楊龍飛，田偉，鄭倩※，姜濤※

（1.石家莊市中醫(yī)院，河北 石家莊 050051；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，河北 石家莊 050051）

酸棗[Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa (Bunge)Huex H.F.Chou]是鼠李科屬灌木或小喬木植物，適應(yīng)性強、喜溫耐干旱，主要分布于我國北方的低山丘陵地區(qū)，如山西、陜西、河北、河南、遼寧和山東等省[1]。酸棗的根、葉、果肉和種子中含有大量的生物活性物質(zhì)，其中酸棗的種子俗稱“酸棗仁”，是我國大宗的中藥材。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》等記載酸棗仁具有鎮(zhèn)靜、催眠、安神、滋補、斂汗和保肝等功效，廣泛用于治療神經(jīng)衰弱、失眠和焦慮。研究顯示，酸棗仁中的主要生物活性成分之一是黃酮類化合物，具有鎮(zhèn)靜、催眠和寧心等功效[2]。至今已從酸棗仁中分離鑒定出27 個黃酮類化合物，其中大部分黃酮類成分為黃酮碳苷類化合物[3]。酸棗仁藥理學(xué)及藥代動力學(xué)的研究也主要集中在黃酮類化合物，研究認為斯皮諾素類化合物是黃酮類化合物中的主要活性成分[4]。在2010 年版《中國藥典》中斯皮諾素被作為酸棗仁中黃酮類化合物的檢測指標(biāo)[5]。Li等[6]通過大鼠實驗研究認為斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素具有鎮(zhèn)靜催眠作用。Wang 等[7]研究顯示斯皮諾素能夠延長由戊巴比妥所誘導(dǎo)的睡眠時間，提高睡眠質(zhì)量。

酸棗仁中含有化合物種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，已有研究報道利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）、高效液相色譜 蒸發(fā)光散射檢測法（HPLC-ELSD）、高效液相色譜 質(zhì)譜（HPLCMS/MS）對酸棗葉[8]、酸棗果[9]和酸棗仁[10]中的酸棗皂苷、斯皮諾素和熊果酸等代謝物成分進行了檢測，但由于這些方法檢測周期長、檢測化合物單一等特性，不能全面、準(zhǔn)確地反應(yīng)酸棗代謝物的成分[11]。目前超高液相色譜法（ultra performance liquid chromatography,UPLC）已成為藥用植物代謝物成分快速檢測、分離及鑒定的強有力手段[12]，與傳統(tǒng)的HPLC 技術(shù)相比UPLC 具有更高的分離度、樣品通量和靈敏度，極大提高了代謝物的檢測效率[13]。UPLC 技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到太子參[14]、刺果番荔枝[15]、雷公藤[16]和連翹[17]等藥用植物代謝物的化合物分析。綜上所述，本研究基于超高效液相色譜 電噴霧離子源 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC/ESIQ TRAP-MS/MS）對酸棗仁中的黃酮類化合物進行分離鑒定分析，有助于酸棗仁中黃酮類化合物的研究，對酸棗仁中的藥效成分和質(zhì)量控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

2021 年8 月20 日在河北省石家莊市贊皇縣采集新鮮酸棗果，經(jīng)河北省農(nóng)林科學(xué)院藥用植物研究中心鑒定為鼠李科棗屬植物酸棗果實。酸棗果去肉、破殼獲取酸棗仁，用于酸棗仁黃酮類化合物的檢測。

1.2 儀器與試劑

超高效液相色譜（UPLC,Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A），串聯(lián)質(zhì)譜（Tandem mass spectrometry,MS/MS）（AppliedBiosystems4500QTRAP），凍干機（Scientz-100F），研磨儀（MM 400, Retsch），萬分之一分析天平（BSA224S-CW），冷凍高速離心機（Eppendorf 5810R）。甲醇（色譜純，Merck 公司）、乙腈（色譜純，Merck 公司）和乙醇（色譜純，Merck 公司），標(biāo)準(zhǔn)品二甲基亞砜（色譜純，Sigma 公司）。

