梁少東，伍國怡，張 銓

(北海市食品藥品檢驗所，廣西 北海 536000)

吡唑醚菌酯、嘧菌酯屬于甲氧基丙烯酸類殺菌劑，其主要作用于真菌的線粒體呼吸，從而抑制真菌生長或殺死。因其具有高效、低毒的特點，其使用量在全球逐漸增長[1]，在我國茶葉種植中也有使用。我國對茶葉中的吡唑醚菌酯最大允許殘留量為10 mg/kg，但對茶葉中嘧菌酯的最大允許殘留量卻沒有規(guī)定[2]。日本肯定列表制度中嘧菌酯在茶葉中的最大允許殘留量為10 mg/kg，歐盟對茶葉中的嘧菌酯最大允許殘留量為0.1 mg/kg。目前我國氣質(zhì)聯(lián)用法檢測茶葉的國標中[3-4]，其檢測的農(nóng)藥并沒有包括吡唑醚菌酯和嘧菌酯。因此，本研究在借鑒檢測甲氧基丙烯酸類殺菌劑[5-9]以及茶葉中檢測農(nóng)殘文獻方法[10-13]的基礎(chǔ)上，建立了一種利用QuEChERS凈化技術(shù)，快速測定茶葉中的吡唑醚菌酯和嘧菌酯的方法。

1 實 驗

1.1 儀器、試劑與材料

TQ-8040NX氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司；XSE205電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；ST40R高速冷凍離心機，Thermo scientific。

乙腈，美國Fisher公司；乙酸，上海安譜公司；吡唑醚菌酯(100 μg/mL，1.2 mL)、嘧菌酯(100 μg/mL，1.2 mL)標準物質(zhì)，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；水為娃哈哈純凈水。

樣品來源市場抽檢茶葉15份。

1.2 標準溶液的配制

取吡唑醚菌酯、嘧菌酯標準物質(zhì)各1.0 mL置于10 mL棕色容量瓶中，乙腈定容至刻度，配成濃度為10 μg/mL的標準儲備液；取適量吡唑醚菌酯、嘧菌酯標準混合液，用乙腈稀釋，配制成0.01,0.02,0.05,0.10,0.20 μg/mL系列濃度。取1 mL空白基質(zhì)溶液氮氣吹干，加入1 mL相應(yīng)濃度的混合標準溶液復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜。基質(zhì)混合標準溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品處理

稱取2.00 g試樣于50 mL塑料離心管中，加10 mL水渦旋混勻，靜置10 min。加入10 mL乙腈-乙酸(99:1)，6 g無水硫酸鎂、1.5 g醋酸鈉及1顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩1 min，4200 r/min離心5 min。吸取8 mL上清液加到含1.2 g硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18及400 mg GCB的塑料離心管中，渦旋混勻1 min。4200 r/min離心5 min，取上清液0.22 μm過微孔濾膜，上GC-MS/MS測試。

1.4 色譜條件

(1)SH-Rxi-5Sil MS 色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣口溫度280 ℃；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min;恒流模式；不分流進樣；進樣量1 μL。色譜柱升溫溫度：初始溫度100 ℃，以30 ℃/min升至200 ℃，10 ℃/min升至300 ℃，保持10 min。

(2)質(zhì)譜條件:將吡唑醚菌酯，嘧菌酯進行全掃描，確定母離子，再給予一定的碰撞能量，掃描二級子離子，選取豐度較高的2個子離子分別為定量離子對和定性離子對，最后以MRM模式優(yōu)化最佳碰撞能量。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)及保留時間見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

(3)吡唑醚菌酯、嘧菌酯基質(zhì)標準溶液色譜圖見圖1。

圖1 吡唑醚菌酯、嘧菌酯基質(zhì)標準溶液色譜圖(0.10 μg /mL)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取凈化方法

