(lán)莓花色苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡的影響；A 凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

表2 藍(lán)莓花色苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡的影響

2.3 藍(lán)莓花色苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞miR-141表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，肺上皮細(xì)胞經(jīng)10 μg/ml的LPS誘導(dǎo)后，細(xì)胞中miR-141表達(dá)降低(P<0.05)；藍(lán)莓花色苷促進(jìn)了LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞中miR-141的表達(dá)(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見(jiàn)表3。

表3 藍(lán)莓花色苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞miR-141表達(dá)的影響

2.4 上調(diào)miR-141表達(dá)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞炎癥損傷的影響 轉(zhuǎn)染miR-141 mimics的肺上皮細(xì)胞中miR-141表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞(2.75±0.26比1.00±0.00，t=20.192，P<0.05)，表明上調(diào)miR-141的肺上皮細(xì)胞構(gòu)建成功；上調(diào)miR-141降低了LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞表達(dá)IL-6和IL-1β(P<0.05)，且降低了細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved-caspase9和cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表4。

表4 上調(diào)miR-141表達(dá)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞炎癥損傷的影響

圖2 上調(diào)miR-141表達(dá)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡的影響；A 凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

2.5 干擾miR-141表達(dá)降低藍(lán)莓花色苷(40 μg/ml)對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞炎癥損傷的作用 轉(zhuǎn)染anti-miR-141 的肺上皮細(xì)胞中miR-141表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞(0.32±0.03比1.00±0.00，t=68.000，P<0.05)，表明干擾miR-141吧表達(dá)的肺上皮細(xì)胞構(gòu)建成功；與LPS+藍(lán)莓花色苷+anti-miR-NC組比較，LPS+藍(lán)莓花色苷+anti-miR-141組肺上皮細(xì)胞中IL-6和IL-1β的表達(dá)升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved-caspase9和cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表5。

圖3 干擾miR-141逆轉(zhuǎn)藍(lán)莓花色苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡的作用；A 凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

表5 干擾miR-141逆轉(zhuǎn)藍(lán)莓花色苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞炎癥損傷的作用

3 討論

急性肺損傷是常見(jiàn)的炎癥性肺疾病，其病理改變主要表現(xiàn)為肺實(shí)質(zhì)炎性反應(yīng)而導(dǎo)致的彌漫性肺泡上皮和肺微血管內(nèi)皮嚴(yán)重?fù)p傷，減輕肺泡上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)和凋亡可有效緩解急性肺損傷的發(fā)展進(jìn)程[11]。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是導(dǎo)致急性肺損傷在內(nèi)的嚴(yán)重炎性疾病的誘導(dǎo)因素之一，常被用作體外建立肺泡上皮細(xì)胞損傷的誘導(dǎo)劑[12]。本研究結(jié)果顯示，肺泡上皮細(xì)胞BEAS-2B經(jīng)10 μg/ml的LPS誘導(dǎo)24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎性因子IL-6和IL-1β的表達(dá)明顯升高，且細(xì)胞凋亡率升高，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果[13]一致，表明LPS誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞產(chǎn)生了炎性反應(yīng)和凋亡，BEAS-2B細(xì)胞損傷模型建立成功。

藍(lán)莓花色苷作為藍(lán)莓的主要營(yíng)養(yǎng)成分，還具有多種藥理活性。研究顯示，藍(lán)莓花色苷可改善阿霉素誘導(dǎo)心衰大鼠心功能[14]；藍(lán)莓花色苷可通過(guò)清除自由基，抑制細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，有效降低視網(wǎng)膜的細(xì)胞光損傷[15]。本研究結(jié)果顯示，不同劑量(10、20、40 μg/ml)的藍(lán)莓花色苷降低了LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6和IL-1β水平，提示其可抑制LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)。過(guò)度的炎性反應(yīng)可進(jìn)一步刺激細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡受多種基因分子和信號(hào)通路的調(diào)控，其中caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。caspase9處于caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的首端，其被活化后向下游傳遞凋亡信號(hào)；caspase3處于caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的核心地位，其在受到上游凋亡信號(hào)的刺激后被活化，進(jìn)而執(zhí)行細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，藍(lán)莓花色苷可降低LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴性，提示其可能通過(guò)抑制caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)減少LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡。

miRNA是一類小分子非編碼RNA，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等生命活動(dòng)，可作為多種疾病的治療靶點(diǎn)。研究顯示，miR-141在LPS誘導(dǎo)的WI-38細(xì)胞炎癥損傷模型中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的WI-38細(xì)胞活力并降低細(xì)胞中促炎因子的表達(dá)，減輕細(xì)胞炎癥損傷，miR-141有可能成為嬰幼兒肺炎治療的分子靶點(diǎn)[17]；miR-141在缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-141可提高H/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率及氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕H/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷[18]；miR-141可通過(guò)抑制HDAC6介導(dǎo)的IkBα-NF-κB信號(hào)通路減少百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺組織細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，miR-141可作為保護(hù)大鼠肺組織免受百草枯損傷的分子靶點(diǎn)[19]。因此，本研究推測(cè)miR-141也可能參與肺泡上皮細(xì)胞損傷。

本研究結(jié)果顯示，肺上皮細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，細(xì)胞中miR-141表達(dá)降低，而過(guò)表達(dá)miR-141可降低LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6和IL-1β水平，并降低細(xì)胞中凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase9和cleaved-caspase3的表達(dá)，提示過(guò)表達(dá)miR-141可抑制LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，保護(hù)肺上皮細(xì)胞免受LPS損傷，miR-141有可能成為急性肺損傷治療的分子靶點(diǎn)。本文結(jié)果還顯示，藍(lán)莓花色苷可呈劑量依賴性促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞中miR-141的表達(dá)，而干擾其表達(dá)則降低藍(lán)莓花色苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)及凋亡的抑制作用，進(jìn)一步提示藍(lán)莓花色苷可能通過(guò)上調(diào)miR-141表達(dá)來(lái)抑制LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)及凋亡。

綜上所述，一定劑量的藍(lán)莓花色苷可有效抑制LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡，其可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中miR-141的表達(dá)發(fā)揮作用，具有治療急性肺損傷的潛在價(jià)值。