1.3 材料的制備

酸棗仁放置于凍干機（Scientz-100F）中真空冷凍干燥；利用研磨儀（MM400，Retsch）研磨（30Hz，1.5min）至粉末狀；稱取100 mg 的粉末，加70% 甲醇1.2 mL提?。蝗芙夂蟮臉悠? ℃冰箱過夜，其間渦旋6 次，提高提取率；離心（轉(zhuǎn)速10 000 r min-1，10 min）后，吸取上清，用微孔濾膜（0.22m）過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：WatersACQUITYUPLCHSST3C18，1.8m，2.1 mm 100 mm；流動相：A 相為0.04%乙酸水溶液，B 相為乙腈（含0.04%乙酸）；洗脫梯度：0 min B 相比例為5%，10.00 min 內(nèi)B 相比例線性增加到95%，并維持1 min，11.00~11.10 min，B 相比例降為5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL min-1；柱溫40℃；進樣量4L。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization, ESI）溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5500V，簾氣（curtaingas,CUR）30psi，碰撞誘導(dǎo)電離（collision-activated dissociation, CAD）參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿（QQQ）中，每個離子對是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（declustering potential,DP）和碰撞能（collision energy,CE）進行掃描檢測[18]。

1.6 代謝物定性定量鑒定

基于MWDB 數(shù)據(jù)庫（metware database），根據(jù)二級譜信息進行物質(zhì)定性，分析時去除同位素信號，含K+、Na+、NH4+和CH3COO-的重復(fù)信號，以及本身是其他更大分子量物質(zhì)的碎片離子的重復(fù)信號。代謝物定量是利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring, MRM）分析完成。MRM 模式中，四級桿首先篩選目標(biāo)物質(zhì)的前體離子（母離子），排除掉其他分子量物質(zhì)對應(yīng)的離子以初步排除干擾；前體離子經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后斷裂形成很多碎片離子，碎片離子再通過三重四級桿過濾選擇出所需要的一個特征碎片離子，排除非目標(biāo)離子干擾，使定量更為精確，重復(fù)性更好。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進行積分校正[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗仁UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS 分析

采用UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS 技術(shù)對酸棗仁黃酮類化合物進行鑒定，優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件對酸棗仁樣品進行分析，圖1 所示為酸棗仁UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS 的正、負總離子流（Total ions current,TIC），在正、負離子檢測模式下都有明顯的檢測信號，利用軟件Analyst1.6.3 對總離子流進行處理，并對主要峰進行標(biāo)記。如圖1 所示酸棗仁正、負總離子流均獲得良好的分離效果和離子化效率，因此，可以結(jié)合正、負總離子流對酸棗仁黃酮化合物進行鑒定分析。

圖1 酸棗仁UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS 的正（A）、負（B）總離子流色譜圖Fig.1 Positive(A)and negative(B)total ion flow chromatograms of Ziziphi spinosae Semen in UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS

2.2 酸棗仁黃酮類化合物鑒定

基于MWDB 代謝數(shù)據(jù)庫，對酸棗仁的黃酮類代謝物進行了質(zhì)譜定性定量分析。圖2 為MRM 模式下采集的代謝物多峰檢測圖，展示了酸棗仁中能檢測到的黃酮類化合物，其中每個不同顏色的質(zhì)譜峰代表檢測到的一個化合物。通過三重四級桿質(zhì)譜法、對照圖譜和相關(guān)文獻，對篩選出的化合物進行分子量和分子式分析，最終鑒定出83 個酸棗仁黃酮類化合物。對83 個酸棗仁黃酮類化合物進行結(jié)構(gòu)分類分析，如表1 所示83 個黃酮類化合物共分為9 類，包括3 個查爾酮、5個二氫黃酮、2 個二氫黃酮醇、5 個花青素、18 個黃酮、22 個黃酮碳糖苷、14 個黃酮醇、9 個黃烷醇和5 個異黃酮化合物。