2.1.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)的定義：“樣品中除目標分析物以外的其他成分對待測物測定值的影響”。基質(zhì)效應(yīng)可以是基質(zhì)抑制，也可以是基質(zhì)增強。在GC-MS/MS中，由于基質(zhì)的影響，容易產(chǎn)生基質(zhì)增強效應(yīng)[14]。茶葉基質(zhì)復(fù)雜，增加凈化步驟容易造成待測農(nóng)藥的損失。因此本實驗采用茶葉空白樣品提取液，配制基質(zhì)曲線，外標法定量。

2.1.2 樣品提取溶液

茶葉中農(nóng)藥殘留的提取，提取液種類較多，主要有乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正己烷等。乙腈作為提取劑時，相對其它溶劑，基質(zhì)本底比較干凈，凈化后的溶液也較少色素殘留。而國標提取處理中，有用乙腈直接提取，也有用乙腈-乙酸(99:1)直接提取。因此，本文主要研究乙腈直接提取與乙腈-乙酸(99:1)提取對回收率的影響作比較。經(jīng)實驗表明，吡唑嘧菌酯、嘧菌酯在乙腈和乙腈-乙酸(99:1)兩種提取體系中，兩種農(nóng)藥總體回收率都不高，尤其吡唑醚菌酯回收率不到20%，嘧菌酯回收率在65%左右。但吡唑嘧菌酯在乙腈-乙酸(99:1)體系中回收率比乙腈體系中回收率高，嘧菌酯回收率相差不大，故提取溶劑選擇了乙腈-乙酸(99:1)。

2.1.3 樣品加水浸泡時間

現(xiàn)行國標中對茶葉前處理過程中，有選擇加水浸泡乙腈提取，也有不加水浸泡乙腈直接提取。因此，本文僅就吡唑醚菌酯、嘧菌酯是否加水浸泡，以及加水浸泡時間提取對回收率的影響作研究。經(jīng)實驗表明，加水浸泡后，回收率比不加水回收率明顯要高。尤其是吡唑醚菌酯加水浸泡后，回收率明顯提高。故本研究前處理過程選擇加水浸泡后乙腈-乙酸(99:1)提取。為選擇最佳的浸泡時間，本實驗將茶葉樣品在同樣的蒸餾水浸泡，分別在10,20,30 min作檢測。比較發(fā)現(xiàn)，浸泡10 min，20 min，30 min提取，回收率沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。綜合提取時間和回收率的影響，故選擇樣品在提取前加水浸泡10 min。

因為茶葉成品通常是干樣，加水浸泡可以使茶葉充分潤濕，加大了樣品與水的接觸面積，增加提取溶劑乙腈的親和度，更加容易形成分層。乙腈加入醋酸，可以和乙酸鈉形成弱酸性緩沖體系，弱酸性提取對某些農(nóng)藥不容易造成分解，故最終前處理方法選擇樣品加水浸泡10 min后，乙腈-乙酸(99:1)提取。

2.2 方法的線性、檢出限、定量限、回收率和精密度

以濃度為橫坐標，定量離子對的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果顯示在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)，定量離子對的峰面積于質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均在0.997以上。以S/N=3計算檢出限，S/N=10計算定量限，結(jié)果見表2。在陰性茶葉中分別添加3個水平的待測物，每個水平平行測定6次，考察方法的回收率和精密度。結(jié)果顯示，方法回收率為75.2%～91.0%，RSD為2.12%～7.14%(n=6)。結(jié)果見表2。

表2 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限和定量限

表3 陰性茶葉樣品中加標回收率及相對標準偏差(RSD,n=6)

2.3 樣品監(jiān)測情況

在市區(qū)隨機抽取的15份茶葉中，有紅茶、綠茶、烏龍茶等。經(jīng)檢測，15份樣品中吡唑醚菌酯、嘧菌酯均沒有檢出。

3 結(jié) 論

本研究建立了QuEChERS-GC-MS/MS測定茶葉中的吡唑醚菌酯、嘧菌酯的分析方法。考察了茶葉提取溶劑和茶葉浸泡時間對測定結(jié)果的影響，線性，回收率，精密度均符合實驗要求。本方法前處理簡單，快速，可批量操作，可用于茶葉中吡唑醚菌酯、嘧菌酯殘留量快速篩查和檢測。