表1 酸棗仁中所鑒定的黃酮類化合物Table 1 Flavonoids identified in Ziziphi spinosae Semen

圖2 MRM 代謝物檢測多峰圖Fig.2 Multi-peak map of MRM metabolite detection

續(xù)表

2.3 酸棗黃酮類化合物分析

本研究對獲得的83 個酸棗仁黃酮類化合物進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示黃酮碳糖苷類化合物是酸棗仁中黃酮類化合物結(jié)構(gòu)分類中數(shù)量最多的，其相對含量最高，其次是黃酮類和黃酮醇類化合物，而二氫黃酮醇類化合物數(shù)量最少，僅獲得2 個化合物，分別為短葉松素和香橙素。斯皮諾素屬于黃酮碳糖苷類化合物，是酸棗仁中的主要藥效成分，本研究共檢測到7 種斯皮諾素類化合物（見表1），其中6'''-阿魏酰斯皮諾素是酸棗仁中黃酮類化合物含量最高的物質(zhì)。

2.4 黃酮類化合物結(jié)構(gòu)解析

本研究共獲得9 類黃酮類化合物，每一類選取一個化合物進行結(jié)構(gòu)解析。

2.4.1 查爾酮類化合物根皮素的結(jié)構(gòu)解析 根皮素母離子峰[M-H]-為m/z=273.07，在能量碰撞下，由分子離子峰m/z=273.07 裂解產(chǎn)生的碎片離子為m/z=167.03，151.00，125.02，123.04 和119.04。

圖3 根皮素的裂解途徑Fig.3 Fragmentation mechanism of phloretin

2.4.2 二氫黃酮類化合物柚皮素結(jié)構(gòu)解析 柚皮素為二氫黃酮，母離子峰[M-H]-為m/z=271.06，在能量碰撞下，由分子離子峰m/z=271.06 裂解產(chǎn)生的碎片離子為m/z=151.00，還產(chǎn)生了m/z=119.05 的碎片離子。

圖4 柚皮素的裂解途徑Fig.4 Fragmentation mechanism of naringin

2.4.3 二氫黃酮醇類化合物香橙素結(jié)構(gòu)解析 香橙素為二氫黃酮醇，母離子峰[M+H]+為m/z=289.06，在能量碰撞下，由分子離子峰m/z=289.06 的3 號位脫去一分子H2O 得到m/z = 271.06 [M+H-H2O]+，由分子離子峰m/z = 271.06 [M+H-H2O]+再脫去一分子CO得到m/z=243.06[M+H-H2O-CO]+。

圖5 香橙素裂解途徑Fig.5 Fragmentation mechanism of dihydrokaempferol

2.4.4 花青素類化合物矢車菊素-3-O-葡萄糖苷結(jié)構(gòu)解析 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷為花青素，在正離子模式下m/z=449.19 脫去糖苷，獲得苷元m/z=287.06。

圖6 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷裂解途徑Fig.6 Fragmentation mechanism of cyanidin 3-O-glucoside

2.4.5 黃酮類化合物結(jié)構(gòu)解析 木犀草苷為黃酮，母離子峰[M+H]+為m/z=449.10，在能量碰撞下，由分子離子峰m/z=449.10脫去葡萄糖苷獲得苷元m/z=287.05。

圖7 木犀草苷裂解途徑Fig.7 Fragmentation mechanism of cynaroside

2.4.6 黃酮醇類化合物蘆丁結(jié)構(gòu)解析 蘆丁為黃酮醇，母離子峰[M+H]+為m/z = 611.15，在能量碰撞下，由分子離子峰m/z=611.15脫糖獲得苷元m/z=303.04。

圖8 蘆丁裂解途徑Fig.8 Fragmentation mechanism of rutin

2.4.7 黃酮碳糖苷類化合物斯皮諾素的結(jié)構(gòu)解析 斯皮諾素為黃酮碳糖苷，母離子峰[M+H]+為m/z=609.18，在能量碰撞下，由分子離子峰m/z=609.18 脫一分子糖獲得m/z=447.12，后脫羥基獲得m/z=429.11，由m/z =429.11 獲得m/z=351.08、327.08。由分子離子峰m/z=609.18 脫兩分子糖獲得m/z=285.07。

圖9 斯皮諾素裂解途徑Fig.9 Fragmentation mechanism of spinosin

2.4.8 黃烷醇類化合物兒茶素結(jié)構(gòu)解析 兒茶素為黃烷醇，母離子峰[M-H]-為m/z=289.08，在能量碰撞下，由分子離子峰m/z=289.08 脫一分子水后再脫C2H2 獲得m/z=245.09；B 環(huán)1'，6'鍵斷裂后生成m/z=205.05，1'，4'鍵斷裂后生成m/z = 203.07；C 環(huán)1，3 鍵斷裂生成m/z =151.04 和m/z=137.03；C 環(huán)1，4 鍵斷裂生成m/z=125.03；連接B 環(huán)和C 環(huán)的鍵斷裂生成m/z=179.04和m/z=109.03，m/z=179.04 脫水形成m/z=161.07。

圖10 兒茶素裂解途徑Fig.10 Fragmentation mechanism of catechin

2.4.9 異黃酮類化合物黃豆黃苷結(jié)構(gòu)解析 黃豆黃苷為異黃酮苷，母離子峰[M+H]+為m/z=447.12，脫去糖苷獲得苷元m/z=285.07。

圖11 黃豆黃苷裂解途徑Fig.11 Fragmentation mechanism of glycitin

3 討論

酸棗是中國衛(wèi)健委頒布的第一批既是食品又是中藥材的藥用植物之一，具有較高的經(jīng)濟價值和藥用價值。根據(jù)2020 年《中國藥典》規(guī)定酸棗的主要藥用部位為酸棗仁，來源于酸棗干燥成熟種子，功能主治補肝、寧心、斂汗和生津，用于虛煩不眠，驚悸多夢，體虛多汗，津傷口渴[20]?！吨腥A本草》記載酸棗仁含有皂苷、有機酸、生物堿、黃酮、三萜、甾醇、多種氨基酸及微量元素等活性成分[21]。酸棗仁藥效成分研究表明酸棗黃酮和酸棗皂苷是酸棗仁中的主要活性成分，具有鎮(zhèn)靜催眠作用[22]。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，酸棗黃酮類化合物斯皮諾素參與了GABA 和5-HT 通路，提高了大鼠的睡眠總時間。Cao 等[24]研究表明酸棗皂苷作用于5-HT通路，能夠明顯增強戊巴比妥的催眠作用，增加小鼠的睡眠總量。Wang 等[25]研究顯示酸棗仁斯皮諾素可能是突觸后5-HT1A 受體的拮抗劑，提高戊巴比妥治療大鼠的總睡眠、非快速動眼期睡眠（NREM）和快速動眼期睡眠（REM）時間。

最近幾年隨著代謝組學(xué)的發(fā)展，UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS技術(shù)因具有靈敏度和通量高、分離速度快、覆蓋范圍廣等優(yōu)點，在植物代謝物鑒定和分析方面應(yīng)用較多[26]，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于番茄[27]、草莓[28]和蘆筍[29]等植物的代謝物分析。國內(nèi)外圍繞酸棗仁也開展了廣泛的代謝學(xué)研究，李強等[30]利用代謝組學(xué)對酸棗仁水提物鑒定和推斷出25 個化合物，包括12 個黃酮化合物、8 個三萜皂苷、2 個脂肪酸類和3 個生物堿。毛怡寧等[31]利用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS 技術(shù)從酸棗仁甲醇提取物中鑒定出28 個化合物，包括21 個黃酮類化合物、5 個皂苷類化合物和2 個三萜類化合物。劉佳星等[32]基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)從酸棗仁湯顆粒中鑒定出41 個來源于酸棗仁的化合物，包括28 個黃酮類化合物、7 個生物堿類化合物和6 個三萜類化合物。本研究首次采用UPLC/ESI-Q TRAP-MS/MS技術(shù)對酸棗仁甲醇提取物中的黃酮類化合物進行了快速、準(zhǔn)確地定性定量分析，共鑒定出83 個黃酮類化合物，主要為黃酮碳糖苷類化合物，其中包括7 個斯皮諾素類衍生物。本研究利用UPLC/ESI-Q TRAPMS/MS技術(shù)能夠全面分離、鑒定分析酸棗仁中的黃酮類化合物，可極大豐富酸棗仁天然化合物成分數(shù)據(jù)庫，為酸棗仁藥效成分研究提供參考依據(jù)。